CROMATOGRAFA

Cromatografa: en papel, capa fina y columna.

1 Cromatografa Historia y aplicaciones de la cromatografia El descubrimiento de la cromatografa se debe a Michael Tswett, botnico ruso, que en 1903 logr separar, en una columna de carbonato clcico, una mezcla de pigmentos vegetales en ter de petrleo. Luego, la cromatografa permaneci prcticamente ignorada hasta 1931, en que Kuhn y Lederer introdujeron el mtodo en la qumica sinttica de los colorantes, carotenoides, etc. Actualmente no se puede prescindir de este mtodo analtico; y las mltiples aplicaciones daran una lista interminable. Entre ellas, se pueden destacar las separaciones de: alcaloides (morfina, codena, nicotina, quinina, etc.), aminocidos (glicina, tirosina, serina, alanina, etc.), vitaminas y hormonas, deteccin de insecticidas, etc. 1.1 Definicin Cromatografa es la tcnica de separacin de mezclas de sustancias, basada en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los componentes, a travs de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. Se trata de un sistema analtico de gran importancia en el laboratorio y tambin de empleo en la industria, especialmente como separacin de sustancias orgnicas complejas: vitaminas, protenas, clorofilas, hidrocarburos, colorantes, etc. Tiene tambin gran aplicacin en farmacia y bioqumica. El trmino cromatografa, literalmente quiere decir: escribir en color puesto que en la separacin se obtienen unas bandas coloreadas fciles de reconocer y de detectar. 1.2 Fase mvil y fase estacionaria En un ensayo cromatogrfico hay una materia soporte, denominada fase estacionaria y un disolvente o eluyente capaz de separar los componentes de la mezcla, llamada fase mvil. Aunque se emplea indistintamente la denominacin de disolvente y eluyente, cabe diferenciar estos dos conceptos en cromatografa. Es disolvente, cuando se trata del compuesto capaz de disolver la muestra objeto de anlisis, y eluyente el compuesto que arrastra a los componentes del anlisis sobre el papel de filtro o a travs de la columna cromatogrfica.

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1.3 Cromatograma Es la separacin en una serie de franjas coloreadas obtenidas de una sustancia al adsorberla o repartirla en un medio adecuado. La sustancia, al ponerse en contacto con la fase estacionaria y tratarla luego con un reactivo eluyente, da una gama de puntos o franjas coloreadas, correspondientes a los distintos componentes que formaban el producto objeto del anlisis. El cromatograma obtenido, generalmente, se compara con uno patrn para conocer las posibles impurificaciones o desviaciones del producto en cuanto a su comportamiento ideal. 1.4 Polaridad de las sustancias qumicas La polaridad indica la separacin de cargas elctricas dentro de la molcula, o el carcter inico de sta. En general: Compuestos inicos Compuestos covalentes con cierto carcter inico Compuestos covalentes Compuestos coordinativos Muy polares. Algo polares. No polares. Polares.

Las molculas pueden, al mismo tiempo, poseer polaridad, si hay desigual distribucin de electrones en la misma, o si no poseen simetra.

H -O + H
Agua: Polar

H H H H H H H-CCCCCC-H H H H H H H

Hexano: No polar

La expresin de polaridad, aplicada especialmente a cromatografa de adsorcin se presta a confusiones por tener dos acepciones distintas: a) En cuanto a las sustancias a cromatografiar: Un compuesto polar es el retenido en la fase estacionaria, mientras que un compuesto no polar tiende a desplazarse en la fase mvil. No polar: Hid. saturados Hid. no saturados Esteres Cetonas Aldehdos Aminas Alcoholes Acidos

Aumenta su grado de retencin en la fase estacionaria al bajar en la lista.

Polar:

b) En cuanto al eluyente empleado: Un compuesto polar desplaza muy bien los compuestos a lo largo de la columna, papel de filtro o capa fina; mientras que un compuesto no polar desplaza a muy pocos compuestos a travs de la columna. NOTA:(Segn bajamos en la lista, aumenta su poder de desplazamiento de los compuestos a travs de la columna)

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No polar:

Hexano Heptano Ciclohexano Tetranitrotolueno Tetracloruro carbono Benceno Tolueno Tetracloroetileno Alcohol octlico Cloroformo Eter etlico Bromuro de etilo Piridna Acetona Propanal Etanal Metanal Glicerina Amonaco Agua Alcoholes Bases con agua Muy polar: Mezclas de cidos 1.5 Constantes cromatogrficas

El movimiento relativo de una sustancia respecto al disolvente (Rf) en un sistema cromatogrfico dado es constante y caracterstico de la sustancia.

Rf =

distancia recorrida por la sustancia ; distancia recorrida por el eluyente

R f ( A) = a ; x R f ( B) = b x

Si el frente del disolvente sale fuera del papel, se expresa el movimiento de una sustancia por comparacin con el de otra.

Rx =

distancia recorrida por la sustancia distancia recorrida por la sustancia estndar X

1.6 Tipos de cromatografa En este curso se estudiarn los tipos de cromatografa sobre papel, columna y capa fina.

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1.7 Cromatografia de adsorcin Este tipo de cromatografa tiene lugar por un proceso de adsorcin, fenmeno superficial que produce la separacin de los componentes de una mezcla, al ser ms intensamente absorbidos unos que otros en una sustancia adsorbente. En este tipo de cromatografa, la fase estacionaria (adsorbente) es un slido y la fase mvil (eluyente) puede ser un gas o un lquido. Los adsorbentes, por orden de mayor a menor poder adsortivo, son: Almina activada. Gel de slice activada. Magnesia. Carbonato clcico. Carbonato potsico. Carbonato sdico. Talco. Inulina. Azcar, almidn. Los eluyentes ordenados de menor a mayor poder de eleccin pueden consultarse en el apartado 1.4 de polaridades. 1.8 Cromatografia de reparto Se basa en la separacin de una mezcla de sustancias mediante el reparto existente entre la fase mvil y la estacionaria, soportada sobre un lquido adecuado. El eluyente puede ser un lquido o un gas. Las sustancias se reparten de acuerdo con la ley del reparto, entre la fase estacionaria y el eluyente que la arrastra:

Coeficiente del reparto = C A en B C A en C

Concentracin de la sustancia en el disolvente Concentracin de la sustancia en el soporte

K=

Los soportes ms utilizados son: - Celita o Kieselgur (tierra de diatomeas, formada por millones de animales microscpicos). - Papel de filtro. 2 Cromatografa de papel Es una de las tcnicas cromatogrficas ms simples y ms antiguas. La separacin se lleva a cabo sobre tiras u hojas de papel de filtro (generalmente Whatmann nmeros 1 y 3). El papel de filtro est formado por numerosas fibras de celulosa, que portan un cierto porcentaje de humedad. La separacin tiene lugar al repartirse (cromatografa de reparto) las sustancias entre la humedad de las clulas y el flujo de disolvente sobre ellas. 2.1 Eleccin del eluyente - Si no se conocen las sustancias a separar: Se consultan las tablas de polaridad de disolventes. Cuanto ms prximos son los eluyentes, ms similares son sus miscibilidades con la fase estacionaria dada y ms parecidos los valores del Rf en la prctica. -Si se conoce la frmula emprica de la sustancia ensayada: Se calcula la relacin: Carbono/oxgeno.

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Si existen tomos de nitrgeno, cada uno equivale a dos tomos de oxgeno y se desprecia el azufre. En la tabla siguiente se indica, segn la relacin carbono-oxgeno, el eluyente a emplear. Eluyente a emplear Butanol-norma Eter etlico Cloruro de metileno Ciclohexano 2.2 Aparatos empleados. - Micropipeta: Puede construirse un tubo de vidrio estirado por calentamiento a la llama. - Soportapapeles: Hay gran variedad de modelos, que consisten en hacer ms fcil el soporte del papel de filtro, antes y despus de la impregnacin. - Cubetas: De vidrio y con tapa. Algunos tipos especiales llevan, en la parte superior, algn artificio para colgar fcilmente los papeles. 2.3 Tcnica del anlisis Relacin C/O2 en la muestra 1-2 : 1 2-3 : 1 3-5 : 1 5-15 : 1

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- En disco de papel. En el centro de un disco de papel de filtro se ponen dos gotas de la sustancia a separar y se hace llegar hasta l el eluyente, por capilaridad, adsorbindolo con una mecha de celulosa o del mismo papel. El eluyente arrastra en distinta medida a las sustancias, provocando unas bandas concntricas coloreadas, que demuestran el fraccionamiento de los componentes. - En tiras de papel Tambin puede efectuarse el cromatograma en tiras de papel de filtro dobladas, impregnndolas con pequeas gotas de la disolucin a separar y, luego, introducindolas en un eluyente a fin de desplazar las bandas en forma ascendente. - En hojas de papel de filtro Es el mtodo ms utilizado para desarrollar cromatogramas sobre papel. Las muestras disueltas se aplican sobre el papel, mediante un tubo capilar o un hilo de platino en la posicin apropiada. Las manchas sobre el papel no deben sobrepasar los 5 mm de dimetro, ya que manchas superiores conducen a peores separaciones. Es conveniente secar la mancha, despus de cada aplicacin, lo que puede hacerse con un secador de pelo. 2.4 Elucin y secado del papel Una vez se han secado las manchas sobre el papel se introducen en un recipiente con el eluyente; el papel puede colocarse suspendido mediante algn artificio de agarre o bien enrollado en forma de cilindro. El eluyente debe quedar por debajo de las manchas o lneas marcadas, se tapa la cubeta para saturar la atmsfera y se espera a que emigre hasta pararse o llegar al extremo superior del papel. Cuando el eluyente ha recorrido la distancia requerida se sacan los papeles de la cubeta, se seala el frente del mismo. El papel se seca en una estufa, con ventilador o con un secador de pelo. 2.5 Revelado del cromatograma Una vez el papel seco, ya queda listo para el revelado de los productos y su posicin en el cromatograma.

Si las sustancias son coloreadas, no existe dificultad, pero si las bandas resultan incoloras se localizan mediante el empleo de una lmpara de rayos ultravioleta que provoca fluorescencia con gran cantidad de componentes incoloros a la luz ordinaria. As, en los trabajos prcticos con luz U.V. puede

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comprobarse cmo una camisa blanca o pauelo producen fluorescencia por contener blanqueador ptico procedente del detergente de lavado. Si la sustancia no es fluorescente al U.V. se puede rociar con reactivos adecuados, como la ninhidrina al 0,1 %, ampliamente empleada para identificacin de aminocidos y aminas: calor Aminocido + ninhidrina ------ Producto coloreado (incoloro) (incoloro) (azul morado) Otros reactivos de tincin son: Acido fosfomolbdico al 3 % Ftalato de anilina Rodamina-B al 0,25 % Verde de bromocresol al 0,05 % 3 Cromatografa de columna Una columna cromatogrfica consiste en un tubo, en el que se incluyen dos fases, mvil y estacionaria, y se aplica para la separacin de los componentes de una sustancia en franjas coloreadas. Se divide en: Tipo Adsorcin Reparto Fase estacionaria Slido Lquido Fase mvil Lquido Lquido Relleno utilizado Almina, CaO, Mg0 y carbn activo Celulosa, gel de slice y Kieselgur Tincin compuestos reductores Azcares cidos grasos superiores y lipoides cidos y bases

En la cromatografa de adsorcin en columna se debe seleccionar el slido de modo que tenga gran afinidad qumica con las sustancias a cromatografiar. El disolvente o eluyente debe poseer un alto grado de desabsorcin a fin de desplazar los componentes de la columna. En el reparto en columna, los lquidos deben ser inmiscibles y de coeficiente de distribucin o reparto cercano a la unidad. 3.1 Eluyentes empleados Se diferencian segn el tipo de cromatografa a realizar. Para cromatografa de reparto se emplean los mismos que en cromatografa de papel. Para cromatografa de adsorcin: - Con relleno de almina Eluyentes apolares (ter de petrleo) - Con relleno de carbn activo Eluyentes polares (agua) 3.2 Aparatos y tcnica del anlisis - Llenado de la columna Hay gran variedad de modelos de columnas cromatogrficas, incluso pueden construirse en el laboratorio. Se monta la columna con el disco de porcelana y la lana de vidrio,

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se aade el relleno triturado o en forma de papilla (mezcla del adsorbente con el eluyente) y, finalmente, se hace pasar el eluyente seleccionado que, en algunos casos, requiere una succin al vaco. Al final, deben quedar unos 3 cm de disolvente sobre el relleno. - Adsorcin cromatogrfica Se disuelve la mezcla a separar con el disolvente adecuado y se aade sobre el eluyente de la columna. Cuando se ha agotado la disolucin, se aade, de nuevo, eluyente y para revelar la columna obtenindose el cromatograma. 3.3 Revelado del cromatograma - Productos no coloreados Si en la columna no se obtienen franjas coloreadas debe emplearse una tcnica engorrosa y poco precisa para revelarla.

Debe sacarse el relleno de la columna sin estropearlo, mojndolo con eluyente y presionando con un pequeo mbolo y aplicar, presionando sobre el mismo, una tira de papel de filtro. Secar el papel y pulverizarlo con un revelador adecuado que identifique las coloraciones; volver a aplicar el papel, en igual sentido, en el relleno para marcar sobre el mismo las distintas franjas que deben eluirse. - Extraccin de cada franja

Una de las tcnicas de identificacin de cada componente de un cromatograma de columna, consiste en cortar las franjas coloreadas y extraerlas con un disolvente adecuado. Si se requiere, posteriormente, puede analizarse cada componente por medios qumicos o instrumentales. - Empleo del colector de fracciones

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Es la tcnica ms utilizada en este tipo de cromatografa, especialmente si deben efectuarse anlisis rutinarios, puesto que permite una separacin e identificacin ms rpida y eficaz. En el equipo se eluyen las distintas fracciones con disolventes adecuados y se recogen en los tubos colectores. El mecanismo balanza dosificadora-sifn determina el vertido de volmenes fijos del eluyente eliminado de la columna, y mediante el dispositivo elctrico se van cambiando los tubos del tambor giratorio a cada fraccin recolectada. Una vez recogidas las fracciones, debe analizarse el contenido de cada uno de los tubos.

Cromatografa en capa fina (CCF)

1 Cromatografa en capa fina La cromatografa en capa fina (CCF) es un mtodo de anlisis que aplica, sobre adsorbentes, la tcnica y ventajas de la cromatografa sobre papel y de la cromatografa en columna. Su tcnica de aplicacin es muy parecida a la de papel, pero dispone de ms medios de revelado y su tiempo de fraccionamiento es mucho ms corto. El utillaje necesario es simple, de fcil manejo y bajo costo. La gran rapidez y variedad de aplicaciones hacen de la CCF un medio de anlisis ideal para la enseanza. 1.1 Equipo bsico La CCF se basa en la preparacin de unas placas de vidrio recubiertas con una capa del adsorbente. Los utensilios indispensables son: - Bancada para soportar las placas de vidrio a igual nivel. - Placas de vidrio de medidas entre un portaobjetos de 20 x 20 cm. - Revestidor o extensor para recubrir las placas de vidrio con un espesor constante de adsorbente. - Cubetas o cmaras de revelado, de forma rectangular, con fondo plano y tapa. - Bastidor, con carriles, para colocar las placas de forma que puedan secarse al aire o en estufa. - Plantilla de plstico con puntos marcados para aplicacin de muestras cada 10 mm. - Micropipetas para aplicacin de pequeas cantidades de lquido (0,005 y 0,010 cc). - Pulverizador para dispersar lquidos de revelado. 1.2 Adsorbentes, disolventes y eluyentes En la CCF puede emplearse una gran variedad de medios de adsorcin con tal que presenten un tamao de grano uniforme y sea adherente sobre la placa de vidrio. Los ms corrientes son: - Gel de slice. - Oxido alumnico. - Polvo de celulosa. - Kieselgur o tierra de diatomeas. Los disolventes son aquellas sustancias elegidas para solubilizar, lo mximo posible, la sustancia a cromatografiar.

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Los eluyentes son utilizados para desplazar y separar los componentes de cada mancha en la placa cromatogrfica. Los eluyentes seleccionados dependen de la naturaleza del compuesto a separar y de las sustancias empleadas para tal separacin. Debe tenerse en cuenta que los eluyentes polares producen una migracin ms intensa que los no polares. Como regla general se emplearn:

Para la eleccin del eluyente es conveniente hacer un tanteo previo, colocando una serie de manchas de la muestra a analizar y aplicando, en el centro de cada una, los eluyentes escogidos. Luego, se seleccionar el que realice unas manchas radiales ms ntidas. Una clasificacin de eluyentes por polaridad se indica, a continuacin:

Puede graduarse la polaridad del eluyente, aadiendo a un disolvente no polar una pequea cantidad de disolvente polar (de 1 al 10 %). 2 Tcnica del anlisis 2.1 Revestimento de placas Las placas de vidrio deben limpiarse y desengrasarse por inmersin, en mezcla crnica, o por frotamiento con alcohol. Tambin puede efectuarse con detergente y posterior lavado con agua caliente. Se prepara el soporte pesando una cantidad de adsorbente en un erlenmeyer y se aade la cantidad correspondiente de agua, hasta obtener una papilla que fluya fcilmente del recipiente. El agua a aadir vara con el tipo y clase de adsorbente, siendo, en algunos casos, en la proporcin de dos partes de agua y una de adsorbente. Se aplica la papilla con el extensor sobre las placas y se dejan en reposo algunos minutos. Se pasa al bastidor y se introducen en estufa, a unos 100-105 C, para activarlas durante una hora y expulsar el agua. Tambin pueden dejarse en reposo al aire libre, durante toda la noche.

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El espesor de la capa suele ser de 0,25 a 0,50 mm. 2.2 Aplicacin de las muestras Las muestras a analizar se disuelven, generalmente, en un disolvente orgnico no polar, de bajo punto de ebullicin, para facilitar su rpida evaporacin y en concentracin de 1 % aproximadamente. Se aplican sobre la lnea de base con una microppeta y se deja evaporar el disolvente. Pueden aplicarse varias gotas sobre la misma mancha, dejando evaporar entre cada aplicacin. Para comparacin, suelen aplicarse gotas de sustancia patrn a igual altura y sobre la misma placa con el fin de reconocer los componentes de la mezcla. 2.3 Desarrollo de las placas El desarrollo de las placas se lleva a cabo colocando una o varias de ellas en una cubeta de vidrio con tapa y con el fondo cubierto hasta unos 0,5 a 1 cm, con el eluyente adecuado. En la pared interior de la cubeta se colocar un papel de filtro mojado con el eluyente, a fin de disponer de un ambiente saturado. Cuando el eluyente haya ascendido unos 10 cm del origen de las manchas, se marca el frente del disolvente, con un lpiz puntiagudo, y se deja evaporar unos minutos al aire libre. 2.4 Revelado de las placas Si las sustancias separadas no son coloreadas o directamente visibles con luz ultravioleta, pueden hacerse visibles por alguno de los mtodos siguientes: - Revelado con vapores de yodo. Se introduce el cromatograma en una cubeta de vidrio que contiene unos cristalitos de yodo en el fondo y se deja algunos minutos. El yodo se concentra en los puntos de los componentes y aparece una mancha marrn sobre fondo amarillento. - Rocindolo con cidos enrgicos, como cido sulfrico o fosfrico. La pulverizacin se lleva a cabo con un pulverizador de vidrio y una pera u otros sistemas. Las placas con capas finas pueden fotografiarse o copiarse directamente sobre papel fotogrfico con la ventaja de poderse archivar. En el cromatograma pueden calcularse los valores de Rf y RX. 2.5 Cromatoplacas y cromatofolios - Las cromatoplacas son placas prefabricadas con capas uniformes y homogneas de gel de slice, celulosa a xido de almina. Son de una gran rapidez de utilizacin y fabricadas con gran precisin; el nico inconveniente es su elevado coste. - Los cromatofolios consisten en una placa de polister (tereftalato de etileno) recubierta de una capa de material adsorbente de espesor aproximado de 0,1 mm y aglomerado con alcohol polivinlico.

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Con el use de estas preparaciones se evita la compra del extensor y almacenaje de placas. 2.6 Cromatografia analtica y preparativa - La CCF preparativa se desarrolla con mayores espesores de adsorbente, placas de grandes dimensiones y muestra aplicada en lnea. Una vez reveladas las manchas que interesan se barre el rea con una esptula y se extrae en un Soxhlet la sustancia del polvo mediante disolventes. Si se trata de cromatofolios se corta con unas tijeras la banda revelada y se extrae como en el caso anterior. El componente extrado se identificar por otras tcnicas (colorimetra, espectrometra, valoraciones, etc.) - La CCF analtica se realiza aplicando un volumen conocido de la muestra y otro de sustancia patrn a la placa y desarrollando y recuperando los componentes por el sistema de la extraccin, anteriormente descrito. CUESTIONARIO Y PROBLEMAS 1. Define los vocablos: eluyente, disolvente, adsorcin, polaridad, reparto y cromatografa.. 2. Cmo se elige el eluyente a emplear en un ensayo cromatogrfico sobre papel y cundo se trata de cromatografa sobre columna. Un eluyente puede ser un disolvente? 3. Indica si son verdaderas (V) o falsas (F) las afirmaciones siguientes: a) La cromatografa slo se puede Llevar a cabo en compuestos coloreados. b) Un eluyente polar desplaza fcilmente los compuestos a travs de la columna cromatogrfica. c) Una sustancia polar es difcilmente arrastrada a travs de una columna cromatogrfica. d) En la cromatografa de reparto nunca intervienen slidos. e) La cromatografa sobre papel es de reparto. f) La cromatografa es una tcnica muy adecuada para determinaciones cuantitativas de compuestos orgnicos. 4. En un ensayo cromatogrfico sobre papel se ha obtenido el cromatograma de la figura. A partir del mismo, determinar los parmetros o constantes cromatogrficas: Rf (A) y Rf (B). 5. Indica, comparativamente, los sistemas de revelado aplicados a cromatografa sobre papel, columna y capa fina. 6. Explica las tcnicas a seguir para llevar a cabo un anlisis cuantitativo, a partir de una separacin cromatogrfica, ya sea sobre papel columna o capa fina. 7. En un ensayo previo para separar una mezcla de colorantes se ha seleccionado una serie de eluyentes para determinar el ms apropiado. Atendiendo a los resultados de la figura. Cul crees que es el eluyente ms adecuado para emplear en la separacin? Qu orden rige la polaridad de los eluyentes empleados?

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PRCTICAS DE CROMATOGRAFA
Objetivos de la prctica: El conocimiento de la tcnica cromatogrfica y su aplicacin en la separacin e identificacin de compuestos. Material y productos Material: Material general, cromatorrollo, tarros hermticos, tubos capilares, columna de vidrio para cromatografa en columna, papel de filtro, lana de vidrio o algodn. Productos: Gel de Slice. Almina. Violeta cristal. Verde malaquita. Azul de metileno. Tinta parda.. Etanol 95%. Butanol. Hidrxido amnico 2 N. Parte experimental 1. Cromatografa en capa fina. 1.1. Preparacin de las placas. Usaremos cromatorrollo Sepracin de colorantes por cromatografa en capa fina. Los compuestos a separar son los componentes de las tintas (la tinta parda es una buena mezcla). El adsorbente que se utiliza es gel de slice. E1 disolvente est formado por una mezcla de butanol-etanol-hidrxido amnico 2 N (6:2:2). 2. Cromatografa en columna En una columna de unos 1,8 x 30 cm se coloca un trozo de algodn o lana de vidrio, en la parte inferior, fijndolo con una varilla pero sin apretar demasiado. Entonces, lentamente y homogeneizando, se va agregando el adsorbente que se quiere utilizar hasta que alcance la altura requerida en cada cromatografa. Cuando la operacin de relleno ha concluido se coloca un disco de papel de filtro del mismo tamao que el dimetro interno de la columna. A continuacin se va agregando el disolvente a la columna hasta que quede ligeramente por encima del disco (esto se puede regular, abriendo o cerrando la llave de la columna). En estas condiciones, se agrega la mezcla de compuestos con rapidez y lo ms concentrada posible. Se deja que se adsorba totalmente en la parte superior de la columna. Se empieza a aadir disolvente, lentamente para no deformar el frente, y se procede a la elucin (separacin) de los compuestos. E1 disolvente y los componentes eluidos se van recogiendo en tubos de ensayo. Del anlisis de las coloraciones presentes en los mismos se pueden sacar conclusiones sobre la separacin de los compuestos. 2.1. Separacin de pares de colorantes utilizando agua como disolvente. La columna cromatogrfica se prepara como se ha descrito anteriormente, utilizndose como adsorbente, almina, que se aade a la columna en forma de papilla con agua templada que es lo que se emplea como disolvente. La mezcla de compuestos a separar se obtiene disolviendo 0.1 g de violeta cristal y 0.1 g de verde malaquita en 100 ml de agua, 5 gotas de esta mezcla se colocan en la parte superior de la columna y se eluye con agua. Como ya se explic anteriormente, el disolvente y los compuestos eluidos se recogen en tubos de ensayo. 1.2.

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2.2.

Separacin de pares de colorantes utilizando Etanol de 96como disolvente.

Reactivos: Almina activada para cromatografa en columna, Etanol de 96, Agua destilada, Disolucin de cido actico al 10%, Mezcla de colorantes a separar
(Disolucin alcohlica de anaranjado de metilo y azul de metileno) Mtodo experimental a) Se toma la columna para cromatografa y se monta en el soporte con ayuda de la pinza y la nuez doble. b) Se llena el embudo de decantacin de 100 cc. con etanol de 96 y se coloca en el soporte con ayuda de otra pinza u otra nuez doble, de forma que el embudo permita el llenado de la columna. c) Se toma un vaso de precipitados y se aade almina activada en cantidad correspondiente a la altura de 2/3 como mximo del total de la columna. Esta operacin se puede hacer, aadiendo previamente la almina a la columna hasta la altura deseada y despus volvindola al vaso de precipitados. d) A1 vaso de precipitados que contiene la almina activada, le aadimos a continuacin etanol en cantidad suficiente para producir una papilla fluida. Se agita con la varilla de vidrio hasta conseguir homogenizarla. e) En el momento est la papilla homogeneizada, se aade inmediatamente dentro de la columna. f) Se abre la llave de la columna y se coloca el vaso de precipitados debajo, para recoger el eluyente que vaya cayendo. g) Se coloca el embudo de decantacin con ms eluyente en la parte superior de la columna y se abre la llave del embudo, dejando caer gota a gota etanol sobre la pared de la columna procurando que el rgimen de cada del embudo sea el mismo que el rgimen de cada de la columna, con e1 fin de que sta no se llene excesivamente, pero tampoco se quede seca de eluyente. El volumen de eluyente que haya en el interior de la columna, debe ser unos 2 cm. por encima de la almina. h) Se miden 5 cc. de la mezcla de colorantes y se aaden a la columna gota o gota por las paredes. i) Podremos observar como el color azul, avanza hacia la parte inferior de la columna, mientras que el amarillo se queda en la parte superior. j) Cuando se observe que el color azul llegue a la parte inferior de la columna, se sustituye el vaso de precipitados por un tubo de ensayo, para recoger las fracciones del azul de metileno. Tubo de ensayo que vamos cambiando a medida que se va llenando. k) Terminado de pasar todo el azul de metileno, cosa que podremos ver cuando la fraccin recogida en el tubo, de ensayo sea incolora, se vuelve a colocar el vaso de precipitados para recoger el etanol, y se aaden a la columna 3 gotas de disolucin de cido actico, pudiendo observar como el anaranjado de metilo, cambia de color de amarillo a rojo y empieza a arrastrarse con el eluyente. l) En el momento en que llegue a la salida de la llave de la columna el anaranjado de metilo, colocamos un tubo de ensayo para recoger las fracciones de ste colorante. m) Habremos separado as, las dos sustancias. Se cierra la llave de la columna y se limpia el material. 3. Cromatografa en papel. Realizar en papel la CCF del apartado 1. Experimentar con otros eluyentes y otras proporciones de eluyentes.