Qumica Biolgica I TP: Determinacin del Km y Vmax de la sacarasa de levadura Objetivos: Que el alumno aprenda a seleccionar las condiciones

para estudiar la cintica de una reaccin enzimtica. Determinar Km y Vmax. de la reaccin enzimtica. Parte Experimental Para hallar los valores de Km y Vamx debemos construir una curva 1/V vs 1/S. La sacarasa es una enzima que cataliza la hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa. La velocidad de reaccin se expresa como concentracin de sustrato hidrolizado por minuto, y para conocer la concentracin de sacarosa hidrolizada mediremos la concentracin de glucosa liberada. Pesar 0,1 g de levadura, homogeneizarla con 25 ml de solucin de EDTA al 1%. Centrifugar el homogenato 5 min. A 3.000 rpm recogiendo el sobrenadante que constituye el extracto enzimtico. Preparar el experimento segn el siguiente esquema:

Tubo

Ez (ml)

AcNa (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

EDTA (ml) 1,5 ------------0,2 M 0,15 M

SACAROSA ml
0,1 M 0,05 M 0,025 M 0,01 M

bco 1 2 3 4 5 6

-----0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

--1 -----------

----1 ---------

------1 -------

--------1 -----

----------1 ---

------------1

AcNa: buffer acetato de sodio 0,1 M pH 4,7 Preparar un estndar de forma similar al blanco ms 20 ul de una solucin de glucosa 1 g/l Dejar los tubos 10 minutos a 25 C y luego agregar 2 ml de reactivo de trabajo para cuantificar glucosa. Incubar en bao a 37C por 15 minutos y leer a 505 nm llevando a cero con el reactivo de trabajo. El fundamento de la reaccin se ejemplifica en la siguiente reaccin: Glucosa + O2 + H2O -----GOD----- Acido glucnico + H2O2

2 H2O2 + fenol + 4-AF -----POD----- quinoneimina + 4 H2O La quinoneimina ES um cromgeno rojo com um pico mximo de absorcin a 505 nm. El reactivo de trabajo es una mezcla de las enzimas GOD y POD, 4- aminofenazona, fenol y un buffer fosfato pH 7.