Cintica de Reacciones

Catalizadas por Enzimas


Las enzimas son biomoleculas que se comportan como
catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones
qumicas en los sistemas biolgicos.

Una enzima es una protena con una bien definida estructura
primaria y secundaria.

La estructura primaria est determinada por la secuencia de
los aminocidos, en tanto que la estructura secundaria tiene que
ver con el arreglo en el espacio, el cual depende en gran manera
de los puentes de hidrgeno.

stas biomolculas son estables y funcionan en condiciones
muy suaves, ambiente acuoso, bajas temperaturas y en muchas
ocasiones pH neutro.

La catlisis enzimtica es esencial para los organismos vivos,
ya que hace posible que en condiciones fisiolgicas tengan
lugar reacciones qumicas, las que en ausencia de catalizador
requeriran condiciones extremas de presin, temperatura o pH.

La actividad cataltica

depende de la integridad de
su conformacin proteica
nativa.

Si se desnaturaliza o
disocia en subunidades
pierde su actividad
En 1890s, Emil Fischer propuso un modelo de llave
cerradura para explicar la especificidad de las enzimas.

Muchas enzimas poseen estereo-especificidad, catalizan

reacciones de sustratos en una configuracin, pero no en otra.

Una enzima puede contener uno o ms sitios activos. El sitio
activo consiste solamente de unos cuantos residuos de
aminocidos y el resto de la protena se requiere para mantener su
integridad tridimensional.

Carboxipeptidasa A en la hidrlisis de uniones peptdicas

Grafica de la velocidad de una reaccin catalizada
por enzima vs. concentracin de sustrato

a[ S ]
v0 =
b + [S ]
Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas.
Cintica de Michaelis-Menten

E = enzima
S = sustrato,
ES = complejo enzima
k1 k2 sustrato
E + S ES P + E
k-1

Para derivar una expresin de velocidad. Michaelis and Menten

inicialmente asumieron que el paso lento es la formacin de P a
partir del complejo enzima-sustrato, ES. La formacin de ES, se
considerada como un proceso de equilibrio rpido.
d [ P]
v0 = = k 2 [ ES ]
dt 0
Cintica de Michaelis-Menten
k1 k2
E + S ES P + E
k-1

d [ P]
Cuando k-1 >> k2 v0 = = k 2 [ ES ]
dt 0
k 1 [ E ][ S ]
La constante de disociacin Ks = =
k1 [ ES ]
A un tiempo corto despus del comienzo de la reaccin, la concentracin
total de enzima [E]0 = [E] + [ES]

=
([ E ]0 [ ES ])[ S ]
[ ES ] =
[ E ]0 [ S ]
Ks K s + [S ]
[ ES ]

Sustituyendo en la expresin de velocidad:

d [ P] k 2 [ E ]0 [ S ]
v0 = =
dt 0 K s + [S ]
 Cintica de Michaelis- Menten

d [ P] a[ S ]
v0 = =
k 2 [ E ]0 [ S ] Tiene la forma de la v0 =
dt 0 K s + [S ] ecuacin de la hiprbola b + [S ]
a = k2[E] 0 y b = Ks

A baja concentracin de sustrato, [S] << Ks

d [ P] k2
v0 = = [ E ]0 [ S ] La velocidad depende de la [S]
dt 0 K s

Esta ley de velocidad corresponde a la porcin lineal de la grfica de v0 vs. [S]

A alta concentracin de sustrato, [S] >> Ks

d [ P]
v0 = = k 2 [ E ]0 = Vmax
dt 0
Bajo estas condiciones, todas las molculas de enzima estn en la forma del
complejo ES. Consecuentemente, la velocidad es de orden cero en [S]
Cintica de Michaelis-Menten

Cuando todas las molculas de enzima estn complejadas con el sustrato,

formando ES, la velocidad alcanza su mximo

v0 = k 2 [ E ]0 = Vmax

Representa la transicin de
baja a alta concentracin
Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas.
Cintica del estado estacionario.
k1 k2
E + S ES P + E
k-1
En 1925 Briggs y Haldane postularon que tan pronto como la enzima y el sustrato
se mezclaban, la concentracin del complejo ES alcanzaba un valor constante, de
tal manera que la aproximacin del estado estacionario poda aplicarse.
concentracin

tiempo
Cintica del estado estacionario
k1 k2
E + S ES P + E
k-1
d [ ES ]
= k1[ E ][ S ] k 1[ ES ] k 2 [ ES ] = 0
dt
[E]0 = [E] + [ES] [E] = [E]0 - [ES]

k1[ E ]0 [ S ]
[ ES ] =
k1[ S ] + k 1 + k 2

d [ P] k1k 2 [ E ]0 [ S ]
v0 = = k [ ES ] =
k1[ S ] + k 1 + k 2
2
dt 0

k 2 [ E ]0 [ S ]
v0 =
(k1 + k 2 ) / k1 + [ S ]
 Cintica de Reacciones Catalizadas por Enzimas
k1 k2
E + S ES P
k-1
Estado estacionario: Equilibrio:
k 2 [ E ]0 [ S ]
k 2 [ E ]0 [ S ] v0 =
v0 = K s + [S ]
(k1 + k 2 ) / k1 + [ S ] KM Ks
k 1
k 2 [ E ]0 [ S ] k 1 + k 2 Ks =
v0 = KM = k1
K M + [S ] k1

Este tratamiento define la velocidad mxima exactamente como el

modelo de Michaelis Menten, Vmax = k2[E]0

Vmax [ S ]
v0 =
K M + [S ]
 Cintica de Reacciones Catalizadas por Enzimas

Cuando la velocidad
inicial es la mitad del
mximo de la velocidad v0

Vmax V [S ]
v0 = = max
2 K M + [S ]

[ S ] + K M = 2[ S ]

KM = [S]
[S]

Vmax y KM pueden determinarse a

partir de la grfica de v0 vs [S]
Grfica Linewaver-Burk
Muchas veces resulta complicado localizar el valor de Vmax a altas
concentraciones de sustrato. Lineweaver y Burk, propusieron un
mtodo mas fcil que consiste en hacer una grfica de 1/v0 vs. 1/[S].

Vmax [ S ] 1
v0 =
K M + [S ] v0

KM
m=
1 KM 1 1 Vmax
= +
v0 Vmax [ S ] Vmax KM 1
Vmax
1
[S ]
Grfica Eadie-Hofstee
Eadie-Hofstee propusieron otro mtodo para graficar los datos
cinticos, ste mtodo consiste en multiplicar ambos lados de la
ecuacin del recproco por v0Vmax

1 KM 1 Vmax
= + v0
v0 Vmax [ S ] Vmax

vK m = KM
Vmax = 0 M + v0
[S ] Vmax
Rearreglando: KM

v0 K M
v0 = Vmax v0
[S ]
[S ]
 Significado de KM

KM Es un parmetro de afinidad con el sustrato. Mientras

mayor sea KM la unin es ms dbil.

Representa la concentracin de sustrato a la cual la mitad de los
sitios activos de la enzima estn ocupados por molculas de
sustrato.

El valor de KM vara considerablemente de una enzima a otra.

KM depende de la temperatura, la naturaleza del sustrato, pH,
fuerza inica. Por lo tanto su valor sirve para caracterizar sistema
enzima-sustrato en particular.

Para la mayora de las enzimas, KM est entre 10-1 M y 10-7 M
 Significado de Vmax y k2

Como su nombre lo indica, Vmax representa la mxima
velocidad que puede alcanzarse.

De acuerdo con la ecuacin, Vmax = k2[E]0, si se conoce la
concentracin de enzima, se puede determinar tambin la
constante k2.

k2 es una constante de primer orden y tiene unidades de
tiempo-1. En cintica enzimtica k2 se conoce tambin como
nmero de recambio de la enzima constante cataltica, kcat.

El nmero de recambio de una enzima se define como el
nmero mximo de molculas (o moles) de sustrato que se
converten a producto por unidad de tiempo. La mayora de las
enzimas tienen nmeros de recambio entre 1 y 105 s-1 en
condiciones fisiolgicas.
 Anhdrasa
Carbnica

CO2 + H2O HCO3 + H+

A 25 oC la anhdrasa carbnica tiene uno de los nmeros de
recambio mas altos que se conocen, k2 = 1106 s-1.

Esto indica que una solucin 110-6 M de enzima puede

catalizar la formacin de 1 M de HCO3 a partir de CO2
(producido por metabolismo) y H2O por segundo.

Vmax = k2[E]0
Vmax = (1106 s-1)(110-6 M) = 1 M s-1

En ausencia de la enzima, la constante de pseudo-primer orden

es 0.03 s-1
Ejercicio:
De Voe y Kistiakowsky (J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 274) estudiaron la
cintica de hidratacin de CO2 catalizada por la enzima anhidrasa carbnica
Anhdrasa
Carbnica

CO2 + H2O HCO3 + H+

En esta reaccin, el CO2 se convierte en in bicarbonato. El bicarbonato es
transportado por el flujo sanguneo y se vuelve a convertir en CO2 en los
pulmones, sta reaccin tambin est catalizada por la anhidrasa carbonica.
Cuando la concentracin de enzima es 2.3 nM y T = 0.5 oC se midieron las
siguientes velocidades iniciales.

Velocidad (M s-1) [CO2] / mM

2.78 10-5 1.25
Determina KM y k2 para la enzima a esta
5.00 10-5 2.5
temperatura
8.33 10-5 5.0
1.67 10-4 20.0
Respuesta: 1 KM 1
= +
v0 Vmax [ S ] Vmax
1
v0
1
= 4000 M 1 s Vmax = 2.5 10-4 M s-1
Vmax
KM
m= = 40 s
Vmax
( )
K M = (40 s )Vmax = (40 s ) 2.5 10 4 M s 1 = 10 mM
1
[S ]
Vmax = k2[E]0

Vmax 2.5 10 4 M s 1 5 1
k2 = = 9
= 1. 1 10 s
[ E ]0 2.3 10 M
 Inhibicin de las enzimas
La inhibicin de algunas enzimas por metabolitos especficos
constituye un elemento importante en la regulacin del
metabolismo intermediario.

Los tres tipos principales de inhibicin reversible de las

enzimas son:

Competitiva.

Acompetitiva

No competitiva

Los tres tipos de inhibicin se pueden distinguir

experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor en
la cintica de reaccin.
Inhibicin Competitiva.
Tanto el sustrato, S, como el inhibidor, I, compiten por el mismo
sitio activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con
la enzima para formar un complejo enzima-inhibidor, EI, anlogo al
complejo enzima sustrato.

k1 k2
Mecanismo: E + S ES P
k-1
+
I

KI El complejo EI no forma productos

EI

ES

EI
 Inhibicin Competitiva.
k1 k2
E + S ES P
+ k-1
I [ E ][ I ]
KI KI =
EI
[ EI ]
Aplicando la aproximacin del estado estacionario y considerando que la
concentracin total de enzima est dada por: [E]0 = [E] + [EI] + [ES]

Vmax [ S ]
v0 =
[I ]
K M 1 + + [ S ]
KI
[I ]
Excepto que el trmino KM est modificado por: 1 +
K I
Vmax [ S ]
sta ecuacin tiene la misma forma que la ec. de Michaelis-Menten v0 =
K M + [S ]
Inhibicin Competitiva. Ecuacin de Linewaver-Burk
Vmax [ S ]
v0 =
[I ]
K M 1 + + [ S ]
KI
[I]
1 KM [I ] 1 1
= 1 + + 1
v0 Vmax K I [ S ] Vmax v0
[I] = 0
m
1 KI
intercepto =
KM K I + [I ] 1
Vmax
1
[S ]
Inhibicin Competitiva. Ecuacin de Linewaver-Burk

K [I ]
m= M 1 +
Vmax KI m

KM KM [I ] KM
m= + m'=
Vmax Vmax K I Vmax K I
-KI KM
Vmax
[I]
 E + S ES P
+
I
Inhibicin Competitiva.

EI

Debido a que la interaccin del inhibidor con la enzima es

reversible:

Una disminucin en la concentracin del inhibidor

desplazar el equilibrio hacia la regeneracin de la enzima libre.

Dado que tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el

mismo sitio de unin, un aumento en la concentracin de
sustrato, provee una segunda manera de revertir la inhibicin
competitiva. Mientras mayor sea la concentracin de sustrato
mayor ser la cantidad de complejo ES.
Inhibicin No Competitiva.
Un inhibidor no competitivo no se une al sitio activo de la enzima.

ES ESI

EI ESI

k1 k2
Mecanismo: E + S ES P
k-1
+ +
I I EI y ESI no forman productos

KI KI

EI + S ESI
Inhibicin No Competitiva.
k1 k2
E + S ES P
k-1
+ +
I I

KI KI

EI + S ESI
Aplicando la aproximacin del estado estacionario y considerando que la
concentracin total de enzima est dada por: [E]0 = [E] + [EI] + [ES] + [ESI]

Vmax
[S ]
[I ]
1 +
KI
v0 =
K M + [S ]
Inhibicin No Competitiva. Ecuacin de Linewaver-Burk
Vmax
[S ] 1 KM [I ] 1 1 [I ]
[I ] = 1 + + 1 +
1 + v0 Vmax K I [ S ] Vmax KI
KI
v0 =
K M + [S ]

1 [I]
v0
1 [I ] [I] = 0
intercepto = 1 +
Vmax K I

1 1

KM [S ]
Inhibicin No Competitiva.

Debido a que el sustrato y el inhibidor no compiten por el

mismo sitio de unin, un incremento en la concentracin de
sustrato no puede revertir la unin porque tambin se
incrementara el nmero de complejos que contienen inhibidor
(ESI).

El efecto de un inhibidor no competitivo es reducir la

concentracin de complejos ES que pueden dar lugar a producto.

Puesto que Vmax = k2[E]0 y la concentracin de enzima total

disminuye debido a la formacin de ESI, se espera que un
inhibidor no competitivo disminuya la Vmax.
Inhibicin Acompetitiva.
Un inhibidor acompetitivo no se une a la enzima libre, sino al
complejo enzima-sustrato, ES. La unin del sustrato modifica la
estructura de la enzima, de tal manera que la unin del inhibidor es
posible.

La adicin de ms
sustrato no revierte el
E ES ESI efecto inhibitorio
k1 k2
Mecanismo: E + S ES P
k-1
+
I

KI ESI no forman producto

ESI
Inhibicin Acompetitiva.
k1 k2
E + S ES P
k-1
+
I

KI

ESI
Aplicando la aproximacin del estado estacionario y considerando que la
concentracin total de enzima est dada por: [E]0 = [E] + [ES] + [ESI]

Vmax
[S ]
[I ]
1 +
KI
v0 =
KM
+ [S ]
[I ]
1 +
KI
Inhibicin Acompetitiva. Ecuacin de Linewaver-Burk
Vmax
[S ]
[I ]
1 +
KI [I ]
v0 = 1 KM 1
= +
1
1 +
KM
+ [S ] v0 Vmax [ S ] Vmax KI
[I ]
1 +
KI
1
[I]
v0
1 [I ]
intercepto = 1 + [I] = 0
Vmax K I
KM
m=
Vmax

1 1

KM [S ]
 1 KM 1
Sin inhibicin = +
v0 Vmax [ S ] Vmax

Tipo de Inhibidor Efecto en la grfica Efecto cintico

Linewaver-Burk
Inhibicin competitiva La pendiente incrementa
Vmax no se modifica
[I ] 1
cuando [I] y la
1 KM
= 1 + +
1 y KM incrementa
ordenada se mantiene
v0 Vmax K I [ S ] Vmax con [I]
constante

Inhibicin no competitiva Ambas, la pendiente y la

Vmax disminuye
ordenada incrementan
1 KM [I ] 1 1 [I ] con [I] y KM no se
= 1 + + 1 + cuando [I]
v0 Vmax K I [ S ] Vmax KI modifica

Inhibicin acompetitiva La pendiente se

mantiene constante y la Vmax y KM ambas
1 KM 1 1 [I ] ordenada incrementa disminuyen
= + 1 +
v0 Vmax [ S ] Vmax KI cuando [I]
 Ejercicio:

Un qumico midi la velocidad inicial de una reaccin catalizada por enzima

tanto en ausencia como en presencia de inhibidor A, en un experimento
separado estudio el efecto del inhibidor B. En ambos casos la concentracin
del inhibidor fue 8.0 mM
[S]/ M vo / M s-1 vo / M s-1 vo / M s-1
No inhibidor Inhibidor A Inhibidor B
5.0 10-4 1.25 10-6 5.80 10-7 3.80 10-7
1.0 10-3 2.00 10-6 1.04 10-6 6.30 10-7
2.5 10-3 3.13 10-6 2.00 10-6 1.00 10-6
5.0 10-3 3.85 10-6 2.78 10-6 1.25 10-6
1.0 10-2 4.55 10-6 3.57 10-6 1.43 10-6

a) Determina los valores de KM y Vmax de la enzima. b) Para cada uno de los

inhibidores ( A y B ), determina el tipo de inhibicin y calcula el valor de KI
en cada caso.
 Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

La mayora de las enzimas tienen un pH

caracterstico al cual su actividad es mxima;
por encima o por debajo de ese pH la actividad
disminuye.

El pH ptimo de una enzima no es
necesariamente idntico al pH de su entorno
intracelular normal, el cual puede hallarse a su
vez en la pendiente ascendente o descendente
de la curva. Por eso la relacin pH-actividad de
una enzima puede constituir un factor en el
control intracelular de su actividad.
Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas

Al igual que sucede con la mayora de las reacciones qumicas, las
reacciones enzimticas incrementan su velocidad con la temperatura.

La velocidad de muchas reacciones enzimticas se duplica,
aproximadamente por cada 10 C de aumento de la temperatura.

El pico de la grfica al representar la actividad cataltica respecto a la
temperatura se debe a que las enzimas, al ser protenas, se
desnaturalizan por accin del calor y se inactivan a partir de cierto
punto.

A partir de los 55-60 C la mayor parte de las enzimas se inactivan.

Sin embargo, las enzimas de bacterias termoflicas siguen siendo
activas a temperaturas superiores a los 85 C.