UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

Departamento de Ingeniera Qumica

Laboratorio Diseo de Bio-Reactores

LABORATORIO 3: Determinacin de Actividad Enzimtica Especfica

(Enzima Libre) y de Contenido de Protenas
I.

Introduccin
La mayora de las enzimas son protenas especializadas en la catlisis de
reacciones biolgicas. Sus principales caractersticas son su gran poder cataltico
y alta especificidad. La catlisis tiene lugar en un centro especfico de la enzima
llamado sitio activo. La produccin de enzimas es seguida por una purificacin
y una estandarizacin del producto. En la formulacin del producto se agregan
diversos excipientes (otras protenas y azcares, por ejemplo), por lo que un
preparado enzimtico comercial no es 100% puro.
La reaccin ms simple que pueden catalizar las enzimas est representada por
la ecuacin:

Donde E, S y P, representan a la Enzima, Sustrato y Producto, respectivamente.

ES y EP representan a los complejos transitorios Enzima-Sustrato y EnzimaProducto.
En este prctico trabajaremos con lactasa, la cual es la enzima encargada de
convertir la lactosa en glucosa y galactosa.
Los objetivos son la determinacin de la actividad especfica enzimtica de
lactasa y del contenido de protenas de una formulacin comercial de lactasa a
partir de Aspergillus Oryzae.
En este ensayo se utilizar lactosa como sustrato, y se monitorear la
concentracin de glucosa en el tiempo mediante el mtodo de glucostat.
Para la determinacin de protenas, se utilizar el mtodo de Bradford, por ser
una tcnica sencilla, rpida y que presenta menor interferencias que otros
mtodos de anlisis.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

Departamento de Ingeniera Qumica
Laboratorio Diseo de Bio-Reactores

II.

Determinacin de Actividad Enzimtica Especfica

Con respecto a la determinacin de la actividad de la enzima, debemos recordar
que la actividad enzimtica:
Indica el mximo potencial cataltico de una enzima y est dado por la
velocidad inicial de la reaccin.
La velocidad de reaccin se mide cuantificando la evolucin del
producto o del sustrato de reaccin en el tiempo, pero este ltimo es ms
dificultoso ya que se utiliza en exceso y las variaciones en corto tiempo
no son notorias.
Se determina en las mejores condiciones para la enzima (T y pH ptimo)
y a concentraciones saturantes de sustrato.
La unidad internacional (UI) utilizada corresponde a la cantidad de
enzima que permite catalizar 1 mol de sustrato por minuto de reaccin
a las condiciones antes mencionadas.
La medicin de actividad se ve afectada por los siguientes factores:
o Denaturacin de la enzima (por temperatura)
o Reversibilidad de la reaccin enzimtica.
o Inhibicin de la enzima (por producto o inhibidor externo)
o Desaturacin de la enzima (baja concentracin de sustrato)
Para evitar los tres primeros factores, la medicin se realiza a tiempos cortos;
el ltimo factor se evita al utilizar una concentracin saturante de sustrato.
Al evitar tales problemas la velocidad de reaccin slo est condicionada por
la cantidad de enzima utilizada en la reaccin.

III.

Procedimiento Experimental
a. Determinacin de la actividad de lactasa de Aspergillus oryzae.

Preparar a partir de una solucin patrn de lactasa a 1000 ppm, 2 mL de

la dilucin correspondiente a cada grupo.

Adicionar en tubos de ensayo 1,8 mL de lactosa 20 g/L.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

Departamento de Ingeniera Qumica
Laboratorio Diseo de Bio-Reactores

Pre-Incubar durante aproximadamente 3 minutos a 30C, para llevar el

sustrato a la temperatura ptima de reaccin de la enzima.

Adicionar 0,2 mL de la solucin de lactasa previamente diluida.

Incubar durante el tiempo de reaccin seleccionado (0, 2, 5, 10, 15

minutos).

Detener la reaccin mediante ebullicin durante 5 minutos.

Determinar el contenido de glucosa en la muestra mediante el mtodo de

glucostat.

b. La determinacin de glucosa se realiza segn un Kit enzimtico:

A 0,1 mL de muestra (solucin inactivada) agregar 1 mL del reactivo.

A 0,1 mL de estndar agregar 1 mL del reactivo.

Incubar a 37C por 10 minutos (para realizar la reaccin).

Leer el valor de la absorbancia a 505 nm, contra un blanco de buffer y

reactivo. El valor de absorbancia del estndar se mide slo una vez y
debe ser registrado.

Notas:
*Se utilizarn diferentes concentraciones de enzima para medir la actividad de
sta.
*Las mediciones deben ser realizadas por duplicado.
*La solucin enzimtica debe ser realizada en buffer acetato pH 4.5 0.1 M de
manera de mantener la actividad de la enzima.
c. Determinacin de la concentracin de protenas
El alumno deber realizar la dilucin correspondiente a partir de una
solucin patrn de lactasa (1000 ppm) y determinar su contenido en
protenas segn el protocolo que se indica a continuacin:

A 0,1 mL de muestra agregar 1 mL de reactivo de Bradford (entregado

por el ayudante).

Agitar suavemente para homogeneizar la solucin y permitir la reaccin.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

Departamento de Ingeniera Qumica
Laboratorio Diseo de Bio-Reactores

Esperar por aproximadamente 15 minutos en oscuridad (no ms de una

hora).

Leer en espectrofotmetro a una longitud de onda de 595 nm contra un

blanco de buffer y reactivo.

Interpolar el valor obtenido en la curva de calibracin (entregada por el

ayudante).

Nota:
*Las diluciones en este caso se pueden realizar con agua destilada.
IV.

Resultados Fundamentales a entregar en el informe

1. Cada grupo deber recolectar los resultados obtenidos en las experiencias
hechas por los distintos grupos. Con estos resultados se deber hacer el informe
del prctico de laboratorio. Debern obtener de cada grupo la evolucin de la
concentracin de producto (glucosa) en el tiempo, para la concentracin
especfica de enzima usada en cada grupo.
2. Con estos resultados se debern construir 2 grficas. La primera de ellas
debe mostrar la evolucin de la concentracin de producto (moles/L) en el
tiempo (min) para cada una de las concentraciones de enzima. La segunda
grfica debe mostrar la evolucin de la velocidad inicial de reaccin
(moles/L.min) en funcin de las concentraciones de enzima (mg prot/L)
usadas.
3. Se deber entregar el valor de la actividad enzimtica especfica del
preparado enzimtico original, expresada en UI/mg enzima (protena).
4. Finalmente se deber comparar el valor terico de cantidad de protena de la
enzima con la experimental.
IMPORTANTE: La concentracin de enzima que se us es de preparado
enzimtico y NO de enzima. Para obtener la concentracin de enzima considere
que el preparado enzimtico contiene un 30% en peso de enzima (el 70%
restante son excipientes azcares, estabilizantes y otros) por un lado, y por otro
considerar el valor calculado mediante el Mtodo de Bradford.