Para conocer aspectos básicos de la separación de los componentes de una mezcla por cromatografía observa el siguiente video. Los principios descritos se aplican a los diferentes tipos de cromatografía.
a. Describa el principio de la separación de los compuestos de una mezcla por
cromatografía de capa fina
Cromatografía en capa fina (CCF) es una técnica cromatográfica que utiliza una placa inmersa verticalmente en una fase móvil (eluyente). Esta placa cromatográfica consiste en una fase estacionaria polar (comúnmente se utiliza sílica gel, lumina) adherida a una superficie sólida. La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa La etiqueta de una caja de placas cromatografícas contiene información importante, por ejemplo: El tipo de absorbente. El orden en que diluirán los compuestos es impuesto a su polaridad, las sustancias más polares o con mayor capacidad de absorción, tienden a aparecer en la parte más baja de la placa, mientras que las sustancias menos polares se moverán más rápidamente y estas tienden a aparecer en la parte superior de la placa (Universidad Complutense de Madrid, 2010)
b. ¿En qué consiste la preparación de la placa cromatográfica?
Para este proceso la placa se recorta a un tamaño adecuado, teniendo en cuenta el número de muestras que se desea aplicar, es recomendable entre 3cm a 5cm de ancho por 10 cm de alto, el corte debe ser realizado por el lado del soporte para de esta manera no dañar el absorbente, se marca suavemente con un lápiz una línea recta a 1 cm y señala ligeramente los puntos donde van a ser aplicadas las distintas muestras, teniendo en cuenta que la separación entre 2 aplicaciones debe ser de al menos medio centímetro, dejando 1 centímetro desde las aplicaciones laterales hasta el borde de la placa y luego se debe elegir el eluyente. (Universidad Complutense de Madrid, 2010) . c. ¿Cuál es el procedimiento para seleccionar la fase móvil (eluyente)? Complemente consultando sobre este tema. Se debe tomar una placa cromatográfica y se traza a lápiz una línea horizontal donde se marcan varios puntos de aplicación separados por 1 centímetro, se aplica sobre cada tipo de muestra un tipo de eluyente sobre los que se desea probar. La cromatografía consiste en hacer pasar la fase móvil a través de la columna cromatográfica que contiene la fase estacionaria, donde están retenidos los solutos, la columna cromatografía está dividida en una serie de platos teóricos, donde se produce un equilibrio de distribución del soluto entre la fase móvil y la estacionaria. (Chicharro, M. 2005)
d. Describa el procedimiento desde la colocación de la muestra hasta el revelado de
compuestos separados Una vez visualizados los resultados se determinan las mejores condiciones de elución atendiendo al siguiente criterio: En el caso A el eluyente es muy poco polar y casi no desplaza las sustancias desde el punto de aplicación. En el caso B el eluyente posee la polaridad suficiente para desplazar la sustancia sobre el absorbente siendo adecuado para realizar la cromatografía En el caso C el eluyente es demasiado polar ya que desplaza la sustancia con el frente del eluyente. La muestra se aplica con un capilar limpio, tocando ligeramente el absorbente para dejar una mancha circular pequeña en la ubicación inicial marcada, el diámetro de la zona marcada no debe superarlos 2 milímetros. Se prepara la cubeta de cromatografía, se establece un recipiente de volumen adecuado de la placa, se llena con el eluyente necesario para empapar la placa cromatográfica pero sin cubrir la línea de aplicación, se introduce un trozo de papel filtro rodeando la pared de la cubeta cromatográfica, con el fin de saturar la atmósfera de la cubeta con el vapor del disolvente y prevenir la evaporación del eluyente, desde la placa cromatográfica se introduce la placa en la cubeta de cromatografía, se cierra sin moverla y se deja migrar el eluyente hasta aproximadamente 1 centímetro del borde superior, se debe sacar la placa de la cubeta y marcar la altura máxima alcanzada por el eluyente utilizado, por último se deja secar la placa al aire para de esta manera conseguir la evaporación del eluyente utilizado en el proceso. . (Universidad Complutense de Madrid, 2010).
e. ¿Qué es el factor de retención y como se puede utilizar para la identificación de las
sustancias separadas? Si las sustancias diluidas quedan plasmadas como manchas de distintos colores, se podrá hacer un análisis a simple vista, si el papel queda totalmente blanco habrá que usar una lámpara de luz ultravioleta para poder visualizarlas; los agentes reveladores más empleados son: vainillina, ácido fosfomolíbdico y permanganato potásico, el procedimiento a seguir en estos casos consiste en mojar el cromatofolio con una disolución del revelador y calentar en una estufa a 110°c durante unos 10 minutos, cuando se visualizan las manchas se las marca con un lapicero para no perderlas y poderlas tener en cuenta y determinar el factor de retención de cada sustancia, además de la comparación visual de la forma color e intensidad de las diferentes manchas. (Universidad Complutense de Madrid, 2010) El factor de retención de cada sustancia se define como la distancia recorrida por el compuesto tomada desde el centro de la mancha hasta la línea de aplicación y la distancia recorrida por el eluyente desde la misma línea de aplicación hasta la posición final del frente, este valor para cualquier factor debe estar siempre entre 0 y 1, jamás por fuera de este rango. (Universidad Complutense de Madrid, 2010)
ACTIVIDAD 4. CROMATOGRAFIA DE PAPEL
Para conocer la técnica de separación por cromatografía de papel relacionada con la práctica que se realizaría analiza el siguiente video.
a. ¿Qué es la clorofila? Y ¿Qué tipo de pigmentos estarían presentes en este extracto?
La clorofila es en realidad toda una familia de pigmentos, que son los responsables de dar a las plantas su color verde característico. Se trata de una biomolécula de importancia vital en el escenario de la vida sobre nuestro planeta, ya que, sin ella, la fotosíntesis que las plantas y otros seres vivos que realizan no sería posible. Esta se puede hallar en plantas, algas y algunos tipos de bacterias. (Ecologia verde, 2020) Existen diferentes tipos de clorofila: Clorofila A Todos los organismos capaces de realizar la fotosíntesis, entre ellos las algas y plantas, contienen este tipo de clorofila. Está presente en los cloroplastos, y gracias a su capacidad de absorber la luz en la longitud del espectro visible, posibilita la transformación de energía lumínica en energía química. Clorofila B Este tipo de clorofila también posee una coloración verde. Su función es la de aumentar la capacidad de absorción de luz de la clorofila A. La clorofila B está presente en algas y árboles. Clorofila C Este tipo de clorofila puede encontrarse en algunas categorías de algas, especialmente en el grupo de los dinoflagelados. Su función es parecida a la de la clorofila B, ayudando a la clorofila A a absorber la luz solar, pero solo está presente en el periodo inicial del proceso de fotosíntesis. Es de color marrón rojizo y da a los dinoflagelados su característico tono. El Mar Rojo, de hecho, debe su color a la presencia masiva de estas formaciones de fitoplancton. Clorofila D Este tipo de clorofila solo ha fue observado de forma aislada y no constante en un alga roja, aunque posteriormente se encontró también en la cianobacteria Acaryochloris marina, capaz de explotar la luz del espectro rojo. Hace poco se descubrió que su presencia no repetida sobre el alga roja se debe a que no es la propia alga quien la produce, sino una cianobacteria que se desarrolla sujeta a ellas. Clorofila F En el año 2010 el equipo de Min Chen publicó el descubrimiento de un nuevo tipo de clorofila, la f. Esta fue descubierta en una cianobacteria presente en estromatolitos en Australia, y permite la absorción de la luz roja con más efectividad que cualquiera de los otros tipos. (Ecologia verde, 2020)
La extracción y separación de pigmentos vegetales permite observar los pigmentos que componen las plantas. Esta separación es realiza por medio del proceso de cromatografía, la cual es una técnica que permite separar mezclas de sustancias. En ella siempre hay una fase móvil (en este caso etanol) y una fase estacionaria (en este caso papel de cromatografía o papel de filtro); la mezcla de pigmentos se distribuye entre las dos fases según su afinidad química, lo que permite separar sus componentes porque cada uno se desplaza a distinta velocidad. (Tomas Daniel, 2019)
b. Describa el procedimiento que se realiza para la separación de los pigmentos del extracto de hojas de espinaca. Para la extracción y separación de pigmentos de la hoja de espinaca se re realiza el siguiente procedimiento: 1. Se trituran 2 gr de hojas de espinaca fresca sin sus nervaduras en un mortero, se adiciona 2 gr de MgSO4 y 4 gr de arena. 2. El producto resultante pasa a un tubo de ensayo al cual se le añade 8 mL de acetona, se tapa, se envuelve con papel aluminio y se agita intermitentemente durante 10 minutos. Posteriormente, mediante una pipeta, se transfiere el extracto a otro tubo de ensayo pequeño. 3. En un trozo de papel filtro, se traza con lápiz una línea recta a 2 cm del borde inferior del papel. enseguida, se dibuja otra línea longitudinal desde el centro del papel, el punto que cruce las dos líneas será nombrado como “D”. 4. Se toma el extracto de hojas de espinaca con un tubo capilar, se pone una gota del extracto en el punto D. Se deja secar al aire libre y se realiza este proceso 2 veces más. 5. El filtro se suspende verticalmente en una cámara cromatográfica la cual contendrá la fase móvil compuesta por una mezcla de alcohol isopropílico y agua destilada. Asegurarse de que la línea del lápiz permanezca aproximadamente 1 cm por encima del nivel del solvente. 6. Se debe cubrir con papel aluminio la cámara para evitar la foto-descomposición de los pigmentos y se deja desarrollar por un tiempo de 20 minutos. 7. A medida que el solvente ha aumentado, se notará diferentes puntos de los pigmentos como caroteno, xantofila, clorofila a y clorofila b. Posteriormente se saca el papel filtro de la cámara y se miden los correspondientes valores Rf para analizar la adsorción relativa de cada uno de los pigmentos. (PQBIO, 2019)
c. Identifique fase móvil, fase estacionaria y compuestos separados
La fase móvil corresponde al eluyente que es el propulsor de los pigmentos que viajarán a través de la fase estacionaria. La mezcla de pigmentos se distribuye entre las dos fases según su afinidad química, lo que permite separar sus componentes porque cada uno se desplaza a distinta velocidad. La fase estacionaria corresponde a un sólido que en este caso es la columna de papel filtro el cual tiene característica de absorción, que en este caso serán los pigmentos de la hoja de espinaca. (PQBIO, 2019). Los compuestos separados corresponden a los dos tipos de clorofila (clorofila a y b), carotenos y xantofilas, distribuidos en la fase estacionaria de la siguiente manera (Imagen 1). ((PQBIO, 2019). .
Imagen 1. Distribución de los pigmentos vegetales extraídos
La clorofila a, posee un grupo metilo, la b dispone de un grupo aldehído. Esta sutil diferencia no solo se traduce en cambios de coloración, un verde azulado para la clorofila a y un verde amarillento para la b. si no, en una mayor polaridad de esta última con respecto a la primera (Desconocido 2020). d. ¿Qué función cumple en la separación la fase móvil y la fase estacionaria? ¿Por qué es posible separara los componentes de esta mezcla? La fase móvil es el disolvente en este proceso en donde además de actuar como fuerza propulsora, contribuye a que los pigmentos puedan separarse mediante sucesivos equilibrios de absorción – desorción . Por tanto es necesario que la fase móvil este compuesta por una parte polar y no polar, puesto que, en el disolvente polar, la clorofila y demás pigmentos son solubles. Dado el caso de solo estar conformada por un disolvente no polar, los pigmentos no podrían separarse. (Strain H et al, 1965) La fase estacionaria corresponde a la celulosa presente de la composición del papel la cual posee varios grupos hidroxilo que le dan la capacidad de atraer moléculas polares como el agua. Por tanto, la fase estacionaria cumple el papel de absorción de los componentes, esto gracias al componente de la celulosa que atrae lo componentes de la fase móvil antes mencionada. (Strain H et al, 1965) La separación de los componentes de esta mezcla se da a través de un mecanismo de absorción física, donde se establecen una serie de equilibrios de absorción – desorción que dependen de la polaridad de cada pigmento y del tipo de fuerzas intermoleculares que pueden establecer con los hidroxilos libres de la celulosa de papel y con la estructura del disolvente de la fase móvil. Así, la clorofila b, es más polar que la a, se adsorbe más intensamente y presenta un factor de retardo menor (Universidad Complutense de Madrid, 2010) 1. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Chicharro, M. 2005. Cromatografía, principios y aplicaciones. Análisis Químico. Encontrado en
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/mo nchi/alim/traba3.pdf. el 24 de enero 2020.
Universidad Complutense de Madrid. “Prácticas de Química Orgánica I: Cromatografía en capa fina”
2010. Eotrado en https://www.youtube.com/watch?v=g71IWP2O5pg&feature=youtu.be. El 24 de enero 2020 Ecologia verde, 2020. ¿Qué es la clorfila y sus tipos?. Encontrado en https://www.ecologiaverde.com/que- es-la-clorofila-y-sus-tipos-2579.html. El 24 de enero 2020.
PQBIO, 2019. Extracción y separación de pigmentos vegetales. Encontrado en
http://www.etpcba.com.ar/DocumentosDconsulta/ALIMENTOS-PROCESOS%20Y%20QU %C3%8DMICA/BIOTECNOLOG%C3%8DA/29Extraccion_pigmentos_verdes.pdf. El 224 de enero 2020.
.Tomas Daniel, 2019. “Separación de pigmentos vegetales” . Encontrado en
https://www.mclibre.org/otros/daniel_tomas/laboratorio/cromatografia/cromatografia.html#:~:text=Entre %20ellos%20est%C3%A1n%20la%20clorofila,de%20la%20cromatograf%C3%ADa%20en%20papel. El 24 de enero de 2020 Deconocido 2020. Separación de pigmentos. Encontrado en https://www.dequimica.info/separacion- pigmentos-hoja-espinaca. El 24 de enero de 2020. Strain, H. Sherma, J. Benton, F. Katz, J. 1965 . Radial paper chromatography and columnar chromatography of the chloroplast pigments of leaves. Encontrado en https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0926658565900865. El 24 de enero de 2020
