Universidad Nacional de

Cajamarca
Facultad de Ciencias Veterinarias
Escuela Acadmico Profesional de
Medicina Veterinaria
INFORMES DE PRCTICAS
ASIGNATURA :

BATERIOLOGIA VETERINARIA

DOCENTE

Dr. JOSE RAFAEL BAUTISTA

ALUMNOS

CASANOVA HOYOS ELMER

SANCHEZ MEGO LUIS ALBERTO

CICLO

IV

Cajamarca, Noviembre de 2011

MEDIOS DE CULTIVO
Introduccin.
Un medio de cultivo consiste en un
gel o una solucin que cuenta con los
nutrientes necesarios para permitir
(bajo condiciones favorables de pH y
temperatura) el crecimiento de virus,
microorganismos, clulas o incluso
pequeas plantas. Segn qu se
quiera hacer crecer, el medio requerir
unas
u
otras
condiciones.
Generalmente
se
presentan
desecados en forma de polvo fino o
granular antes de ser preparados, al
prepararse podemos encontrarlos en
estado slido, semislido y lquido. El
objetivo ltimo del cultivo es variado:
antibiograma,
identificacin,
multiplicacin. Los Virus, por ejemplo,
son obligados parsitos intracelulares
por eso necesitan de un medio que
contenga clulas vivas.
Clasificacin:
Segn sus cualidades fsicas distinguimos:

Lquidos
Semi-slidos
Slidos

Segn su formulacin:

Qumicamente definidos: se conoce exactamente la cantidad de cada uno de los

compuestos que hay en el medio.
Complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura,
sangre,...). Por tanto, no se conoce exactamente cul es la composicin del medio.
Sin embargo, presenta la ventaja de que ya estn presentes todos o casi todos los
elementos que una clula puede requerir.

Segn su uso:

Medio General: Es aquel medio donde crecen todo tipo de microorganismos,

excepto aquellos que necesitan de unas condiciones especiales.

Ejemplo: Agar CLED

Selectivos: permiten seleccionar el crecimiento de una especie o grupo

determinado (hongos, bacterias entricas, protozoos).
Diferenciales: permiten identificar una especie o grupo por su crecimiento ya sea
por su metabolismo, respiracin, etc.

Ejemplo: Medio de McConkey

De enriquecimiento: son medios diseados para permitir el crecimiento del mximo

nmero de especies posible. Pueden usarse, por ejemplo, para estudiar todos los
microorganismos presentes en una muestra.
Mnimo: contienen la mnima cantidad de nutrientes posible que permite el
crecimiento de una especie.
De transporte: est preparado para servir de almacenamiento temporal a
especmenes transportados. manteniendo su viabilidad y su concentracin.
Simple.
AGAR MAC CONKEY

USO:
El Agar MacConkey es un medio selectivo y diferencial
recomendado para el cultivo y aislamiento de
microorganismos Gram negativos a partir de muestras
clnicas, de alimentos, agua, productos lcteos y
productos farmacuticos. En este medio se aslan y
diferencian bacilos entricos Gram negativos
fermentadores y no fermentadores de la lactosa.
EXPLICACIN:
El Agar MacConkey en su frmula original fue utilizado para diferenciar cepas de
Salmonella typhosa de otros miembros del grupo coliforme. La frmula fue modificada
para mejorar el crecimiento de cepas de Salmonella y Shigella y con ello tambin se
mejoraron las reacciones diferenciales entre los microorganismos patgenos entricos
y el grupo coliforme.
El Agar MacConkey contiene cristal violeta y sales biliares como inhibidores de
organismos Gram positivos. Las colonias aisladas de bacterias que fermentan la
lactosa son rosadas y pueden estar rodeadas de una zona de precipitado de sales
biliares el cual es debido a una cada en el pH por la fermentacin de la Lactosa. Las
colonias que no fermentan la lactosa (como las de S. typhi, S. paratyphi y S. disentery)
permanecen incoloras.
FORMULA:
Digerido Pancretico de Gelatina 17.0
Digerido Pptico de Tejido Animal 1.5
Digerido Pancretico de Casena 1.5
Lactosa 10.0 Agar Bacteriolgico 13.5

Sales Biliares 1.5

Cloruro de Sodio 5.0
Cristal Violeta 0.001
Rojo Neutro 0.03 pH 7.1 0.2

PREPARACIN:
Mtodo:
Suspender 50g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave
hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a
121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 4550C y vaciar en placas de Petri estriles.
Procedimiento:
Inocular las placas por estra o con hisopo, asegurndose de que con cualquiera de
los dos mtodos se tengan colonias aisladas. Incubar las placas a 35 0.2C durante
18 a 24 hrs. Si no hay desarrollo a las 24 hrs, reincubar las placas por 24 horas ms.
RESULTADOS:
Los microorganismos lactosa positiva dan colonias de color rosa con o sin zona de
precipitado alrededor.
Los microorganismos lactosa negativos dan colonias incoloras o de color muy
claro.

Almacenamiento: 2-30 C.
Caducidad: 5 aos en frasco cerrado.
Presentacin: Frasco con 450 g.
Caja con 20 sobres para un litro.
Medio preparado en paquete con 10 placas.

Bibliografa:

3. Food and Drug Administration. 1995 Bacteriological analytical manual, 8th ed. AOAC International.
Gaitherrsburg, MD.
4. Gray, L.D. 1995 Escherichia, Salmonella, Shigella and Yersinia, p450-456. In P.R. Murray, E.J.
Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken
(ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

AGAR NUTRITIVO
USO:
El Agar Nutritivo es utilizado para el cultivo de una amplia
variedad de microorganismos.
EXPLICACIN:
A principios de 1900 la APHA (American Public Health Association) sugiri esta
formulacin como un medio de cultivo estndar para el anlisis de agua. El Agar Nutritivo
se encuentra descrito en los Mtodos estndar de la APHA y de la AOAC (Association of
Oficial Analytical Chemists) para el anlisis de agua, leche y sus derivados, alimentos y
otros materiales. El Agar Nutritivo sigue siendo un medio ampliamente utilizado para el
cultivo de microorganismos no fastidiosos.
En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrgeno, vitaminas
y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante.

FORMULA:
Peptona de Gelatina 5.0
Agar Bacteriolgico 15.0

Extracto de Carne 3.0

pH 6.8 0.2

PREPARACIN:
Mtodo:
Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave
hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C
(15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50C y
vaciar en placas de Petri estriles.
Procedimiento:
1. Inocular las placas con una asada y sembrar por el mtodo de estra.
2. Incubar las placas a 35 C durante 18 a 24 horas.
RESULTADOS:
El crecimiento de bacterias no fastidiosas se observa como colonias translcidas.
Almacenamiento: 2-30 C.
Caducidad: 5 aos en frasco cerrado.
Presentacin: Frasco con 450 g
Caja con 20 sobres para un litro
Medio preparado en paquete con 10 placas
Medio preparado en caja con 10 Tubos
Bibliografa:

1. American Public Health Association. 1917. Standard methods of water analysis, 3rd ed.
American Public Health Association. Washington, D.C.
2. American Public Health Association. 1923. Standard methods of water analysis, 5th ed.
American Public Health Association. Washington, D.C.
AGAR SANGRE
USO:
La Base de Agar Sangre es un medio utilizado para el
aislamiento y cultivo de una amplia variedad de
microorganismos, adicionado de sangre es til para el cultivo de
microorganismos fastidiosos. Este medio tambin es conocido
como BAB por sus siglas en ingls.
EXPLICACIN:
La Base de Agar Sangre generalmente es suplementada con sangre de carnero, conejo o
caballo al 5-10% para aislar cultivar y estudiar reacciones hemolticas de una amplia
variedad de microorganismos fastidiosos patgenos.

En 1919 Brown experiment con formulaciones de agar sangre para observar el efecto
hemoltico de las colonias de neumococos. La Base de Agar Sangre es una modificacin
del medio Hormone de Huntoon con una ligera composicin cida.
Este medio est especificado en los Mtodos Estndar para el anlisis de alimentos.
La infusin de msculo de corazn y la peptona de casena proporcionan la fuente de
nitrgeno, carbono, aminocidos y protenas. El extracto de levadura provee vitaminas y
aminocidos esenciales.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es usado como agente
solidificante. Este medio est relativamente libre de azcares reductores los cuales
interfieren en las reacciones hemolticas de estreptococos. El patrn de las reacciones
hemolticas puede variar dependiendo del tipo de sangre utilizada.
FORMULA:
Infusin de Msculo de Corazn 2.0
Cloruro de Sodio 5.0
Digerido Pancretico de Casena 13.0
pH 7.3 0.2

Extracto de Levadura 5.0

Agar Bacteriolgico 15.
Bacteriolgico 15.0

PREPARACIN:
Mtodo:
Suspender 40 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave
hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C
(15 libras de presin). Enfriar a una temperatura entre 45-50 C y aadir, de preferencia,
sangre de carnero estril y desfibrinada al 5%.
Homogeneizar y vaciar en placas Petri estriles.
Procedimiento:
1. Procesar las muestras y sembrarlas en las placas por el mtodo de estra. Encajar
varias veces el asa en el medio para depositar a los estreptococos betas hemolticos
debajo de la superficie del medio.
2. Incubar las placas a 35-37 C por 18-24 y 48 horas en condiciones de aerobiosis,
anaerobiosis o bajo atmsfera parcial de CO2 de acuerdo con los procedimientos
establecidos por el laboratorio.
RESULTADOS:
Los estreptococos hemolticos presentan colonias translcidas u opacas, grises,
pequeas y mucoides con una zona de hemlisis. Otros organismos que pueden producir
hemlisis incluyen a Listeria, varias conirebacterias, estafilococos hemolticos, E. coli y
Pseudomonas.
Las colonias de neumococos aparecen planas, lisas, translcidas, grisceas y algunas
veces mucoides rodeadas por una pequea zona verdosa de alfa hemlisis, las colonias
de estafilococos tienen una apariencia opaca, de color blanco a amarillo y rodeadas de
una zona clara por la beta hemlisis.
Es importante realizar el examen microscpico.

Almacenamiento:
Caducidad:
Presentacin:

2-30C.
5 aos en frasco cerrado
Frasco con 450 g
Caja con 20 sobres para un litro
Medio preparado Agar Sangre en paquete con 10 placas.

Bibliografa
1. Atlas, R. 1993. Handbook of microbiological media, p. 136-138. CRC. Press. Boca
Raton, FL.
AGAR GC gelosa chocolate
USO:
La Base de Agar Gelosa Chocolate es un medio utilizado con varios
suplementos para el aislamiento y cultivo de Neisseria gonorrhoeae
y otros microorganismos fastidiosos. Este medio tambin es
conocido como Base de Agar GC.
EXPLICACIN:
En 1945 Johnston describi un medio adecuado para observar las
colonias de Neisseria gonrrhoeae en 24 horas en lugar de las 48 horas generalmente
requeridas. El crecimiento acelerado fue debido a una reduccin en la concentracin de
agar. Investigando el crecimiento de algunas cepas de neumococos se observ que el
medio conteniendo los factores de crecimiento glutamina y cocarboxilasa permiti una
mejor recuperacin. A partir de esta observacin se desarrollaron suplementos de
enriquecimiento que junto con la hemoglobina hacen a la Base de Agar GC un medio
superior.
La Base de Agar GC es utilizada para preparar Agar Gelosa Chocolate cuando es
suplementada con hemoglobina al 2% que provee la hemina (Factor X) requerida para el
crecimiento de Haemophilus y mejorar el desarrollo de Neisseria, as como suplementos
(disponibles comercialmente) que proveen glutamina, cocarboxilasa, levadura, glutamina,
coenzimas, hemina, vitaminas, aminocidos, dextrosa y otros factores de crecimiento,
todos ellos necesarios para el mejor desarrollo de Haemophilus y Neisseria.
Cuando a esta base se le adiciona adems inhibidores selectivos como el VCN o VCNT
se prepara el Agar Thayer Martn y Thayer Martn Modificado
FORMULA:
Mezcla de Peptonas 15.0
Almidn de Maz 1.0
Cloruro de Sodio 5.0
pH 7.2 0.2

Fosfato Dipotsico 4.0

Fosfato Monopotsico 1.0
Agar Bacteriolgico 10.0

PREPARACIN:
Mtodo:
Suspender 7.2 g del medio en 100 mL de agua purificada para obtener una base de doble
concentracin, mezclar y dejar reposar durante 5 minutos, calentar con agitacin
frecuente hasta completar la disolucin del polvo y hervir durante un minuto. Por otro lado,
preparar 100 mL de una solucin de hemoglobina al 2% adicionando gradualmente agua
a 2 g de hemoglobina seca para obtener una solucin uniforme.
Esterilizar ambas soluciones en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar las
soluciones a una temperatura de 45-50 C, mezclar y agregar los dems ingredientes
dependiendo del medio que se desee preparar. Homogenizar y vaciar en placas Petri
estriles.
Procedimiento:
1. Procesar las muestras y sembrar las placas inicialmente en forma de Z y
posteriormente estriando.
2. Incubar en atmsfera aerbica enriquecida con CO2 a 35 2C por 18 a 24 y hasta 48
horas y observar el crecimiento.
RESULTADOS:
La morfologa tpica colonia se describe en la siguiente tabla:
Haemophilus influenzae Colonias pequeas, hmedas, perladas con caracterstico olor
hmedo.
Neisseria gonorrhoeae Colonias pequeas grisceas o incoloras, mucoides.
Neisseria meningitidis Colonias medianas a grandes, de color azul grisceo, mucoides.
Estreptococcus pneumoniae Colonias pequeas, planas, pueden aparecer verdes por la
decoloracin del medio.
Almacenamiento: 2-30C.
Caducidad: 5 aos en frasco cerrado.
Presentacin: Frasco con 450 g
Caja con 20 sobres para un litro
Medio preparado Agar Gelosa Chocolate paquete con 10 placas.
Bibliografa:
1. Isenberg, H.D. (Ed.). 1992. Clinical microbiology procedures handbook, vol. 1 American
Society for Microbiology, Washington, D. C.
2. Spray, 1930. J. Lab. Clin. Med. 16:166.

CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

INTRODUCCION
Un medio de cultivo intenta el crecimiento y reproduccin in vitro de las bacterias, para
observar sus propiedades y conseguir un mejor estudio bioqumico e inmunolgico, al
contar con material en cantidad suficiente. Por ello constare de lagunas propiedades
(pH adecuado, sales, nutrientes, condicione de aero-anaerobiosis, etc.), que sern las
ms idneas para la bacteria
que deseamos estudiar y se
citan en cada una de ellas en
particular, en la bacteriologa
sistemtica.
Los medios de cultivo se
dividen por su finalidad en:
medios de enriquecimiento que
tratan de aumentar el nmero
de bacteria existentes, si
consideramos
que
se
encuentran en cantidad muy
exigua, a la vez que inhiben la
flora
de
asociacin
acompaante (y de aislamiento
(que tienen por fin conseguir
una colonia o clon, es decir, grupo de bacterias procedentes de una sola, con todas
sus propiedades); los dos primeros son principalmente lquidos y los segundos,
slidos. Los medios selectivos son aquellos que poseen algn componente que
permite o no le crecimiento de una especie bacteriana, carcter de importancias para
su identificacin, y los diferenciales, aquellos que las diversas especies que hay que
testar alteran de forma distinta, por lo que suelen llevar indicadores (sustancias que
varan su coloracin segn el pH del medio) u otros ndices de reacciones qumicas
definidas.
Ambos medios selectivos o diferenciales pueden ser lquidos o slidos.
OBJETIVOS
Identificar mtodos eficaces para el aislamiento de microorganismos.
Conocer algunos mtodos para obtener un cultivo puro.

El objetivo clsico del aislamiento es la separacin de los microorganismos en grupos,

que puedan identificarse siguiendo los principios de la microbiologa.

MATERIALES
Mecheros
Asas, agujas e hisopos de inoculacin
Placas petri
METODOS
CULTIVO PLACA AGAR
Se utilizan variaos mtodos de siembra por estras en superficie
entre las cuales tenemos el mtodo francs y el clsico, la finalidad
de estos, es obtener colonias separadas.

METODO FRANCES (Estra compuesta)

Se flamea el asa y se toma la muestra del material a estudiar.
Coloque el inoculo en uno de los extremos de la caja de petri con el
medio de cultivo indicado.

CULTIVO EN AGAR NUTRITIVO

El crecimiento de las bacterias en medios lquidos se
manifiesta por la aparicin de: turbidez o sedimento, velo en la
superficie del medio y olor caracterstico.
Para la siembra proceda de igual manera que en el caso
anterior pero utilizando el asa y agitndola en un medo liquido.
Incube a 37 grados por 24 o 48 horas, interprete los resultados.

BIBLIOGRAFA.
Microbiologa General, Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.%20Cultivo%20de%20
microoorganismos.pdf Fecha de consulta: 22-04-2010.

ANTIBIOGRAMA
Introduccin:
Un antibitico es una sustancia de origen
biolgico que inhibe el crecimiento de los
microorganismos a concentraciones muy
bajas. Un antibiograma es un estudio de la
sensibilidad
"in
vitro"
de
un
microorganismo patgeno frente a las
sustancias
antimicrobianas.
Existen
distintos mtodos siendo los ms
importantes los de:
Difusin:
Habitualmente
cualitativos.
Atendiendo al halo de inhibicin que
aparece alrededor del disco, se clasifican los microorganismos como sensibles
(S), intermedios (I) o resistentes (R) segn sea la eficacia obtenida por el agente
antimicrobiano frente al microorganismo.
Dilucin: Es un estudio cuantitativo. Se emplean una serie de tubos con distintas
concentraciones de agente antimicrobiano (4-128 _g/ml).
Se observa el crecimiento de los microorganismos mediante la aparicin de
turbidez, o el cambio de color del indicador incorporado al medio.
La sensibilidad de una bacteria a un antibitico viene dada por la:
C.M.I. es la concentracin mnima inhibitoria, representa la mnima cantidad de
antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo.
C.M.B. concentracin mnima bactericida. Es la concentracin mnima que mata
el microorganismo. Normalmente, la CMI es suficiente para combatir una
determinada infeccin ya que los mecanismos inmunitarios se encargan de
eliminar al microorganismo.
Deteccin de beta lactamasas: Algunos microorganismos son capaces de
producir estas enzimas, que destruyen los derivados del grupo de las penicilinas,
hidrolizando el anillo betalactmico. Se aplica esta prueba a los siguientes
microorganismos: Staphylococcus aureus, Haemphilus influenzae y Neisseria
gonorrhoeae.
El antibiograma por el mtodo de difusin en agar es una de las pruebas
utilizadas para determinar la sensibilidad de un microorganismo frente a un
antibitico. En esta prueba se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de
un medio de agar a una solucin antibitica absorbida en discos de papel de filtro
o en pastillas.

Procedimiento:
1. Preparar 3 placas Petri con agar Meller Hinton.
2. A partir de un cultivo fresco de las bacterias que hay que ensayar (E. coli,
Staphilococcus,...), inocular 4-5 colonias en un tubo con 5 ml de caldo TSB.
3. Utilizando un hisopo de algodn sumergirlo en el inculo y eliminar el exceso
presionndolo sobre la pared interna del tubo.
4. Inocular la superficie de una placa de agar Meller Hinton con el hisopo
pasndolo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones. Por ltimo,
pasar el hisopo por el reborde de la placa.
5. Dejar secar 10 min con la tapa algo abierta (junto al mechero).
6. Preparacin de los discos con antibitico. Disolver una cpsula, comprimido,
gragea o vial de antibitico en agua destilada; elegir una presentacin de
antibitico fcilmente soluble (Calcular el volumen de dilucin que precisa cada
tipo de antibitico, segn la tabla 8.1).
7. Preparar un banco de diluciones (-1, -2) con agua destilada.
8. Con micropipeta Pasteur impregnar los discos para antibiograma con 1 gota de
micropipeta (32 _l) de las disoluciones de antibitico (se puede utilizar la misma
pipeta si se realiza de menor a mayor concentracin). Anotar la concentracin y el
volumen de antibitico aadido en cada disco.
9. Colocar el disco de antibitico (con pinzas estriles) sobre la superficie del agar
y apretarlo suavemente sobre la superficie del medio. Los discos no deben estar a
menos de 15 mm de los bordes de la placa y a unos 20 mm uno de otro para que
no se superpongan las zonas de inhibicin. (No mover los discos una vez
implantados).
10. Realizar la operacin con:
a. Placa 1 (Staphilococcus):3 discos con las diluciones (1,-1, -2) de Amoxicilina.
b. Placa 2 (Staphylococcus):3 discos con las diluciones (1,-1, -2) de Penicilina G
c. Placa 3 (E. Coli): 3 discos con las diluciones (1,-1, -2) de Amoxicilina,
3 discos con las diluciones (1,-1, -2) de Penicilina G.

Tabla 8.1. Halos de inhibicin aceptables segn las normas de la NCCLS para los
antibiogramas de difusin
Antibitico /carga
del disco (g)

Amicacina/30
Amoxicilina-clavulnico/20/10
Ampicilina/10
Cefazolina/30
Cefotaxima/30
Ceftazidima/30
Cefuroxima/30
Cloranfenicol/30
Ciprofloxacina/5
Clindamicina/2
Doxiciclina/30
Eritromicina/15
Gentamicina/10 16-21
Imipenem/10
cido nalidxico/30
Nitrofurantona/300
Norfloxacina/10
Oxacilina/1
Penicilina G/10
Piperacilina/100
Tobramicina/100
Trimetoprim/Sulfametoxazol/
1,25/23,75
Vancomicina/30
NA = No aplicable

Halos de inhibicin (mm)

E. coli
ATCC
25922
19-26
19-25
16-22
23-29
29-35
25-32 1
20-26
21-27
30-40
NA
18-24
NA
19-26
26-32
22-28
20-25 1
28-35
NA
NA
24-30
18-26
24-32

S. aureus
ATCC 25923

E. coli
ATCC 25922

20-26
28-36
27-35
29-35
25-31
16-20
27-35
19-26
22-30
24-30
23-29
22-30
19-27
NA
NA
18-22
17-28
18-24
26-37
NA
19-29
24-32

18-26
NA
NA
NA
18-22
22-29
NA
NA
25-33
NA
NA
NA
16-21
20-28
NA
NA
22-29
NA
NA
25-33
19-25
NA

NA

15-19

NA

LECTURA DE LAS PLACAS E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Medir los dimetros de las zonas de inhibicin
completa (incluyendo el dimetro del disco), usando
una regla o calibrador. Se debe mantener iluminada
la parte posterior de la placa petri con una luz
reflejada localizada a unos cuantos centmetros
sobre un fondo negro. Tener la precaucin de
observar la placa siguiendo una vertical directa para
evitar una lectura errnea de las marcas de la regla
por efecto de paralelismo. En los medios
suplementados con sangre, las zonas son medidas
en la parte superior de la superficie del agar y
retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona
de la hemlisis sino la de inhibicin del crecimiento.