1ª.

EXPLICACION DE TRABAJOS PRACTICOS -2007–

MICROBIOLOGIA GENERAL- BIOQUIMICA

MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCION

Las bacterias son organismos muy versátiles. Presentan un

gran potencial en su capacidad de utilizar disitntas fuentes de
alimentos, desde sustancias inorgánicas hasta materias orgánicas
sumamente complejas. Muchas especies han aprendido a crecer en una
amplia diversidad de nichos ecológicos con temperatura, acidez o
tensiones de oxígeno extremas.
Es muy difícil estudiar microorganismos en forma individual; lo
más práctico es trabajar con poblaciones de los mismos. Para lograr
estas poblaciones es necesario disponer de un medio artificial que
brinde a los microorganismos todos los requerimientos nutricionales
para desarrollarse. Este ambiente artificial se denomina MEDIO DE
CULTIVO.

* MEDIO DE CULTIVO es toda preparación artificial, sólida, semisólida o

líquida que suministra al microorganismo cada una de las sustancias
fundamentales, una fuente de energía y condiciones ambientales
adecuadas para la síntesis y mantenimiento de su protoplasma.

• CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se

obtienen en los medios de cultivo.
Los cultivos pueden ser:
a) puros o axénicos, cuando la población está constituida por
una única clase de microorganismos.
b) mixtos, cuando la población está constituida por más de una
clase de microorganismos.

En la actualidad, la mayoría de los gérmenes patógenos se pueden

cultivar fuera de su hábitat natural. Ciertos parásitos obligados como
las Rickettsias, nunca han podido cultivarse en medios artificiales;
requieren células vivas, cultivos de tejidos o embriones de pollo.

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS SEGÚN LA FUENTE DE

ENERGIA Y CARBONO QUE UTILIZAN
Al diseñar un medio de cultivo es importante conocer los
requerimientos de energía y carbono de las especies a cultivar.
 - Fuente de energia, puede ser:
- luz: energía luminosa que se
convierte en energía química. Los microorganismos que utilizan esta
fuente de energía se denominan fototrofos.
- reacciones de oxido-reducción a partir
de compuestos químicos inorgánicos u orgánicos. Los microorganismos
que utilizan esta fuente de energía se denominan quimiotrofos.

Todos los organismos requieren una fuente de energía para obtener

ATP y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los
siguientes metabolismos:
- respiración aerobia: aceptor final de electrones O2
- respiración anaerobia: aceptores finales de electrones: NO3-,
SO4=, CO2, fumarato
- fermentación: conjunto de reacciones donde compuestos
orgánicos sirven como donadores y receptores de electrones. Se
produce ATP por fosforilación a nivel de sustrato.
- Fotosíntesis

-Fuente de carbono, puede ser:

- CO2: los microorganismos que
utilizan esta fuente de carbono se denominan autotrofos.
- compuestos orgánicos carbonados
(azúcares, aminoácidos, ácidos grasos, etc). Los microorganismos que
utilizan estas fuentes de carbono se denominan heterotrofos.

De la combinación de estas categorías surge la sig. clasificación de

microorganismos:

Fuente de energía Fuente de carbono Categoría

Ejemplos

Luz CO2 Fotoautotrofos Algas,

cianobacterias

acetato Fotoheterotrofos
Alg. bacterias

Reacciones CO2 Quimiolitotrofos

Bacterias oxidantes de
de óxido-reducción H2,
del azufre, de Fe2+
compuestos orgánicos
Quimioorganotrofos Hongos, bacterias
Fotoautotrofos = fotolitotrofos
Fotoheterotrofos = fotoorganotrofos

COMPOSICION QUIMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cuando se diseña la fórmula del medio de cultivo, es necesario conocer

en qué categoría está incluido el microorganismo a cultivar para elegir
acertadamente los componentes del medio: generalmente compuestos
inorgánicos para microorganismos fototrofos y quimiolitotrofos, y
orgánicos para quimioorganotrofos.

Un medio de cultivo está integrado por:

1. Elementos energéticos y constitutivos:

a) Macroelementos (g/l):
• Fuente de carbono: puede ser CO2 ó compuestos carbonados
orgánicos. Se utilizan en la construcción de innumerables
moléculas necesarias para la célula. Los hidratos de carbono
se consideran fuente de carbono y energía por excelencia
en los quimioorganotrofos. Los más comunes son:
- hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;
- pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;
- disacáridos como lactosa, sacarosa, maltosa;
- trisacáridos como rafinosa;
- polisacáridos como almidón, glucógeno;
- alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y
- glucósidos como salicina, y esculina.
• Fuente de nitrógeno: muchos organismos son autotrofos
respecto de la fuente de nitrógeno y pueden crecer utilizando
moléculas sencillas como NO3-, NH3 ó N2. El nitrógeno es
metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y
polímeros de pared. Otros microorganismos pueden incorporar
nitrógeno en forma de aminoácidos, bases púricas o
pirimídicas.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el
aporte de nitrógeno es realizado por las peptonas, que son
los productos de la hidrólisis ácida o enzimática de proteínas
de origen animal o vegetal (carne, soja, caseína, gelatina,
 harina de maíz y girasol). Esos productos de hidrólisis pueden
tener longitud variable, desde aminoácidos, hasta dipéptidos,
tripéptidos, polipéptidos, albumosas, proteosas.
La hidrólisis ácida puede ser realizada con HCl ó H2SO4 y
presenta las siguientes desventajas:
- el triptofano se destruye
- se pierde el 10% de vitaminas presentes
- desaparecen casi completamente los polipéptidos
Se prefiere la hidrólisis enzimática que emplea diferentes
proteasas actuando a pH específicos, ej. papaína a pH 6.5,
tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2.
Las peptonas son fuente de nitrógeno y, en ausencia de
hidratos de carbono en el medio de cultivo complejo,
cumplen la función de fuente de carbono y energía. Aportan
vitaminas del grupo B, trazas de metales y fosfatos que dan
carácter “buffer” al medio.
Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos
fermentables.
• Fuente de fósforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o
potasio que también confieren poder buffer al medio de cultivo
(pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de
cultivo, el aporte de P es realizado por los glicerofosfolípidos
de la yema. El fósforo se incorpora a ácidos nucleicos,
fosfolípidos, polímeros de membrana, ATP, y sustancias de
reserva (gránulos de volutina)
• Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o metionina.
En la célula se incorpora a aminoácidos y diferentes
coenzimas.
• Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y
magnesio se adicionan como sales inorgánicas. Son cationes
que estabilizan macromoléculas aniónicas. K+ actúa como
coenzima y estabilizador de RNA. Mg2+ se integra a colorofila
en organismos fotosintéticos. Ca2+ abunda en esporas como
dipicolinato de calcio.
• Fuente de sodio: sodio contribuiría a equilibrar la presión
osmótica del medio extracelular. Es un catión requerido por
bacterias halofílicas. Se suele suministrar como NaCl.

b) Microelementos o trazas (mg ó ug/ml): suelen estar

naturalmente presentes como contaminantes de los
macroelementos.
* Frecuentemente esenciales:
Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulación.
 Fe: cofactor de enzimas para la función respiratoria en
citocromos, catalasa y flavoproteínas. En adecuada concentración
favorece la síntesis de toxina diftérica.
Co: interviene en la síntesis de vitamina B12.
Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena respiratoria.
• Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, As, Se, Mo, Sn, Be,
F, etc.
• Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier
microelemento a concentración mayor que 10-4 M puede
resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.

2. Factores de crecimiento
Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy
bajas concentraciones que no pueden ser sintetizados por la
célula que los necesita. Por esta razón, deben ser agregados al
medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B,
algunos aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos. Hay
ejemplos clásicos como los factores X y V (porfirinas) de la
sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para
crecer. El suero fetal bovino, que aporta numerosos factores de
crecimiento, es imprescindible para el cultivo de células
animales.
Cómo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La
capacidad de sintetizar un compuesto esencial está relacionada
con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se
completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genéticas,
alguna enzima de la secuencia no puede ser sintetizada, la serie
de reacciones se bloquea en algún paso y no finaliza con éxito. El
compuesto que por esta razón dejó de sintetizarse, se convierte
en un factor de crecimiento.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los
factores de crecimiento pueden ser aportados por diversos
extractos:
-Extracto de carne: su función es ser complemento vitamínico de
las peptonas. Pero también aporta sustancias nitrogenadas
como: aminoácidos, bases púricas y pirimídicas, ácidos
orgánicos, creatina, xantina, hipoxantina, ácido úrico, urea, y
sustancias no nitrogenadas como glucógeno, fosfatos de
hexosas, ácido láctico, sales inorgánicas.
La calidad de este tipo de extracto varía con la carne empleada,
el tiempo y la temperatura de extracción.
-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de
las células de levadura. Su función es ser suplemento vitamínico
 de las peptonas, pero también aporta mezclas de aminoácidos y
péptidos, y carbohidratos.
-Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de
levadura ya que posee adecuado contenido de vitaminas,
carbohidratos y aminoácidos. Es el extracto soluble en agua de la
malta de cebada.

3. Agentes solidificantes
Su agregado al medio de cultivo es opcional.
El más usado:
- el agar, es un polisacárido ácido derivado de algas marinas,
formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato cada
10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en pequeñas
concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de
composición química estrictamente definida destinados a
autotrofos. Se usa sin problemas en medios de cultivo complejos
para quimioorganotrofos.
Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia sólida normal, al
0.2-0.3% en medios semisólidos o blandos, al 5% en medios de
consistencia muy firme para detener el crecimiento de gérmenes
muy móviles, y al 0% cuando se preparan medios líquidos
(caldos).
Sus características:
- Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C.
- A 45-55°C se pueden agregar suspensiones de células sin afectar
la viabilidad (supervivencia) de las mismas.
- Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la
mayoría de las bacterias patógenas del hombre.
- No es tóxico para las bacterias, ni es degradado por éstas.
- Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias
(poblaciones de microorganismos derivadas de una única célula),
lo que resulta imposible en medios líquidos!
- Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.
- Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para
permitir la difusión de los nutrientes del medio de cultivo en
todas direcciones, y suficientemente cerrada –según la
concentración empleada- para impedir la movilidad de los
microorganismos.

Otros solidificantes:
- Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa
intensamente para fines específicos en Inmunología y Biología
Molecular.
 - Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de
cultivo para autotrofos, cuando debe excluirse materia orgánica
del medio de cultivo.
- Gelatina: es una proteína obtenida por hidrólisis del colágeno.
Fue el primer solidificante usado en Microbiología, pero es
degradado por la mayoría de las bacterias (lo comen, por lo que
el medio inicialmente sólido termina convertido en medio líquido)
y la temperatura de incubación no puede ser mayor a 22°C (es el
punto de fusión) con lo que cultivos sólidos a temperaturas más
altas resultan inviables.
- Albúmina de huevo, suero: a 80°C estas proteínas coagulan y
solidifican el medio de cultivo.

4. Agua
El agua representa una altísima proporción (80-90%) del peso
total de una célula y es fundamental para la realización de todos
los procesos metabólicos, funciones enzimáticas, solvatación de
materiales orgánicos e inorgánicos, donación de electrones para
organismos fotosintéticos. Los medios de cultivo se preparan en
el laboratorio con agua destilada lo que estandariza su
composición y asegura la ausencia de iones como Ca2+ y Mg2+
que pueden precipitar con fosfatos o generar reacciones
indeseables.

CONDICIONES FISICAS DE UN MEDIO DE CULTIVO

Aún cuando las condiciones químicas del medio de cultivo

estén cubiertas, el crecimiento y desarrollo de los microorganismos no
tendrá lugar si se desconocen las siguientes condiciones físicas:

- temperatura: cada especie tiene su temperatura óptima de

crecimiento.
* mesófilos: 35-37°C
* psicrófilos: 15-20°C
* termófilos: 50-60°C
-presión osmótica: la mayoría de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl.
Las halófilas requieren concentraciones superiores.
-presencia de oxígeno: según sus requerimientos de O2 las bacterias se
clasifican en:
* aerobios estrictas: requieren oxígeno para crecer.
Metabolismo respiratorio.
* microaerófilos: necesitan bajas tensiones de O2 y
una atm enriquecida en CO2. Pueden
 realizar respiración aerobia.
*anaerobios obligados: el O2 les resulta tóxico. Crecen en
medios muy reducidos (sin O2).
Metabolismo fermentativo.
* anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2
(metabolismo fermentativo) y
cuando son expuestos al O2 no mueren.
*anaerobios facultativos: pueden crecer en condiciones
aerobias (metabolismo respiratorio)
como anaerobias (metabolismo
fermentativo).

-humedad: todas bacterias necesitan un ambiente mucho más húmedo

para su desarrollo que los hongos. En condiciones ambientales
adversas, algunas especies producen estructuras de resistencia a la
desecación llamadas esporas que permanecen viables durante tiempo
prolongado hasta que el ambiente sea propicio para la germinación.
Producen esporas los géneros Clostridium (ej. C. tetani,, C. botulinum),
Bacillus (ej. B. cereus, B. subtilis), Sporosarcina, entre otros.
- luz: es importante para los microorganismos fotosintéticos.
-pH: la mayoría de las bacterias crece en medio neutro o ligeramente
alcalino (7 – 7.6). Excepciones son los lactobacilos (pH 5, acidófilos),
Vibrio cholerae (pH 8.6,). Los hongos crecen a pH menor que 7.

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

a) Por su consistencia (esto depende de la inclusión o no de un

agente solidificante)

-líquidos (no permiten el aislamiento de

colonias)
-sólidos (permiten el aislamiento y observación
de colonias)

b) Por su origen (esto depende de que la fórmula se pueda describir

químicamente con precisión)

-sintéticos: estrictamente definidos desde el

punto de vista químico, generalmente
se usan para cultivar fototrofos y
quimiolitotrofos.
-naturales o complejos: se preparan a partir de
sustancias naturales de origen ani-
 mal o vegetal de composición
química no rigurosamente
constante: leche, suero,
macerado de maíz, peptonas, ex
tractos de carne, levadura. Son
aptos para el cultivo de
quimioorganotrofos. Son los que
prepararemos y usaremos en el
Laboratorio de Microbiología.
c) Por su composición:
- comunes: incluyen una fórmula nutritiva básica que
permite el crecimiento de microorganismos poco exigentes.
- enriquecidos: mejoran su calidad nutritiva por el agregado de
componentes muy ricos como
leche, sangre, huevo, líquido ascítico, extracto proteico de
cianobacterias. Se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes.

d) Por su función:
- Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que sembrados
con poblaciones mixtas de microorganismos, favorecen la
multiplicación de ciertos grupos e inhiben el desarrollo de las especies
restantes. Para funcionar de esta manera incluyen compuestos
químicos específicos o requieren condiciones físicas especiales
(temperatura, pH).
Ej.: agua peptonada alcalina favorece el desarrollo de Vibrio cholerae
tolerante a pH alto e inhibe otros microorganismos presentes en la
misma muestra; caldo selenito contiene selenito de sodio que favorece
la proliferación de especies como Salmonella y Shigella pero inhibe
otras enterobacterias; caldo EC a 44.5°C, una temperatura que
favorece a Escherichia coli y no a otras bacterias.
- Medios selectivos: son medios sólidos que de manera
parecida a los anteriores, permiten el desarrollo de ciertos
microorganismos e impiden el desarrollo de otros. La selectividad se
logra alterando las condiciones físicas del medio de cultivo o agregando
compuestos químicos inhibidores. Ej:
- cambiando pH: para favorecer el desarrollo de Lactobacillus, un
género implicado en la producción de yogur, se puede agregar ácido
acético a los medios de cultivo para obtener un pH final de 5.4,
totalmente inadecuado para muchas bacterias acompañantes.
- altas concentraciones osmóticas: en agar manitol salado con una
concentración de NaCl de 7.5% muy pocas bacterias pueden crecer,
salvo las que presenten una elevada tolerancia a NaCl, como
Staphylococcus aureus
- agregando antisépticos: colorantes como verde brillante, cristal
violeta y eosina, se utilizan para inhibir gérmenes Gram positivos
mientras los Gram negativos desarrollan sin dificultad. Las sales biliares
se usan con el mismo propósito.
- agregando antibióticos: en Ingeniería Genética es práctica rutinaria
la inclusión de antibióticos (ampicilina, tetraciclina) en los medios de
cultivo para poner en evidencia la presencia de bacterias
genéticamente manipuladas. Estas células son resistentes a uno o más
antibióticos y pueden desarrollar en un medio que los incluye, mientras
las células acompañantes, sensibles a los antibióticos, no pueden
crecer. En Microbiología Clínica, se usan antibióticos de espectro de
acción reducido que inhiben o destruyen microorganismos cuyo estudio
no interesa, a la vez que no afectan los gérmenes que se están
investigando.

-Medios diferenciales: permiten demostrar características

metabólicas de un determinado grupo de microorganismos. Por ej.:
puede el germen A utilizar glucosa por una vía fermentativa? Si
agregamos glucosa a un medio de cultivo sólido y un indicador de pH
que indique por cambio de color si el azúcar ha sido fermentado o no,
estaremos analizando una característica metabólica de A. Existen
medios diferenciales donde se pueden detectar varias características
metabólicas distintas. La clave es incluir en la fórmula del medio de
cultivo a usar: , el sustrato adecuado para la característica metabólica
que se desea estudiar y un sistema indicador que refleje por variación
de color u otro fenómeno perceptible, los cambios que hayan tenido
lugar. Las pruebas bioquímicas que veremos en los Trabajos Prácticos
son claros ejemplos de medios de cultivo diferenciales.

-Medios de transporte: se usan cuando se transcurre cierto

tiempo entre la toma de una muestra y su procesamiento. Incluye
compuestos que aseguran la supervivencia de las células hasta que
sean sembradas en un medio de cultivo adecuado.

IMPORTANTE: un gran número de medios de cultivo tienen funciones

mixtas. Ej.: puede ser enriquecido porque lleva sangre y selectivo
porque incluye algún antibiótico. Puede ser selectivo porque incluye
inhibidores y diferencial porque pone en evidencia propiedades
metabólicas.

EJERCICIOS DE APLICACIÓN
 1. Para un microorganismo fotoautotrofo mencione qué componentes
tendría en cuenta para diseñar un medio de cultivo químicamente
definido o sintético que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de energía:
- fuente de nitrógeno:

2. Para un microroganismo quimioorganotrofo qué componentes

tendría en cuenta para diseñar un medio de cultivo complejo o
químicamente indefinido que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de nitrógeno:
- fuente de energía:
3. En el Trabajo Práctico tendremos ocasión de preparar algunos de los
siguientes medios de cultivo:
a) Caldo nutritivo
Extracto de carne………. 0.3 g a.1. Qué aporte realiza
cada componente?
Peptona de carne ………. 0.5 g a.2. Si no hay hidratos
de carbono, qué componente aporta C?
NaCl ……………………………. 0.5 g a.3 Cuál es la fuente
de energía en el medio de cultivo?
Agua destilada…………. 100 ml a.4. Clasifique este
medio por su consistencia, origen y composi-
pH: 7- 7.2 ción. Qué clase de
microorganismos –según fuente de C y
energía- crecerían en él?
b) Agar nutritivo
Extracto de carne………. 0.3 g b.1. Qué aporte realiza
cada componente?
Peptona de carne ………. 0.5 g b.2. Qué componente
aporta los factores de crecimiento?
NaCl ……………………………. 0.5 g b.3 Cuál es la fuente
de energía en el medio de cultivo?
Agar ………….………………… 1.5 g b.4. Clasifique este
medio por su consistencia, origen y composi-
Agua destilada……………. 100 ml ción. Qué clase de
microorganismos –según fuente de C y
pH: 7 -7.2 energía- crecerían en él?

c) Medio BW3
 K2HPO4 ……………... 0.25 g c.1. Mencione fuente
de carbono y fuente de nitrógeno
CO2 …………………… burbujeo constantec.2 Cuál sería la fuente
de energía?
MgSO4 ……………... 0.0375 g c.3. Por su consistencia y su
origen, cómo clasificaría este medio?
Na2MoO4…………... 2.5 x 10-3 g c.4. Para qué clase de
gérmenes –según fuente de C y de energía-
NaVO3 …………….. 1.24 x 10-4 g sería adecuado?
KNO3 …………………. 1 g
Agua destilada…… 1000 ml

d) Cuál de los siguientes componentes agregaría a un medio de cultivo

común para convertirlo en un medio enriquecido?
- agua destilada -penicilina -suero fetal
bovino -colorantes
- sangre de oveja -leche -extracto proteico
de cianobacterias
-sales biliares -antisépticos -yema de huevo
-agar

e) Se desea propiciar el desarrollo de un grupo A de microorganismos

quimioorganotrofos, acidófilos y resistentes a penicilina, incluidos en
una población mixta formada por los grupos A, B y C. Los grupos B y C
pertenecen a flora acompañante.
e.1. Qué medio de cultivo sería más adecuado para lograr ese
propósito? (marque la/s respuesta/s correcta/s)
- un medio de transporte - un medio enriquecido
-un medio de enriquecimiento - un medio selectivo
-un medio sólo diferencial
e.2. Diseñe un medio de cultivo complejo semisólido que incluya una
fuente de C, una fuente de energía, una fuente de N y factores físicos
y/o químicos que favorezcan sólo el desarrollo del grupo A.