Preparacin y dilucin de muestras ambientales. Numeracin de microrganismos aerobios mesfilos viables.

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Prctica N2: Preparacin y dilucin de muestras ambientales. Numeracin de microrganismos aerobios mesfilos viables. Uso de medios de cultivo.

1. OBJETIVOS:
Conocer y determinar y a su vez aplicar el mtodo para realizar el recuento de microrganismos que se encuentran en una muestra ambiental. Determinar la carga microbiana de una muestra ambiental. Evaluar la calidad higinica sanitaria del producto a analizar Mostrar el modo en el que se prepara-diluye muestras para su posterior uso en los medios de cultivo. Aprender la correcta preparacin y clasificacin de un medio de cultivo para poder seleccionar el ms adecuado para analizar una muestra con la ms mnima cantidad de contaminacin, y mostrar las diferentes formas de inoculacin.

2. FUNDAMENTO TERICO
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Conceptos previos: Inculo: cantidad de muestra contaminada. Dilucin: es la reduccin de un compuesto en una disolucin. Bacteria aerobia mesfila: Es una bacteria cuya temperatura de crecimiento ptima est entre los 15 y los 35C. Preparacin de diluciones: La fraccin de la muestra destinada para el anlisis microbiolgico, debe ser representativa de la poblacin y constituida normalmente por 200 gramos o mililitros (esto dependiendo del anlisis). Para la puesta en marcha, se utilizan 100 g o mL y el resto se almacena como reserva, por si se hace necesario repetir el recuento. Si la muestra est constituida por distintos componentes, se tomarn fracciones representativas de cada una de ellas en la superficie y en la profundidad de la misma. Para casi todos los anlisis, se parte de una suspensin lquida de concentracin conocida, que se denomina suspensin madre y que tiene una dilucin 1:10 (10). Para conseguir este factor de dilucin, se mide una cantidad de muestra (en gramos o mililitros), y el resultante, se multiplica por 9 (nueve). Este nuevo resultado sern los mililitros de diluyente que se debe aadir a la muestra para lograr la dilucin decimal. A partir de esta dilucin, se preparan las siguientes (1:100, 1:1000, etc.), hasta el factor requerido y establecido por el analista; recuerde que siempre se debe tener la precaucin de cambiar la pipeta entre la realizacin de cada una de las diluciones y de mantener en fro, los tubos de la serie de diluciones, hasta el comienzo de los anlisis, pero sin prolongar por ms de dos horas esta refrigeracin. Con la finalidad de realizar las diluciones con diferentes volmenes o pesos de las muestras y obtener diferentes factores de dilucin, se puede hacer uso de la siguiente frmula:

Donde, el soluto es la muestra (slida o lquida), y el solvente es el diluyente utilizado. Tenga en cuenta que para el clculo de la segunda dilucin y posteriores, debe multiplicar el resultado por el factor de dilucin, de la dilucin inmediatamente anterior. Microbiologa Ambiental - Cuentas Castillo Erick Yeison

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Para la pesada de la muestra, aplique la tcnica mencionada a continuacin: - Tarar el recipiente estril que se vaya a utilizar para triturar la muestra. - Introducir aspticamente, la porcin de un volumen adecuado en dicho recipiente. - Pesar de nuevo para determinar el peso neto de la muestra. - Con una probeta graduada estril, aadir la cantidad de diluyente estril, para obtener la dilucin deseada. - Para el caso de muestras lquidas, utilizar pipetas de volumen adecuado y estriles. La caracterstica principal de un buen diluyente, es que no produzca modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la microbiota de la muestra que van a ser analizada, sin suprimir ni favorecer su desarrollo. En microbiologa, se utilizan varios diluyentes, pero habitualmente se usan los siguientes: Agua de Triptona con Sal, Solucin de Ringer y/o Agua de Peptona Tamponada. El diluyente utilizado para la solucin madre se suele emplear posteriormente, para efectuar las diluciones decimales. La trituracin de la muestra, es una operacin muy importante, pues en esta se debe evitar la destruccin de los grmenes presentes, ya sea por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo. Adems de una trituracin perfecta de la muestra, es necesario obtener una mezcla homognea para lograr la distribucin equilibrada de los microorganismos. Para la homogenizacin de la muestra, existen varios tipos de trituradores, como: - Jarra o licuadora, que consiste en un envase de vidrio o acero provisto de una hlice que funciona cuando se adapta a un motor. - Vstago, provisto de una hlice en su extremo que se introduce en la mezcla que se va a triturar. Funciona elctricamente y necesita de un envase de vidrio acero estriles, que se adapten especialmente al vstago. - Triturador de paletas o Stomacher, que acta golpeando rtmicamente la mezcla de la muestra y diluyente, que han sido previamente introducidos en una bolsa de plstico estril; los choques producidos por las paletas disgregan la muestra y ponen a los microorganismos en suspensin.

Para las muestras lquidas, posterior a la realizacin de la dilucin, se debe agitar Microbiologa Ambiental - Cuentas Castillo Erick Yeison

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suavemente de forma manual o en vrtex, con el objetivo de homogenizar los microorganismos en todo el diluyente.

Medio de cultivo: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad de medios de cultivo es tambin grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante para posteriormente esterilizarlos. Antes de su esterilizacin, los medios de cultivo ya hidratados se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces; segn se trate de caldos o agares).Existen diferentes medios de cultivo.

Clasificacin De Los Medios De Cultivo Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los ms importantes son aquellos que se basan en: a) Su consistencia b) Su utilizacin c) Su composicin d) Su origen

Segn su estado fsico (consistencia) 1) Medios lquidos: No contienen agar agar.Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una Microbiologa Ambiental - Cuentas Castillo Erick Yeison

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suspensin bacteriana de una determinada concentracin. 2) Medios slidos: 1.5 a 2.0 % de agar agar. Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molcula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solucin al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y nose funde por debajo de 85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en 1937, los dividi en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de cido pirvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporcin de agarosa a agaropectina en el agar vara segn el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales txicos. 3) Medios semislidos: 0.5 % de agar agar. Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias

Segn su utilizacin 1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc. 2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por

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adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate). 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. 4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos. 5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.

6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue Microbiologa Ambiental - Cuentas Castillo Erick Yeison

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simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos. 7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. 8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) haciendo pases peridicos de placa a placa, b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%. 9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Suutilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,CaryBlair, etc.

Atendiendo a su composicin. Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de cultivo pueden ser clasificados en: 1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados.

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2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida. 3) Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

Segn su origen: A) Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente. B) Sintticos: son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. C) Semisintticos son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una formade un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

Nutricin y crecimiento bacterianos Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energa, las bacterias se pueden dividir en: Litotrofas (del griego lithos = piedra): son aquellas que slo requieren sustancias inorgnicas sencillas (SH2 , S0, NH3, NO2-, Fe, etc.). Organotrofas: requieren compuestos orgnicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lpidos, protenas).

Desde el punto de vista biosinttico (o sea, para sus necesidades plsticas o de

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crecimiento), las bacterias se pueden dividir en: Auttrofas: crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgnicas sencillas. Ahora bien, habitualmente el concepto de autotrofa se limita a la capacidad de utilizar una fuente inorgnica de carbono, a saber, el CO2. Hetertrofas: su fuente de carbono es orgnica (si bien otros elementos distintos del C pueden ser captados en forma inorgnica).

Otros conceptos: Auttrofas Estrictas: son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgnica como fuente de carbono. Mixtrofas son aquellas bacterias con metabolismo energtico littrofo, pero requieren sustancias orgnicas como nutrientes para su metabolismo biosinttico.

Sean auttrofas o hetertrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos qumicos, que se pueden clasificar (segn las cantidades en que son requeridos) como: Macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg Micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...) En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias orgnicas y/o inorgnicas. Algunos de los nutrientes sern incorporados para construir macromolculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la produccin de energa, y no se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles. El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metablica de uso de nutrientes: desde auttrofos que obtienen su carbono por reduccin del CO2 y los dems elementos a partir de fuentes igualmente inorgnicas, hasta hetertrofos capaces de usar amplia gama de fuentes orgnicas de carbono. A su vez, dentro de los hetertrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutricin muy distintos, desde bacterias metilotrofas que slo usan metano o metanol como fuente de carbono y energa, hasta los muy verstiles Pseudomonas, que pueden Microbiologa Ambiental - Cuentas Castillo Erick Yeison

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recurrir a degradar ms de 100 tipos de fuentes de C, incluyendo sustancias tan "exticas" como hidrocarburos alifticos y cclicos. De cualquier modo, entre los hetertrofos, una de las fuentes ms tpicas de carbono consiste en glucosa. En los hetertrofos- organotrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidacin no muy distinto del material celular -CH2O-) entran simultneamente al: Metabolismo Energtico (o catabolismo, donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con otras sustancias no totalmente oxidadas); Metabolismo Plstico (anabolismo = biosntesis de nuevo material celular). Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgnicas sencillas (H2O, CO2, N2, NO3--, NH3, SO4=, fosfatos, etc.) son minora, pero sus procesos metablicos son muy interesantes. De hecho, existen tipos metablicos que slo han evolucionado en procariotas. Como paradigma de esto citaremos los microorganismos quimioauttrofos (o quimiolitoauttrofos): obtienen su energa de la oxidacin de sustancias inorgnicas sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a partir de sales inorgnicas, por lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales. Lo habitual, sin embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar del medio ciertos compuestos ms complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintticas. CARACTERSTICAS GENERALES DE UN BUEN MEDIO DE CULTIVO Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estril y que no contenga sustancias inhibidoras. CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la preparacin de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin. Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas

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marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los 98C) y al enfriarse forma un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los 42C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura de incubacin. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3 %. Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrgeno y carbono. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteasas, peptonas, polipptidos y aminocidos. Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH. Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios.

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Agentes selectivos. La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sdica, telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

Posibles defectos en la manipulacin y preparacin de medios de cultivo. Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una conservacin del medio de cultivo en ambiente exclusivamente hmedo; puede ser la causa de envases abiertos por tiempo prolongado o dejar mal cerrado el envase despus de su uso o por ltimo que, el medio de cultivo se encuentra vencido (ver fecha de vencimiento). Se recomienda despus de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en posicin horizontal. Desviacin del pH. Causado por utilizacin de agua no neutra, envases mal cerrados, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparacin o medio pasado de fecha de vencimiento. Turbidez. Precipitacin causada por uso de recipientes sucios, sobrecalentamiento del medio, prdida de agua por evaporacin en le medio o por no disolucin completa del agar-agar. Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporcin inadecuada del medio de cultivo deshidratado, mala disolucin del agar-agar e ineficiencia en la agitacin. Medios de cultivo contaminados. Por esterilizacin deficiente o contaminacin posterior a su preparacin (vidriera no estril y/o contaminacin en etapa de servido de los medios). Colonias inconcretas o desledas. Causada por superficies hmedas de los medios y/o por demasiado inculo en la siembra. CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO.

Medios simples. Agar Nutritivo: Contiene extracto de carne, peptona y agar-agar. Caldo Nutritivo: Contiene extracto acuoso de carne adicionado de peptona al 1% y Cloruro de Sodio al 0.5% (Ej.: Caldo BHI (Brain Heart Infusin/Infusin Cerebro Corazn), Caldo TSB (Caldo de Soya Microbiologa Ambiental - Cuentas Castillo Erick Yeison

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Tripticasa), y Caldo Nutritivo). Agar Base Sangre: Medio slido que contiene peptona, enriquecido con sangre desfibrinada de conejo al 7%; usado para el desarrollo de todo tipo de bacterias y especialmente para observar la actividad hemoltica.

Medios enriquecidos. Agar Sangre: Al medio Agar Sangre se le adiciona sangre de conejo desfibrinada al 7% estril, cuando este tiene una temperatura de 45C y luego de su esterilizacin (la fuente de sangre debe ser estril). Agar Chocolate: Consiste en un agar sangre que antes de su solidificacin se lleva a 100 C/1min., (llevar a ebullicin); as, se rompen los glbulos rojos y el medio toma un color caf. Se usa para el aislamiento de Haemophilus spp., y Neisseria spp. Medio de Tioglicolato: Permite el aislamiento de aerobios tolerantes y anaerobios. Debe conservarse en la oscuridad y en tubos tapa rosca de manera que, la anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en la superficie del medio.

Medios selectivos y diferenciales. Agar MacConkey: Medio selectivo para el crecimiento de enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares, lactosa y rojo neutro como indicador de pH (evidencia la fermentacin de la lactosa por el cambio de color). Agar SS (Salmonella-Shigella): Contiene peptona, lactosa, bilis de buey desecada, citrato sdico, tiosulfato sdico, citrato de hierro (III) y amonio, verde brillante y como indicador de pH Rojo neutro, que evidencia la fermentacin o no de lactosa. Las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras y las de microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas. Tambin pueden determinarse microorganismos formadores de H2S, por la formacin de un centro negro en la colonia. Agar EMB (Eosina Azul de Metileno): Contiene colorantes que impiden el crecimiento de bacterias Gram positivas. E. coli crece formando colonias con brillo metlico caracterstico, por la cristalizacin de la Eosina. Medio de Telurito: Permite el crecimiento de Corynebacterias, Staphylococcus y Listeria. El Telurito de potasio al 2%, es reducido por las Corynebacterias reductoras, apareciendo colonias de color grisMicrobiologa Ambiental - Cuentas Castillo Erick Yeison

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negro. Medio de Sabouraud: Medio utilizado para el aislamiento de mohos y levaduras. Contiene dextrosa, peptona o maltosa y con pH entre 5,0 y 5,5, inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos por efectos de la acidez del medio.

Medios de transporte. Mantienen viables los microorganismos presentes en una muestra antes que esta se procese; los conserva evitando su multiplicacin y muerte. Medio de Stuart: Se utiliza para transportar muestras de materiales purulentos muestreados con escobilln estril (hisopos). Medio de Buffer Glicerinado: Permite el transporte de muestras de materia fecal para coprocultivos. Se ha observado que, mantiene la viabilidad de Shigella.

Medios bioqumicos diversos. Son aquellos que revelan las caractersticas bioqumicas particulares de las bacterias, como: TSI (Agar Hierrotres azcares), Citrato de Simmons, SIM (Agar Sulfuro Indol Motilidad), Caldo MR-VP (Rojo de Metilo-VogesProskauer), Caldo Malonato, Caldo Rojo de Fenol + Carbohidrato, rea, LIA (Agar Lisina Hierro), etc. Comercialmente, pueden encontrarse sistemas multipruebas para evaluacin bioqumica de microorganismos, con 10 o ms parmetros que permiten una rpida y precisa identificacin de los rasgos metablicos del microorganismo y su consiguiente identificacin (Sistemas Crystal y API).

Mtodos generales de siembra y aislamiento. Por diluciones sucesivas: Se homogeneiza la muestra y se carga el ansa por nica vez. Luego se pasa el ansa de un tubo a otro. Estos tubos contienen agar a 45C. De esta manera el primer tubo contendr mayor concentracin de microorganismos que el ltimo. Luego se pasa el contenido de los tubos a las cajas de Petri y de all a los tubos con agar en pico de flauta. Por diseminacin con esptula de Drigalsky: Se deposita sobre el medio slido contenido en la placa, una ansada o una gota con pipeta del material a sembrar, que luego se extender por toda la superficie del medio con una esptula de Microbiologa Ambiental - Cuentas Castillo Erick Yeison

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DRIGALSKY. La esptula se introduce inmediatamente despus de su uso en un recipiente para su esterilizacin en autoclave o en formaldehdo al 5 %. Recuento de colonias o recuento estndar en placa se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan despus de inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una temperatura y tiempo determinados un volumen determinado de muestra. Se utiliza para determinar el nmero de clulas aisladas o microorganismos unicelulares viables como bacterias, levaduras, tambin se utiliza para el conteo de esporas fngicas presentes en la muestra. La muestra a inocular debe ser homognea y no contener conglomerados de clulas. Despus de la incubacin cada microorganismo o clula viable formar una masa visible de organismos, o sea una colonia. De esta manera el nmero de colonias permitir a su vez determinar el nmero de organismos viables en la muestra sembrada. Se pueden utilizar sistemas de siembra en superficie, o en profundidad. Generalmente la muestra original se diluye para que el nmero de colonias desarrolladas en la placa se encuentren entre 30 y 300 colonias y as permitir un ptimo crecimiento y facilitar la lectura. En primer lugar, la muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estril y se mezclan adecuadamente. Este proceso se repite hasta obtener una dilucin apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10-5). Posteriormente se aade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendindolo en la superficie de la misma (mtodo de extensin en placa) o mezclndolo con el medio (mtodo de vertido en placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadsticas, las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. Cuando la muestra se diluye el clculo del resultado se realiza contando las colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y 300, se promedia y se multiplica por el factor de dilucin. Los resultados se expresan en colonias por ml. Los resultados tambin pueden expresarse en unidades formadoras de colonias (UFC), el valor de UFC es un valor que expresa el nmero relativo de microorganismos de un taxn determinado en un volumen de un metro cbico de muestra. En el caso de alimentos el resultado se considera como un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento.

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Recuento en placa dilucin de la muestra

En diversos estudios microbiolgicos (como anlisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacuticos o del medioambiente entre otros), se requiere conocer el nmero de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad. El procedimiento es esencialmente el mismo que para la medida del crecimiento de las poblaciones de bacterias El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante mtodos de medida de la masa total celular, que generalmente es directamente proporcional al nmero de clulas, (mtodos de determinacin del peso, de la actividad del cultivo o mtodos turbidimtricos) o por la determinacin del nmero de clulas.

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Principales mtodos de recuento del nmero bacterias en una muestra El nmero de bacterias puede determinarse directamente por recuento del nmero total de clulas o indirectamente por la estimacin del nmero ms probable, por filtracin o por el recuento de clulas viables en placa (clulas capaces de dividirse en un medio de cultivo slido, tambin se refieren como unidades formadoras de colonias, UFCs).

Recuento directo de bacterias al microscopio Es una tcnica para determinar el nmero total de organismos de una muestra: Se utilizan cmaras de recuento (cmara de Petroff-Hauser) y visualizacin al microscopio. Es un mtodo rpido del nmero total de clulas de una muestra pero no distingue entre viables o no viables.

Recuento directo con contadores electrnicos Se utiliza el contador Coulter recuenta el nmero de clulas suspendidas en un lquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente elctrica. Se puede determinar a su vez el tamao de las clulas pero tampoco distingue entre viables, muertas o partculas.

Recuento en filtros de membrana En este mtodo el recuento se realiza por filtracin de un volumen de la muestra a travs de un filtro de membrana de tamao adecuado para retener a las bacterias (0.22-0.45 m). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca sobre un medio de cultivo slido y se incuba. El recuento del nmero de colonias formadas sobre el filtro determina el nmero total de bacterias en la muestra filtrada. Es un mtodo til cuando el nmero de bacterias presentes en la muestra es muy bajo. Se utiliza con frecuencia para determinar el nmero de bacterias en agua.

Mtodos de recuento de bacterias viables en placa Estos mtodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las bacterias viables presentes en una muestra. Implican la dilucin seriada de la muestra en agua, caldo o solucin salina, la inoculacin de la dilucin en medio de cultivo slido y la Microbiologa Ambiental - Cuentas Castillo Erick Yeison

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incubacin durante 24-48 horas a la temperatura apropiada y en placa son mtodos de estimacin de bacterias viables en trmino de unidades formadoras de colonias (UFCs). El nmero de unidades formadoras de colonias de una suspensin bacteriana puede determinarse mediante dos tcnicas:

Recuento en placa por siembra en profundidad. Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50C sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un mtodo generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.

Recuento en placa por siembra en superficie Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilucin de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este mtodo todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta tcnica para el recuento de bacterias aerobias.

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3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Materiales y equipos: Bolsa polietileno. Muestra de suelo. Balanza analtica. Esptula. Cuchillos y pinzas. Pipetas bacteriolgicas esterilizadas de 0.1ml. Matraz de 90ml de agua peptonada. Tubos de ensayo 16x150. Algodn, papel kraft y pabilo

Dilucin y difusin. Tenemos una muestra de tierra (10 gr) Diluir la muestra con agua peptonada (90 ml) siempre cerca al mechero para evitar la contaminacin, esta dilucin en la bolsa nos dar una concentracin de . Diluir 1 ml de esta muestra en un primer tubo que contenga 9 ml de agua peptonada esta dilucin tendr una concentracin de y as sucesivamente hasta obtener concentraciones de a . De cada tubo de ensayo con una pipeta extraer 1ml y depositarlo en las 5 placas petri, luego desechar la pipeta en el respectivo contenedor. La inoculacin debe realizarse cerca al mechero de bunsen. Luego, en las placas de petri con las soluciones puestas, agregar el APC (15 a 18ml), voltear las placas petri y llevarlas a la incubadora por 48 horas, todo el procedimiento se realiza cerca del mechero para reducir la contaminacin.

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Esquema:

MUESTRA DE TIERRA
Diluir 10 gr con 90ml de agua peptonada

9ml

9ml

9ml

9ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

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Diseminacin. En 6 placas Petri colocar APC (agar plate count), luego esperar de 10-15 minutos para que este solidifique (necesario para realizar la diseminacin en la superficie). Luego del experimento anterior, dilucin de muestras, de cada tubo con muestras diluidas tomar 0,1ml e inocular. Para esto primero se agita los tubos con las diluciones (sin humedecer el algodn que cubre la parte superior), luego con una pipeta sacar la cantidad deseada, depositar en la placa Petri, luego desechar la pipeta en el respectivo contenedor (ya antes mencionado). La inoculacin debe realizarse cerca al mechero de bunsen, finalmente esparcir la muestra con ayuda de la esptula de Drigalsky, que debi de ser antes esterilizada mediante desinfeccin con alcohol y exposicin al fuego directo. Luego voltear las placas Petri y llevar a la incubadora por 48 horas. Finalmente regresar luego de 72 horas y cuantificar las colonias en las placas.

4. RESULTADOS / OBSERVACIONES:
Diseminacin:

Dilucin 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Cantidad colonias Incontable Incontable Incontable 18 0

Observaciones Completamente lleno de colonias Completamente lleno de colonias Completamente lleno de colonias Existe una colonia expandida 8 levaduras de color rojo y amarillo

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Difusin:

Dilucin 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Cantidad colonias Incontable Incontable 28 55 28

Observaciones Completamente lleno de colonias Completamente lleno de colonias Existe una colonia expandida Colonias claramente reconocibles 2 levaduras de color rojo y amarillo

Control de esterilidad: Control Agua peptonada Agar plate count Cantidad de colonias observaciones Creci 3 levaduras No creci nada

5. DISCUCIN Al comenzar la prctica se discuti acerca de cul sera el mejor mtodo

para la contabilizacin de colonias, difusin ofreca mejor crecimiento de colonias pero este crecimiento no necesariamente era mejor a la hora de contar las colonias obtenidas. Al existir la presencia de colonias en la placa de control de agar plate count nos llam bastante la atencin pues era probable que este agar haya estado contaminado, pero tambin exista la posibilidad de que este haya sido una contaminacin del aire del mismo laboratorio. Al contabilizar existi cierta incertidumbre al no saber considerar a las colonias expandidas en ciertas placas.

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6. CONCLUSIONES
Al existir una mayor concentracin de la muestra existe un nmero mayor de colonias, es decir que son proporcionales. La aparicin de ciertas colonias coloreadas fueron debido a la mala praxis de laboratorio que permiti que estas aparecieran en las placas( no se acerc debidamente al mechero) Se concluye que en el momento de preparar un medio hay que prestar bastante atencin, ya que este se puede contaminar, igualmente al momento de las inoculaciones (dependiendo del mtodo) planificar el tiempo para obtener buenos resultados ya que si el agar es expuesto mucho tiempo se solidifica. La calidad higinico sanitario de la muestra, mediante los resultados obtenidos, esta contaminada pues presenta muy altos niveles de formacin de colonias.

7. RECOMENDACIONES
Antes de utilizar los materiales (pipetas, tubos, asas, etc.) stos deben de ser esterilizados correctamente en el laboratorio tomando siempre las precauciones. En el caso de los tubos de ensayo, flamear la boca de stos antes de colocar el tapn. Marcar los tubos con la identificacin del cultivo, con los mismos nmeros que en las placas. Rotular las placas y los tubos para un mejor manejo en el laboratorio. No olvidar agitar los tubos con las muestras antes de la inoculacin. Esterilizar bien la esptula de Drigalsky. Cuando se esparce la muestra girar la placa Petri para una mejor distribucin. Mantener el matraz calentndose hasta que los grumos del agar desaparezcan. Sacarle provecho al tarado de la balanza analtica. Usar agua para bajar todo el agar que se separa en el papel.

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8. BIBLIOGRAFA
www.slideshare.netnataliaizurieta tcnicas de inoculacin www.britanialab.com _agar EMB y Mac Conkey Aquiahuatl Ramos, M. A., y Prez Chabela, M. L. 2004. Manual de prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa. Mxico. Departamento de Biotecnologa. 116 p.

-Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de tcnicas de Microbiologa Mdica. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 676 p.

-Brock y Madigan. Microbiologa. Editorial. Prentice Hall Hispanoamrica S.A.. 6 edicin. Mxico 1993.

-Carrascal Camacho, A, K. Pez Morales, A., y Burbano Rosero, M. 2003. Manual de Laboratorio:

-Microbiologa de Alimentos. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, departamento de Microbiologa, Bogot. 171 p.

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9. ANEXOS

Fotografia 1.Tubos de ensayo con muestras diluidas numeradas

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Fotografia 2.Placas del metodo de difusin.

Control de esterilidad agua peptonada

Control de esterilidad APC

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