PRACTICA N° 04

CROMATOGRAFÍA.

https://youtu.be/-7Ni8oL7MNg
Objetivos:

- Demostrar la presencia de diferentes pigmentos como la clorofila, caroteno y xantofila

- Extraer pigmentos fotosintéticos y
- Interpretar una cromatografía

HISTORIA
El botánico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919) - también conocido por
su nombre latinizado, Tiselius - empleó por primera vez en 1906 el término "cromatografía" (del
griego chroma y graphein que significan respectivamente "color" y "escribir").
A comienzos del año 1903, Mikhail Tswett usó columnas de adsorción de líquidos para separar
pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacían pasar a través de una
columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido da un material poroso que
interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que éstos se separaban
en distintas bandas a lo largo de la columna.
Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo
XX. A su vez, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) comenzó a desarrollarse en los
años 1960, aumentando su importancia en las décadas siguientes, hasta convertirse en la técnica
cromatográfica más empleada. Sin embargo, esto se irá modificando con el paso de los años.

PRINCIPIOS TEÓRICOS
La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que presenta distintas
variantes. En toda separación cromatográfica hay dos fases (sólida, líquida o gas) una móvil y otra
estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo. La
muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase
estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en
recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente está la mayor
parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la
mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.
La más utilizada en química orgánica es cromatografía líquido-sólido en sus dos variantes:
cromatografía en columna (CC) y cromatografía de capa fina (TLC)

CLASIFICACIÓN
Las distintas técnicas cromatográficas se pueden dividir según cómo esté dispuesta la fase
estacionaria:
A.- Cromatografía plana: la fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.
Las principales técnicas son:
-Cromatografía en papel
-Cromatografía en capa fina
B.- Cromatografía en columna: La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el
fluido empleado como fase móvil se distinguen:
-Cromatografía de líquidos
-Cromatografía de gases
-Cromatografía de fluidos supercríticos

I.- CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN O REPARTO SOBRE PAPEL.

Generalidades: Consden y Martin introdujeron en 1944 un método de cromatografía de partición

en el que se utilizan tiras de papel de filtro como «soporte», que aplicaron al análisis de
aminoácidos. La técnica se ha extendido a toda clase de productos naturales y aunque sustituida en
gran medida por la cromatografía en capa fina (CCF), continúa siendo el método de elección para el
fraccionamiento de ciertos grupos de sustancias.

Técnica: La solución de componentes que se han de separar se aplica en forma de mancha, cerca de
uno de los extremos de la tira de papel de filtro preparada. El papel se introduce entonces en una
cámara hermética, cuya atmósfera está saturada de disolvente y agua y que contiene además,
disolvente saturado de agua. Los disolventes que dan resultados más satisfactorios son los
parcialmente miscibles con el agua, como el fenol, n-butanol y alcohol amílico.

Determinación de Rf: La relación entre la distancia recorrida sobre el papel por un componente de
la solución problema y la distancia recorrida por el disolvente se designa R f, factor de retención (Rf)
llamado también “relación de frentes”, el cual es característico de cada compuesto específico
correspondiente a dicha mancha y, en condiciones constantes (esto es, tipo de papel, tipo de
solvente, temperatura, etc.), su valor es también constante para cada compuesto.

II. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA, CCF ( TLC, thin layer cromatography, en inglés)
Por cromatografía en capa fina se entiende la técnica capaz de separar los componentes de una
muestra entre dos fases, una móvil, que suele ser líquida y otra estacionaria, que puede ser líquida o
sólida, y que está dispuesta como una capa de material poroso de un espesor determinado, colocada
sobre un soporte plano inerte, de vidrio o de aluminio.
Proceso de Adsorción. La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material
por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrógeno, efectos
inductivos, etc). Luego, cuando la capa es expuesta a un flujo por acción capilar, se inicia una
competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el solvente.
Adsorbentes. Los adsorbentes más utilizados en la Cromatografía de Capa Fina son:
 Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)
 Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
 Tierra Silícea ó Kieselguhr
 Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
 Poliamidas
Preparación de la placa cromatográfica. Se usan como soporte del adsorbente láminas de: Vidrio,
Plástico ó Metálicos (ej: Aluminio). Los tamaños de la placa para TLC convencional son : 20 cm x
20 cm; 10 cm x 20 cm y 5 cm x 2 cm

Aplicación de la muestra. La muestra los aminoácidos glicina (Gly), leucina (Leu), ácido aspártico
(Asp) y lisina (Lys )se aplica en punto en la placa.

Desarrollo de la Placa. Es un proceso mediante el cual son transportados a través de la fase

estacionaria por la fase móvil. N- butanol/acetona/ácido acético/agua (35/35/20/10)
Detección ó Visualización.- Por sustancias químicas en este caso la Ninhidrina

PARTE EXPERIMENTAL

A.- Cromatografía de Papel.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

Muestra
Extracto bencínico de hojas secas y molidas. ( Se puede extraer los pigmentos con bencina o
alcohol)
Procedimiento
1. Se corta tiras de papel Whatman Nº1 del tamaño preciso para colocarlos en tubos que servirán
como cámaras de separación. (Aproximadamente 12 X 5 cm)
2. Se traza marcas laterales con lápiz a 1 o 1.5 cm del borde inferior del papel.
3. Se coloca un volumen apropiado ( 3.5 ml. de Bencina + 1.5 ml. de acetona incolora) de
disolvente en el fondo del tubo de ensayo. Si usa extracto alcohólico el eluyente es de 5 ml. de
alcohol)
4. Se aplica la muestra en el papel con un capilar delgado y se deja secar. Si se precisa más
sustancia se deja secar y se aplica de nuevo la misma cantidad tantas veces como sea necesario,
secando después de cada aplicación.
5. La tira de papel, se introduce en la cámara cromatográfica de tal modo que el nivel del eluyente
quede por debajo de la línea de origen del papel y comprobando que esté completamente libre y no
toque las paredes de la cámara.
6. Se deja correr el cromatograma, luego, se retira y se marca con un lápiz el frente del disolvente.
7. Se deja secar y se calculan los Rf expresando los resultados con dos cifras decimales.
8. Anote sus observaciones.

B.- Cromatografía de Capa Fina.

Muestra
Extracto bencínico de hojas secas y molidas.
Procedimiento
1. Se corta tiras de cromatofolio (papel watman N°1) del tamaño preciso para colocarlos en un
vaso que servirán como cámaras de separación. ( aoroximadamente 12 x 5 cm.)
2. Se traza marcas laterales con lápiz a 1 o 1.5 cm del borde inferior del cromatofolio.
3. Se coloca un volumen apropiado de disolventes en el fondo del vaso (cámara de desarrollo) con
la ayuda de una pipeta sin mojar las paredes y se tapa con una luna de reloj.
4. Se aplica la muestra en el cromatofolio con un capilar delgado y se deja secar. Si se precisa más
sustancia se deja secar y se aplica de nuevo la misma cantidad tantas veces como sea necesario,
secando después de cada aplicación.
5. El cromatofolio se introduce en el vaso de tal modo que el nivel del eluyente quede por debajo
de la línea de origen del cromatofolio ( Eluyente: 3.5 ml de bencina + 1.5 ml- de acetona incolora) y
comprobando que esté completamente libre y no toque las paredes del vaso.
6. Se deja correr el cromatograma, luego, se retira y se marca con un lápiz el frente del disolvente.
7. Se deja secar y se calculan los Rf expresando los resultados con dos cifras decimales.
8. Anote sus observaciones.

C.- Cromatografía de Columna.

Muestra
Extracto bencínico de hojas secas y molidas.
Procedimiento
1.- Preparar la papilla de sacarosa con bencina (eluyente) aproximadamente 60 gr en 50 mL (según
dimensiones de la columna).
2.- Introduzca una pequeña porción de lana de vidrio en la columna (la cual debe estar bien limpia y
seca) y llévela hasta el extremo, de tal modo que cierre el extremo inferior de la columna y sirva de
soporte para el adsorbente.
3.- Agregar la papilla a la columna, golpeándola suave y continuamente, a fin de quitar las burbujas
de aire que estén retenidas.
4.- Una vez rellena la columna se toma con una pipeta 3 mL del extracto de clorofila y se vierta en
la columna. Se deja que la columna adsorba la mezcla y se agrega el eluyente, de tal modo, que se
produzca la separación.
5- Anote sus observaciones.
 CUESTIONARIO GRUPAL

1- Definir: Comatografía, cromatofolio, cromatograma, Adsovente, Eluyente. Rf,

2. Dar las características de los siguientes adsorbentes:
- Silica gel, Óxido de Aluminio ó Alúmina,Tierra Silícea ó Kieselguhr, Celulosa y, Poliamidas.
3. Realice el experimento del pigmento verde de la espinaca aplicando la técnica de la cromatografía en papael
descrita en la guía de práctica.

4. Clorofila: Definición, Tipos, Estructuras y degradación química.

5. HPLC: características, equipo. Mencione dos ejemplos de separación de compuestos orgánicos

por HPLC.
6. La parte experimental en casa es la cromatografía en papel puede usar el extracto alcohólico o
bencínico, el eluyente es específico en cada caso.