Métodos Cromatográficos

Métodos cromatográficos.
Métodos variados de separación de mezclas se conocen como

cromatografía. Según la definición dada por Keulemans la cromatografía es
un método de separación en el que los componentes a desglosar se
distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un lecho
estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a
través o a lo largo del lecho estacionario.
La cromatografía se introduce en los métodos de separación en 1903 y su

posterior desarrolló y evolución se produce hacia 1930. La primera persona
que definió la cromatografía fue el botánico ruso Miguel Tswett (1872-1913)
en 1906 y eligió el término cromatografía procedente de las palabras griegas
khromatos (color) y graphos (escrito) ya que utilizó el término cromatografía
para describir la separación de pigmentos vegetales en distintas zonas
coloreadas. Aunque la mayor parte de las separaciones que se realizan
actualmente son de compuestos incoloros, el término inicial cromatografía se
ha mantenido.
Definición de cromatografía
En 1906 Tswett definió la cromatografía como:
Método en el cual los componentes de una mezcla son separados en una

columna adsorbente dentro de un sistema fluyente.
Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía de forma más amplia

como:
Método usado principalmente para la separación de los componentes de una

muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de
las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria
puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz).
La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en
una capa, distribuida como una película, etc...
Se utiliza el término general de lecho para definir las distintas formas en que
puede encontrarse la fase estacionaria. Las separaciones cromatográficas se
consiguen mediante la distribución de los componentes de una mezcla entre
la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza
cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra,
que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. las retenciones
mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que
se dan entre las dos fases y que pueden ser :
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1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los
puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno
a la superficie que separa las fases o superficie interfacial.
2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de

una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la
primera, absorción pura, o a reaccionar químicamente con la misma,
absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno
másico y no superficial.
Aspectos históricos de la cromatografía
Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones

pasan a través de arcilla, rocas, etc... la cromatografía como tal adquiere
importancia cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas,
descubrió que los cationes orgánicos se separaban por migración cuando se
depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como
papel.
En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía en columna para

separar extractos vegetales coloreados, y a este proceso le dió el nombre de
cromatografía. Pero el mayor desarrollo se produce en 1930 con Lederer
cuando consigue separar los colorantes de la yema de huevo.
Posteriormente los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la
cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica, y obtienen el
premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.
A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial

de forma que en 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en
cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elución y desarrollo por
desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948.
Al mismo tiempo la cromatografía se aplicaba en el campo de la bioquímica,

y así Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados.
Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía.
Cromatografía en papel
Fue desarrolla por Martin. Tiene como soporte un papel de celulosa. Adquirió
una gran extensión por su sencillez y presenta la ventaja de poder utilizar
miligramos y microgramos, además presenta la opción de utilizar tanto la
técnica descendente ( en columna, etc...) como la técnica ascendente.
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Cromatografía en capa fina
Fue originada por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y

Schraiberen en 1938 al separar mezclas de tinturas farmacéuticas. En este
tipo de cromatografía la fase estacionaria se extiende sobre un soporte
inerte, la dificultad que presentaba el método era el crear una capa
homogénea, sin ningún tipo de rugosidad. La cromatografía en capa fina tuvo
valor limitado hasta que Stahl estandarizó el método para elaborar capas
finas por métodos mecánicos.
Cromatografía de intercambio iónico
Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial y en principio tenía la

finalidad de separar las tierras raras y los elementos de transición. En 1938
Taylor y Urey utilizan este método para separar isótopos de Litio y Potasio
utilizando resinas de zeolita. En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de
intercambio iónico.
Cromatografía de gel-filtración
Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles
se consigue separar polímeros sintéticos de alto peso molecular.
Cromatografía de afinidad.
Ideada por Porath en 1967, usando como fuente un péptido o proteína unida
covalentemente a un ligando y se utiliza para la separación de moléculas
proteicas.
Cromatografía de gas.
Es una de las técnicas más utilizadas e importantes, de forma que ha

revolucionado el campo de la química analítica.
Clasificación de los métodos cromatográficos

Clasificación según el procedimiento de separación
El principio básico de la separación de las sustancias que componen una

mezcla se fundamenta en una serie de sucesivos equilibrios entre la fase
estacionaria y la fase móvil. El equilibrio dependerá de la partición o diferente
adsorción que tengan la fase estacionaria y los componentes de la mezcla.
La diferencia dependerá de las propiedades físicas y químicas de los

componentes. El mayor o menor avance en el sistema cromatográfico
dependerá de la afinidad del componente y la fase estacionaria. El

componente con menor afinidad por la fase estacionaria en presencia de una
fase móvil llamada eluyente será eluido en primer lugar, y por tanto se
desplazará con mayor velocidad por el sistema cromatográfico.
Tabla de clasificación de métodos cromatográficos
F. F. móvil Soporte Cromatografía Siglas

estacionaria
sólido gas columna sólido-gas G.S.C / G.C
(adsorción) líquido columna líquida C.L / H.P.L.C
capa fina en papel y/oT.L.C
capa fina
líquido gas columna líquido-líquido C.G.L
(partición) liquido columna gas-líquido C.L.L / H.P.L.C
resina líquido columna intercambio
(intercambio iónico
iónico)
gel líquido columna filtración de gel
(filtración en )
*H.P.L.C : cromatografía líquida de alta presión.
Clasificación según el proceso de desarrollo
Según el procedimiento en que se desarrolla se utiliza la siguiente

clasificación, que fue la usada por Tiselius en 1940:
• Desarrollo por elución.

• Desarrollo por desplazamiento.
• Análisis frontal.
Desarrollo por elución
Representa el concepto básico de la separación cromatográfica y es la

técnica más usada en los distintos métodos cromatográficos (gaseosa,
líquido-gas, líquido-líquido, sólido-líquido). Para describir esta técnica
considérese una mezcla de sólo dos componentes. Dicha mezcla se
introduce en el extremo superior de una columna adsorbente y sus
componentes se separan en zonas, al pasar uno o más eluyentes a través de
la columna, debido a las distintas afinidades entre los componentes y ambas
fases.
La fase móvil es adsorbida débilmente por la fase sólida estacionaria. Este

ideal teórico de desarrollo por elución no siempre se consigue en la práctica.
Es un método analítico esencial.

Desarrollo por desplazamiento
Consiste en desarrollar con un disolvente que sea adsorbido por la fase

estacionaria con mayor fuerza con que adsorbe a los componentes de la
mezcla, al contrario que el desarrollo por elución. A medida que el disolvente
pasa a lo largo de la columna, desplaza a la mezcla, que al mismo tiempo se
separa parcialmente.
Parte del material menos fuertemente adsorbido se recupera de forma pura,

seguido por una mezcla (interfase) y seguido posteriormente del otro
componente en forma pura. Es un método preparativo útil.
Análisis frontal
Consiste en la aplicación continua de una mezcla en el origen. En principio el

componente menos fuertemente adsorbido fluye a lo largo de la columna,
mientras que el más fuertemente adsorbido se acumula cerca del origen. Sin
embargo existe un límite en la capacidad del adsorbente y, cuando este
límite se alcanza, también el componente más fuertemente adsorbido
empieza a desplazarse a lo largo de la columna. Por esto, las primeras
fracciones contendrán el material menos fuertemente adsorbido; más tarde
aparecerá una mezcla de ambos componentes. Es una técnica preparativa
más que analítica.
Consideraciones teóricas y parámetros

cromatográficos
La cromatografía es un sistema de separación dinámica, porque
contínuamente se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a
separar y las fases móvil y estacionaria.
La fase estacionaria consiste en partículas, generalmente sólidas, pequeñas

y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio
desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o
extendida en forma de capa. En ocasiones es necesario un tratamiento
químico de la fase estacionaria para conseguir unas partículas de tamaño y
poro adecuados.
La fase móvil puede ser un líquido o un gas, y su función es transportar a los

componentes de la mezcla a través del sistema cromatográfico.
En el proceso de separación se produce una competición entre la fase móvil

y la fase estacionaria por el componente, y a este proceso se le denomina
partición del componente distribuido entre las dos fases. Es decir, se

establece un equilibrio entre la concentración del componente presente en la
fase móvil y la concentración presente en la fase estacionaria.
El coeficiente de distribución de un componente A se define como:
Donde DA es el coeficiente de distribución del componente A, y [Aest.] y [Amóv.]

son respectivamente las concentraciones del componente A en la fase
estacionaria y en la fase móvil. El valor del coeficiente de distribución es
característico de un componente para una fase estacionaria y una fase móvil
determinadas.
Los métodos cromatográficos actuales más modernos monitorizan la salida

de los componentes y eluyentes, esto se consigue conectando a la salida del
sistema cromatográfico unos aparatos electrónicos, denominados
detectores, que detectan pequeñas cantidades de componentes. Si se
representan los valores de la concentración de esos componentes frente al
tiempo o al volumen de eluyente se obtiene unas curvas Gaussianas
denominadas cromatogramas.
Principales parámetros del cromatograma de picos.
1.- Pico del aire.
Es el que corresponde a la detección de una cantidad muy pequeña de aire

que entra a la columna cuando se introduce la muestra en el cromatógrafo.
2.- La línea de base.
Es la parte del registro que corresponde a la fase móvil pura (gas portador, ).
3.- Altura de pico (h).
Es la distancia entre la cima del pico y la línea de base. En el caso de que el

vértice sea redondeado se trazan rectas tangentes a los dos puntos de
inflexión de las laderas; el punto de corte de las dos rectas determina la
altura del pico. (Ver el cuarto pico de la figura anterior).
4.- Anchura del pico (a).
Es la longitud del tramo de la prolongación de la línea de base, comprendida

entre las intersecciones con la misma de las laderas del pico o, en su caso,
de las líneas tangentes antes mencionadas.

5.- Anchura del pico en la semialtura (ah/2).
Es la distancia paralela a la línea de base, entre las dos laderas del pico,
tomada a la mitad de la altura del pico.
6.- Área del pico (S).
Es la comprendida entre el pico y la prolongación de la línea de base.

Precisamente a obtener el valor de este parámetro, en los picos del
cromatograma, se dedican los dispositivos integradores
Principales parámetros cromatográficos.

1.- Tiempo cero o tiempo de retención del componente inerte (t0).
El tiempo cero (t0) o tiempo muerto (tm), es el tiempo de retención del

componente inerte o gas portador.
2.- Tiempo de retención de un componente (tii).
El tiempo de retención (ti o tR) es el tiempo transcurrido entre el instante en

que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la señal propia del
componente en su máxima intensidad. Los tiempos de retención no son
reproducibles, ni siquiera en una misma columna cromatográfica.
3.- Tiempo de retención corregido de un componente (t'i).
Es le tiempo que transcurre entre la aparición de la sañal que corresponde a

un componente inerte y a la del componenteconsiderado:
t'i = ti - t0
4.- Tiempo de retención relativa (rip).
Es la razón entre los tiempos de retención corregidos del componente

considerado, i, y de otro, p, que se toma como patrón de referencia:
5.- Volumen de retención de un componente (VR).
Es el volumen necesario de fase móvil para transportar el soluto de un

extremo a otro del sistema cromatográfico. Se define como:
VR = tR-Fm

donde VR es el volumen de retención expresado como el producto del
tiempo de retención de un componente (tR) y el flujo de la fase móvil (Fm). Y
el flujo de fase móvil se define como:
donde d es el diámetro interior del soporte utilizado y ε es la porosidad de la

fase estacionaria, que suele tener un valor de 0,4 para empaquetamientos
sólidos.
6.- Volumen cero o muerto (V0 o Vm).
Es el volumen de eluyente que se consume sin que se detecte ningún

componente. Se define igual que el volumen de retención pero el tiempo
utilizado es el tiempo muerto:
Vm = tm ⋅ Fm
7.- Volumen de retención verdadero (V'R).
El volumen de retención verdadero de un componente es la diferencia entre

el volumen de retención del componente y el volumen muerto.
V'R = VR - Vm
o lo que es lo mismo:
V'R = (tR - t0) ⋅ Fm
8.- Coeficiente de partición o de reparto de un componente (K).
Se define como el cociente entre la concentración de componente presente

en la fase estacionaria y la concentreción de componente presente en la fase
móvil:
donde Cs y Cm son las concentraciones de componente presente en las

fases estacionaria y móvil respectivamente. El valor de K representa el valor
de la pendiente de la recta que se obtiene al representar Cs frente a Cm .

9.- Velocidad lineal media a lo largo de una columna (u).
Es la velocidad lineal media a la que se desplazan las moléculas de soluto a

lo largo de una columna. Viene dada por la expresión:
donde u es la velocidad lineal media, L es la longitud de la columna y tm es el

tiempo muerto.
10.- Factor de selectividad (α).
Es la relación entre los tiempos de retención de dos componentes:
donde α es el factor de selectividad, tRy y tRx son los tiempos de retención de

los componentes x e y , y Kx y Ky son los coeficientes de distribución de los
componentes. Dependiendo del valor de α se tiene una idea aproximada de
como será la separación cromatográfica:
α > 2 se obtiene una mala separación ya que son necesarios periodos muy
largos para realizarla.
1< α <2 se obtiene una buena separación cromatográfica.
11.- Factor de capacidad (K').
El factor de capacidad relaciona volúmenes o tiempos de retención de un

componente respecto a la fase móvil. Se puede definir como:

Es el cociente entre las probabilidades de encontrar una molécula
determinada de soluto en la fase estacionaria o en la fase móvil, o lo que es
lo mismo, el cociente entre el tiempo de permanencia de dicha molécula en
la fase estacionaria y en la fase móvil.
12.- Eficiencia
Para definir la eficacia se utiliza el concepto de piso teórico, y se define éste

como la sección teórico-transversal en la cual se realiza el equilibrio de
partición durante el flujo de fase móvil. Cuanto mayor se el número de platos
teórico (N) mayor será la eficiencia de la columna.
El número de platos teóricos mide la capacidad de la columna para separar

los componentes, no la retención de los mismos. La eficiencia o el número de
platos se puede observa directamente a partir del cromatograma,
observando la agudeza de los picos.
Donde N es el número de platos teóricos, L es la longitud de la columna, H

es la altura de cada plato, t'R es el tiempo corregido de retención de un
componente y ai es la anchura del pico cromatográfico. Y:
Si H tiene un valor pequeño, la distancia entre platos es menor y por tanto la

eficiencia será mayor. Por el contrario, si H es grande la columna es poco
eficiente para separar ese componente ya que sus moléculas estarán muy
difundidas.
La velocidad de la fase móvil influye en la eficiencia del sistema

cromatográfico, ya que si la velocidad es pequeña los componentes tendrán
más tiempo parta que se pueda realizar el equilibrio de reparto, por lo que el
número de platos será mayor y la altura de los platos menor.

13.- Resolución (R o Rs).
Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener

en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Relaciona la
capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes.
Se define como:
Donde Rs es la resolución, tRA y tRB son los tiempos de retención de los

componentes A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del
cromatograma de los anteriores componentes.
La resolución puede observarse directamente sobre el cromatograma de

picos. Se tendrá una buena resolución si los picos no se solapan, y está
perfectamente delimitado cada pico, sin que coincida el final de uno con el
principio del siguiente.
Si el valor de la resolución está próximo a 0,7 se obtendrá una mala

resolución quedando los picos solapados, de forma que se distinguen las
crestas, pero no la base, y si el valor de la resolución está próximo a 1,5 se
obtendrán unos picos bien delimitados por lo que se obtendrá una buena
resolución.
Una pobre resolución es debida principalmente a:
• Hay demasiada muestra en la columna.

• La columna o placa es corta.
• La fase móvil no discrimina entre los componentes.
• La columna es demasiado gruesa.
Cromatografía en capa fina

Introducción
La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa,

uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio,
un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para
aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las
placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas
preparadas y una estufa para activarlas.

La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase
estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general
menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se
desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehído
aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas
Ventajas de la cromatografía en capa fina
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros

métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que
el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que se necesita para
conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es
generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel
destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados son
fácilmente reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para
fines analíticos.
Adsorbentes
Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de

las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será
su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir un adherente
(yeso,...). Algunos de los adsorventes más utilizados son:
• Celulosa
• Almidón
• Azucares
• Gel de sílice (silicagel)
• Óxido de aluminio (alúmina)
• Carbón activo (carbón en polvo)
• Kieselguhr
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de

plantas y animales.
Silicagel
El gel de sílice o ácido silícico es uno de los más utilizados, es débilmente

ácido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deberá utilizar con sustancias
que se corrompan con los ácidos. Los geles de sílice normales suelen
contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor también se debe tener

en cuentas respecto al uso de componentes. El tamaño del grano suele ser
de 10 a 40 micras (µ) y el tamaño de poro varía de 20 a 150Å.
Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de

cálcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. También
han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por
separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de sílice.
Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos

para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar
componentes lipófilos (esteroides, ácidos grasos, ceras, vitaminas
liposolubles, etc). A este proceso se le denomina cromatografía de fase
reversa (silanizado).
Alúmina
La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico debido

a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la bauxita quedan
algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina, dándole
a ésta un carácter básico. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia
depositada como el gel de sílice.
La alúmina puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas ácidas,

básicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores
ultravioletas. Es un adsorbente de carácter polar, de tal forma que retendrá
con mayor avidez a los componentes polares.
Preparación de placas.
El adsorvente se deslíe en agua destilada. Para mezclar la papilla

homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico. La proporción de
adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos parte de agua y una
de adsorbente pueden tomarse como norma general, no obstante, habrán de
consultarse la instrucciones del fabricante.
Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, láminas de

vidrio, pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros compuestos
orgánicos más flexibles. Dependiendo del tipo de separación que se desee
(cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro. En general
para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra es
necesario una placa de vidrio de 20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80
ml. de agua destilada.
Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición

de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH

deseado. En la preparación de las placas también se pueden adicionar
indicadores fluorescentes o aglomerantes.
Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le

denomina argentación, y se utiliza para separar componentes insaturados.
El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa,

en general suele ser de:
0.1-0.2 mm. para separaciones analíticas.
0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.
La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectarían al

desarrollo del proceso cromatográfico. Para ello existen en el mercado
extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas homogéneas
del espesor deseado. Si no se disponer de extensor, el proceso a seguir es
el siguiente:
1. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.

2. Agitar enérgicamente.
3. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.
4. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
5. Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.
Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo

después de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metálicas. En este
momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas
reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien calentándolas durante
30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben calentarse más
de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire. Es conveniente dejar secar
las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se
producirían por efecto del cambio de temperatura.
Aplicación de las muestras
Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un

disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo
suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación.. Sin
embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla
cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean
disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg
de producto sólido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 µg de
material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de
impurezas.

Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el
proceso de siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos
capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar
(micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia
al borde inferior de un centímetro aproximadamente. El punto de aplicación
de la muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de

forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar.
Elección del eluyente
La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a

separar y del material en que la separación se lleva a cabo.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
Eter de petróleo.
Eter dietílico.
Ciclohexano.
Acetato de etilo.
Tetracloruro de carbono.*
Piridina.
Benceno.*
Etanol.
Cloroformo.*
Metanol.
Diclorometano.
Agua.
Ácido acético.
*compuestos cancerígenos.
En la elección del eluyente influyen varios factores:
• Precio.
• Pureza.
• No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
• No utilizar compuestos muy volátiles.
• Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la

polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.
b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente más polar.
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando

la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares, hasta dar con el
más apropiado.
Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias
muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos
eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada
eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente
con el cual la separación se realiza de una manera más eficaz.
Desarrollo de la cromatografía
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por

el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una
placa casi en vertical, por la acción de la capilaridad. La cromatografía se
realiza en una cubeta. Para conseguir la máxima saturación posible de la
atmósfera de la cámara, las parades se tapizan con papel impregnado del
eluyente. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner
papeles en las paredes, cosa que no debe olvidarse.
Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del

desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de
desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una
cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el
tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se

alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace
para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10
cm.; parece ser la más conveniente para medir valores de RF. Después del

desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire
caliente.
La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre

el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que
se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del eluyente nunca
debe llegar a tocar el borde de la placa.
Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz, se secará en una

cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.
Localización de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la

posición de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:
• Métodos químicos.
• Métodos físicos.
Métodos químicos
Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y los

componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos
reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma, o
mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido.
Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. Si el reactivo

revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverización deberá realizarse en
una vitrina de gases bien ventilada.
La pulverización se realizará poco a poco. En cromatografía en capa fina no

puede realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en papel sí).
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma

complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-
marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es
conveniente señalar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona

con los componentes orgánicos produciendo manchas negras.
El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de

componente separado.
Además de estos reveladores generales, existen otros específicos:
• 2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).

• Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos).
• Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
• Ninhidrina (para aminoácidos).
Métodos físicos.
El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. De

tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo
del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en
las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la
placa fluorescente excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con

lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta.
Constantes Rf Y Rx
La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la

posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide
la retención de un componente. Se define como:
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el

centro de la mancha, los cálculos se simplifican si el denominador es 10.
Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de
condiciones (Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad de
muestra). El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es
un RF entre 0.65 y 0.7.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la

misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se
calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que
no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los
compuestos pueden ser iguales o no serlo.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la

misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta
apreciar una separación mínima. En este caso no se pueden usar
reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino indIcador
ultravioleta.
También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un

compuesto (X), que tenga una posición de desarrollo conveniente; todos los

demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste. De esta manera
se tiene el , RX , ya que:
Cromatografía preparativa y bidimensional

Cromatografía preparativa
La cromatografía preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones,

desde el aislamiento de 1 µg. de muestra para identificación espectroscópica
hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g. La
cromatografía preparativa se diferencia de la técnica básica en muchos
aspectos, desde la preparación de la papilla. Ésta debe hacerse con menos
agua que de ordinario. Una papilla más espesa ayuda a estabilizar el grosor
de las placas que se precisa para una carga de mayor magnitud. El espesor
óptimo oscila desde un mínimo de 1 mm. hasta un máximo de 2 mm.
Las placas utilizadas en cromatografía preparativa son placas grandes, de

aproximadamente 20x20 cm. que permiten separar aproximadamente 1 g. de
mezcla utilizando unos 35 g. de adsorbente.
La siembra de la muestra se realiza mediante la ayuda de una jeringuilla o

tubo capilar. La siembra se realiza a lo largo de una línea recta (existen en el
mercado diverso utensilios para evitar torcerse). Si al terminar la primera
siembra todavía queda muestra, se seca la primera siembra y se aplica la
segunda, intentando que ésta quede sobre la anterior, para así conseguir
que el frente sea lo más estrecho posible. La siembra debe realizarse a lo
ancho de la placa.
Una vez sembrada la muestra se desarrolla la cromatografía. Se utiliza un

adsorbente con indicardor fluorescente para ver en la lápmpara ultravioleta
donde han quedado las manchas de los diferentes compuestos, dichas
manchas se marcan.
Una vez localizados los compuestos, éstos se extraen de la fase

estacionaria, uno a uno, con la ayuda de una espátula, sobre un papel de
filtro u otro soporte. Posteriormente se coloca cada componente en un
erlenmeyer, y se mezcla con un disolvente (metanol). Una vez disuelto el
compuesto se filtra varias veces para separar el compuesto y la fase
estacionaria. Una vez separado se elimina el disolvente (destilación), con lo
cual se obtiene el componente separado.

Si no se dispone de indicador fluorescente, no se pueden usar reveladores
químicos sobre toda la placa. El proceso a seguir es el siguiente: se raya la
placa separando totalmente una pequeña franja de placa, sobre la cual se
aplica el revelador químico, y a partir de esta franja se marcan las franjas de
compuestos.
Cromatografía bidimensional
La cromatografía bidimensional se trata ampliamente en el tema de

cromatografía en papel.

Métodos Cromatográficos

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Métodos cromatográficos.

Métodos variados de separación de mezclas se conocen como

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Tabla de clasificación de métodos cromatográficos

F. F. móvil Soporte Cromatografía Siglas

*H.P.L.C : cromatografía líquida de alta presión.

Clasificación según el proceso de desarrollo

Según el procedimiento en que se desarrolla se utiliza la siguiente

• Desarrollo por elución.

Desarrollo por elución

Representa el concepto básico de la separación cromatográfica y es la

La fase móvil es adsorbida débilmente por la fase sólida estacionaria. Este

4 Métodos cromatográficos – textoscientíficos.com

Consiste en desarrollar con un disolvente que sea adsorbido por la fase

Parte del material menos fuertemente adsorbido se recupera de forma pura,

Consiste en la aplicación continua de una mezcla en el origen. En principio el

Consideraciones teóricas y parámetros

La fase estacionaria consiste en partículas, generalmente sólidas, pequeñas

La fase móvil puede ser un líquido o un gas, y su función es transportar a los

En el proceso de separación se produce una competición entre la fase móvil

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El coeficiente de distribución de un componente A se define como:

Donde DA es el coeficiente de distribución del componente A, y [Aest.] y [Amóv.]

Los métodos cromatográficos actuales más modernos monitorizan la salida

Principales parámetros del cromatograma de picos.

1.- Pico del aire.

Es el que corresponde a la detección de una cantidad muy pequeña de aire

2.- La línea de base.

3.- Altura de pico (h).

Es la distancia entre la cima del pico y la línea de base. En el caso de que el

4.- Anchura del pico (a).

Es la longitud del tramo de la prolongación de la línea de base, comprendida

6 Métodos cromatográficos – textoscientíficos.com

6.- Área del pico (S).

Es la comprendida entre el pico y la prolongación de la línea de base.

Principales parámetros cromatográficos.

El tiempo cero (t0) o tiempo muerto (tm), es el tiempo de retención del

2.- Tiempo de retención de un componente (tii).

El tiempo de retención (ti o tR) es el tiempo transcurrido entre el instante en

3.- Tiempo de retención corregido de un componente (t'i).

Es le tiempo que transcurre entre la aparición de la sañal que corresponde a

4.- Tiempo de retención relativa (rip).