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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGI-


CO. NORMAS ISO, UNE...

Sara Cano Ruera. Consultora Analiza Calidad.


Miércoles 5 de abril 2006.

ÍNDICE:

1. INTRODUCCIÓN
2. CULTIVO DE BACTERIAS
a. Medios de cultivo
b. Toma del inóculo
c. Transferencia
d. Aislamiento
3. PRINCIPALES MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMEN-
TOS
a. Microorganismos aerobios mesófilos
b. Mohos y levaduras
c. Enterobacterias
d. Coliformes totales
e. Escherichia coli
f. Staphylococcus aureus
g. Salmonella
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1. INTRODUCCIÓN

Ante la diversidad de métodos y procedimientos analíticos que dificulta la comparación y


armonización de los resultados obtenidos se hace necesario establecer unas normas que
permitan dicha comparación entre los resultados que se obtienen en los distintos labora-
torios.

La implantación de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) y el Aseguramiento de la


Calidad obliga a normalizar todas las operaciones que se realizan en el laboratorio. Por
ello se han redactado una serie de procedimientos e instrucciones de trabajo con el fin de
dar uniformidad y consistencia a los análisis de alimentos que se realizan en los laborato-
rios de microbiología y reducir los riesgos de error por parte de las personas que realizan
el ensayo.

Dado que la finalidad de trabajar con BPL es la obtención de resultados analíticos de ca-
lidad y conseguir la aceptación mutua de estos resultados entre los diferentes países, hay
que seguirlas escrupulosamente. La elaboración de estos documentos viene dada por la
necesidad de tener un sistema unificado de funcionamiento y gestión de los laboratorios,
ya que hace falta asegurar la calidad e integridad de los resultados y datos obtenidos en
los análisis, y establecer esquemas de funcionamiento equivalentes entre laboratorios.

Así, se ha realizado una homogenización de los métodos de análisis de alimentos, unifi-


cando sus características en base a las normas internacionales correspondientes (ISO:
Internacional Standard Organisation; EN: European Norme; NF: Norme Française; AF-
NOR: Association Française de Normalisation). Junto con ellos se han redactado los pro-
cedimientos de preparación de medios cultivo y reactivos necesarios para realizar los
ensayos, de manera que hay una explicación de cada uno de los aspectos de los proce-
dimientos de análisis.

Los métodos ISO (2 placas por dilución, confirmación de 5 colonias) suelen utilizarse co-
mo métodos de referencia; y los métodos NF (1 placa por dilución, confirmación de 3 co-
lonias) se suelen emplear como métodos de rutina, siendo los dos métodos normaliza-
dos.

Con el objetivo de uniformizar todos los procedimientos del laboratorio, se han redactado
unos Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) que dan las instrucciones para la
realización de todos estos documentos, tanto de métodos de análisis de alimentos como
los de preparación y control de calidad de los medios de cultivo y reactivos necesarios
para ellos. Los Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) son un conjunto de ins-
trucciones escritas de obligado y riguroso cumplimiento que describen cómo deben reali-
zarse determinados métodos de ensayo, como deben manejarse los equipos de análisis
o cómo se debe proceder ante cualquier otra actividad del laboratorio.

Las normas ISO, EN, NF, AENOR (Asociación Española de Normalización) se van elabo-
rando y revisando de forma continua. Como este proceso suele ser bastante largo, es
aconsejable consultar las siguiente páginas web:

• ISO: www.iso.ch

• EN: www.cenorm.be

• AFNOR: www.afnor.fr
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• AENOR: www.aenor.es

Los esquemas que se presentan son un reflejo de los medios de cultivo y de todas las
reacciones bioquímicas que en ellos se producen, al reflejar las características del medio
y de las colonias que crecen en él. Así, se puede saber rápidamente si el medio que se
ha de utilizar se necesita en frascos, en tubos (con o sin campana) o en placas, conocer
su color original y observar los cambios que sufre en el proceso.

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2. CULTIVO DE BACTERIAS

A) MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros compo-


nentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos.

a) Constituyentes habituales de un medio de cultivo:

- AGAR utilizado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.
- EXTRACTOS son concentrados en polvo, deshidratado, de parte de órganos o
tejidos animales o vegetales para confeccionar el medio adecuado.
- PEPTONAS se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales
o vegetales. Son muy ricas en péptidos y aminoácidos.
- FLUIDOS CORPORALES (sangre o plasma) Se añaden a los medios de cultivo
porque contienen factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos mi-
croorganismos exigentes.
- SISTEMAS AMORTIGUADORES (fosfatos bisódicos y bipotásicos) se utilizan para
mantener el pH del medio en un determinado valor.
- INDICADORES DE pH son indicadores ácido-base con el objeto de detectar varia-
ciones de pH.
- AGENTES REDUCTORES se añaden para crear condiciones que permitan el de-
sarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerófilos.
- AGENTES SELECTIVOS son sustancias que se adicionan para convertir al medio
de cultivo en selectivo.

b) Tipos de medios de cultivo:

1. Medios generales permiten el desarrollo de una gran variedad de microorga-


nismos.
2. Medios de enriquecimiento favorecen el crecimiento de un determinado tipo de
microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
3. Medios selectivos permiten el crecimiento de un tipo de microorganismo de-
terminado, inhibiendo el desarrollo del resto.
4. Medios diferenciales ponen de relieve propiedades (normalmente bioquímicas)
que un determinado microorganismos posee y de esa forma se puede distinguir
ese microorganismo de otros que también pueden crecer en ese medio.
5. Medios de transporte y mantenimiento se utilizan en la recogida, transporte y
conservación de muestras microbiológicas. Son medios no nutrientes (los mi-
croorganismos se mantienen pero no se multiplican), semisólidos, que inhiben las
reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las células y evitan los efectos
laterales de la oxidación.

c) Preparación de medios de cultivo:

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados,


normalmente como productos liofilizados que es necesario hidratar. En general la prepa-
ración de un medio de cultivo consiste en pesar la cantidad necesaria del polvo liofilizado,
disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instruccio-
nes del fabricante y esterilizar la disolución, previa comprobación y corrección del pH si
es necesario.
Antes de ser esterilizados en autoclave, los medios líquidos se distribuyen en los reci-
pientes adecuados (tubos o matraces) y se tapan; en ningún caso la altura del líquido en

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el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de éste. Si se trata de un medio
que contenga agar (sólido o semisólido) suele ser preciso calentarlo (al baño María o al
microondas) para fundir el agar antes de esterilizarlo en el autoclave. Una vez fundido se
reparte, en caliente, en matraces o tubos (nunca en placas de Petri), se tapa y se esterili-
za.

Finalizada la esterilización en el autoclave:


- los medios líquidos se dejan enfriar a temperatura ambiente.
- los medios sólidos contenidos en tubo deben inclinarse para que al solidifarse, adop-
ten la forma de agar inclinado (slant), si tal es su finalidad.
- la preparación de los medios sólidos en placa de Petri se realiza rellenando las placas
con el medio estéril fundido y atemperado a unos 50ºC en ambiente estéril. El am-
biente estéril se consigue en la proximidad de un mechero Bunsen o en una campana
de siembra adecuada.

B) DILUCIONES DECIMALES

Primero se prepara el “MACERADO INICIAL”. El procedimiento más frecuentemente em-


pleado para este fin consiste en la utilización de un homogenizador de paletas tipo "sto-
macher" en el cual se homogenizan diluyente y muestra y, de esta forma se prepara una
suspensión más o menos homogénea de alimento y microorganismos que permite la pre-
paración posterior de las oportunas diluciones que posteriormente serán utilizadas en los
diversos métodos de recuento. Para ello se pesan asépticamente 10 g del alimento. La
pesada suele realizarse en bolsa de plástico para stomacher. Se añaden a la bolsa 90 mL
de diluyente estéril y se homogeniza el alimento con el diluyente en Stomacher durante 2
minutos. Así conseguimos el macerado inicial que es la dilución 1:10. Si es posible es
mejor pesar 25 g de alimento. Añadir 225 mL de diluyente estéril y proceder como en el
caso anterior homogenizando en Stomacher durante 2 minutos.

Para preparar las “DILUCIONES DECIMALES”, añadir 1 mL de macerado inicial (también


llamado dilución madre o dilución 1:10) a un tubo con 9 mL de diluyente, homogenizar
usando un agitador excéntrico de tubos de ensayo durante 20 segundos o agitando ma-
nualmente. De esta forma hemos preparado la dilución 1:100 ó 10 —2. Repetir la opera-
ción anterior transfiriendo 9 mL de la dilución 1:100 a un tubo con 9 mL de diluyente para
preparar la dilución 1:1000 ó 10 —3. Repetir la operación anterior tantas veces como sea
necesario hasta conseguir el número de diluciones deseado. El número de diluciones que
se necesita depende de lo contaminado que este el alimento. De un alimento del que se
sospecha un número alto de microorganismos/g hay que hacer más diluciones que de
uno poco contaminado.

Para los métodos de ausencia / presencia no es necesario preparar las diluciones deci-
males, éstas se utilizan para los métodos de contaje.

C) MÉTODOS DE SIEMBRA

• Siembra en masa

Se caracteriza porque durante la incubación las colonias crecen en el interior de la masa


del agar.
1. Se deposita 1 mL de la muestra (si es líquida) o de cada dilución en placas estéri-
les, vacías.
2. Se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente
fundido y mantenido a unos 47ºC.

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3. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimien-


tos circulares y de vaivén (siempre sin levantar la placa de la mesa). Con esto se
consigue mezclar el inóculo con el agar.
4. Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente (esperar al menos media hora)
y se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubación elegidos
varía según el tipo de microorganismos).
5. Pasado el tiempo de incubación las colonias habrán crecido dentro del agar (en la
masa del agar). Elegir de entre todas las placas las dos correspondientes a aque-
lla dilución que presenten un número de entre 30 y 300 colonias /placa (esto pro-
porciona una precisión estadística suficiente y no es engorroso de hacer).
Para realizar el contaje, se utiliza un cuenta-colonias; se pone la placa de Petri
con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando mediante
un lápiz graso a lo largo de los diámetros. El número de unidades formadoras de
colonia o UFC/g (o mL en muestras líquidas) de la muestra original será:

Número de UFC/g = Número de colonias x factor de dilución


6.
• Siembra en superficie

Se caracteriza porque durante la incubación las colonias crecen en la superficie del agar.
1. Se utilizan placas previamente preparadas que contienen el medio de cultivo soli-
dificado (unos 15 mL/placa).
2. Se deposita en la superficie del agar 0,1 mL de la muestra o de cada dilución.
3. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda
la superficie de las placas, usando un asa de Drigalski estéril.
4. Esperar 2 ó 3 minutos a que se seque el inóculo.
5. Se llevan las placas a incubar y se procede de la misma manera que en el caso
anterior.

D) TOMA DEL INÓCULO

Una vez que las colonias han crecido, puede ser necesario su confirmación.

Si la muestra proviene de un medio líquido, el inóculo se toma agitando el suavemente el


asa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión superficial en el extre-
mo del filamento del asa de siembra.

Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa Petri), to-


me una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra.

Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta),
hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la misma. Fla-
mee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el soporte necesario.

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E) TRANSFERENCIA

La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de
recipiente que los contiene.
Se pueden presentar los siguientes casos:

- Siembra de medio líquido a medio líquido: El procedimiento se puede reali-


zar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos.
- Siembra de medio sólido a medio líquido: El procedimiento se puede reali-
zar con asa en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos.
- Siembra de medio sólido a medio sólido: El procedimiento se puede reali-
zar con asa o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundi-
dad o en placa Petri, en superficie.
- Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se puede reali-
zar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie
o en profundidad o en placa Petri, ya sea en superficie o por homogeinización.

1. Técnica de transferencia en tubos de ensayo.

Técnica para medio líquido

Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los mi-
croorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a la misma
altura.

Se sostienen con los dedos índice, medio y anular apoyándolos en el dedo meñique, y se
los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualización de toda
la superficie del cultivo.

Con los dedos pulgar e índice (como un lápiz) de la otra mano, se toma la pipeta estéril o
el mango de Koll con su aguja o asa en anillo y se esteriliza.

Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el asa, de la siguiente
manera: el tapón del tubo más alejado del operador (que es el que contiene la muestra)
entre el dedo meñique y la palma de la mano; el tapón del tubo más cercano al operador
(que contiene el medio de cultivo estéril) entre el meñique y el anular.

Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inóculo; se siembra; se flamean nueva-
mente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias de los tapones y
se quema el asa.

Como el inóculo procede de un medio líquido, antes de realizar la transferencia se debe


agitar el tubo para poner en suspensión a los microorganismos que pudieran estar depo-
sitados. Si la siembra se realiza en medio líquido, se agita el tubo sembrado para distri-
buir homogéneamente el inóculo.

Para realizar la agitación se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos índice
y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo índice de la otra mano
con una amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer rotar los tubos entre las palmas
de las manos.

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Técnicas para medio sólido.

Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido, se puede sembrar en superficie, en pro-


fundidad o en profundidad y superficie.

1) En superficie:

a) Por estría: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el
fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa
parte, luego mover el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movi-
miento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.
b) Por trazo: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar
una línea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior,
sin ejercer presión para que no se rompa el medio.

2) En profundidad:

a) Por punción: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en for-
ma vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inóculo
rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La punción se
realiza en el centro del medio o excéntricamente.

3) En profundidad y superficie:

Por punción y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero
con mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo,
se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta.

Técnica de transferencia en placa Petri.

La siembra en placa Petri, puede hacerse:

1) En superficie:

a. Por estría central: Se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la introduc-
ción del asa con la carga de microorganismos, iniciándose la estría en el borde del
medio más alejado del operador y se la extiende hasta llegar al centro de la placa,
luego se gira ésta 180 º y se continúa realizando otra estría de la misma manera.
Esta división evita el obstáculo del borde de la placa

b. Por estría en cuadrantes: Se divide la placa en cuatro sectores y se siembra en


estría cada uno de ellos, partiendo del borde de la placa hacia el centro. El cua-
drante a sembrar debe ser el más alejado del operador y el inóculo en cada caso

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puede ser el mismo (la misma especie) o distinto (diferente especie) para cada
cuadrante.

c. Por diseminación con espátula de Drigalsky: Se deposita sobre el medio sólido


contenido en la placa, una asada o una gota con pipeta del material a sembrar,
que luego se extenderá por toda la superficie del medio con una espátula de DRI-
GALSKY.

*La espátula se introduce inmediatamente después de su uso en un recipiente


para su esterilización en autoclave o en formaldehído al 5 %.

d. Por diseminación con hisopo: Se sumerge en el caldo de cultivo, se escurre el


exceso de líquido sobre la pared interior del tubo y se estrían ambas mitades de la
placa de Petri, partiendo de los bordes hacia el centro, luego se gira 90º y se es-
trían nuevamente ambas mitades, finalmente se gira 45º y se estrían ambas mita-
des.

2) Por homogeneización:

a. Técnica de la siembra en tubo para volcar en placa: El inóculo se introduce


con el asa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo fundido y enfriado a 45 ºC
en cantidad suficiente para cubrir la placa de Petri. Se homogeneiza por rotación y
se vuelca en la placa previo flameado de la boca del tubo.

b. Técnica del agar volcado: Se deposita el inóculo con pipeta en el centro de la


placa Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo fundido y enfriado
a 45ºC. Se homogeneiza por rotación para lo cual se le imprime a la placa movi-
mientos circulares, en sentido horario y en sentido antihorario y movimientos recti-
líneos, horizontales y verticales.

Se debe tener en cuenta que de las placas Petri preparadas con medio de cultivo para
sembrar, debe eliminarse el agua de sinéresis (condensación) antes de efectuar dicha
operación. Para tal fin es aconsejable preparar las placas con 24 hs. De anticipación y
dejarlas invertidas a temperatura ambiente.

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F) AISLAMIENTO

El objeto es obtener cultivos en estado puro, operación imprescin-


dible y previa al estudio e identificación de una especie bacte-
riana. Se pueden realizar aislamientos por métodos generales y por
métodos especiales.

1) Métodos generales de aislamiento.

Estos métodos utilizan medios de cultivos sólidos en placa Petri:

a. Por diluciones sucesivas:

En general, para preparar diluciones seriadas, se parte de


una solución concentrada y se preparan series de diluciones
al décimo (1:10) o al medio (1:2). De esta manera se obtiene
una serie de soluciones relacionadas por ejemplo por un fac-
tor de dilución 10 es decir 1/10; 1/100; 1/1000 y así sucesi-
vamente. O la otra serie es 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 etc.

Por ejemplo: si partimos de una solución de 50mg/ml de una


sustancia (Solución A):
- Dilución 1/10: 1ml de la solución A + 9 ml de
agua= una solución de 5 mg/ml (dilución 1:10).
- Dilución 1/2: 5 ml de la solución A + 5 ml de
agua= una solución de 25 mg /ml (dilución 1:2).

Se homogeneiza la muestra y se carga el asa por única vez.


Luego se pasa el asa de un tubo a otro. Estos tubos contienen
agar a 45 ºC. De esta manera el primer tubo contendrá mayor
concentración de microorganismos que el último. Luego se pasa
el contenido de los tubos a las placas Petri y de allí a los
tubos con agar en pico de flauta (slant o tubo inclinado).

b. Por agotamiento en superficie en una placa:

Es el método más utilizado. Se prepara una placa Petri con el


medio de cultivo a la que se le elimina el exceso de humedad
según se indicó anteriormente.

Primero, se marca la parte exterior de la contratapa de


acuerdo al esquema. Se carga el asa con la muestra, se depo-
sita en un punto de la superficie del sector (I) cercano al
borde, y se extiende en el mismo con estrías próximas y para-
lelas. A continuación se quema el asa y se deja enfriar.

Se gira la placa 90 º, se pasa el asa una vez sobre la última


estría de la región ya inoculada y se arrastra al sector (II)

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efectuando sobre él la siembra sin superponer las estrías con


las realizadas antes.

Se quema nuevamente el asa y de la misma manera se estría el


sector (III).

Luego de quemar el asa, en el sector (IV) se realizan estrías


con el material que se arrastra de (III), más amplias y que
terminan en el centro de la placa.

Cualquiera sea el método empleado, si se realiza correctamen-


te, podrán obtenerse colonias aislada. Estas pueden pertene-
cer a distintas especies bacterianas, las que generalmente se
diferencian macroscópicamente.

En general cada colonia se considera formada a partir de una


célula bacteriana, aunque esto no es del todo cierto pues
puede darse el caso de que dos o más células den origen a una
colonia. Si todas pertenecen a una misma especie, la colonia
resultante será pura. Caso contrario, la finalidad del traba-
jo no se habrá cumplido, no lográndose el aislamiento.
Para comprobar la pureza de la colonia aislada se puede rea-
lizar una coloración de Gram. Para ello se pica la colonia y
se la identifica con una marca en el fondo de la placa con
un número identificatorio. Se hace el extendido con una por-
ción de la colonia y si todas las células observadas coinci-
den morfológicamente, se repica el resto de la colonia en un
tubo con agar en estría para obtener un cultivo puro.

A veces la igualdad morfológica en la coloración de Gram re-


sulta engañosa por existir bacterias de diferentes especies
(pero iguales morfológicamente) presentes dentro de la colo-
nia seleccionada pero en muy bajo número debido a su imposi-
bilidad de desarrollar. Por consiguiente es necesario reali-
zar siempre aislamiento para observar la uniformidad de las
colonias.

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2) Métodos especiales de aislamiento.

Métodos derivados de las propiedades de las bacterias:

Consisten en hacer desarrollar la mezcla bacteriana, en un medio


de cultivo especial, donde una especie puede dar lugar a colonias
de un color que la identifiquen (ya sea por cambios de pH o por
precipitación de elementos del medio). Un ejemplo, es el aisla-
miento en el llamado agar- lactosa- verde-brillante- bilis, donde
las bacterias coliformes dan colonias color rojo intenso en el
centro con un halo rosado que destacan del fondo azul del medio.

a. Métodos biofísicos: Se basan en el empleo de condiciones fí-


sicas determinadas que afectan a ciertos microorganismos y
no a otros.

Empleo de temperaturas disgenésicas: La mayoría de las


bacterias desarrollan bien a 37ªC. Sin embargo hay es-
pecies que lo hacen hasta 40ºC -42ºC y aún más, otras
por debajo de 35 ªC. Estas características se pueden
usar para la separación de especies.
Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Los
esporos de las bacterias son formas de resistencia que
toleran temperaturas que resultan letales para las
formas vegetativas. Este comportamiento se aprovecha
para la separación de las especies que tienen la capa-
cidad de esporular.
Movilidad del microorganismo: Las bacterias móviles
desarrollan en gran parte de la superficie del medio,
mientras que las inmóviles lo hacen solo en el punto
de siembra.
b. Métodos biológicos: Estos métodos utilizan la propiedad que
tienen
ciertos animales de laboratorio de ser receptivos a algunos
microorganismos.

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3. PRINCIPALES MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE


ALIMENTOS

A. MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS

El análisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y número de mi-
croorganismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin embargo ninguno de los
métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto de microorganis-
mos que existe en un determinado alimento.

Son cuatro los métodos básicos utilizados para investigar el número “total” de microorga-
nismos:

1.- Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables
2.- Método del número más probable (NMP) de gérmenes como cálculo estadístico del
número de células viables
3.- Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células viables con
capacidad reductora
4.- Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para las no
viables

El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación del número de


células viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento.

Los recuentos totales deben hacerse en función de uno de los siguientes factores:
- método de muestreo utilizado
- distribución de los microorganismos en la muestra
- naturaleza de la microflora del alimento
- naturaleza del alimento
- antecedentes del alimento
- adecuación nutricional del medio de cultivo
- temperatura y medio de incubación
- pH, aw, potencial de oxidación reducción del medio
- tipo de diluyente utilizado
- número relativo de microorganismos en la muestra

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se


desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e
incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden
considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos
microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir
una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición
del medio y el tiempo de incubación.

El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de –


34º C a > 90º C. En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos:
a) los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura cuya tem-
peratura: psicrótofos

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b) los que crecen entre 20 – 30º C, con una temperatura óptima de creci-
miento está entre 30 – 40º C: mesófilos
c) los que crecen por encima de los 45º C: termófilos

Recuento de aerobios mesófilos

En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarro-
llarse a 30º C en las condiciones establecidas.

En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos.

Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condi-


ciones higiénicas de la materia prima.

Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patóge-


nos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de
flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son reco-
mendables recuentos elevados.

Un recuento elevado puede significar:


- Excesiva contaminación de la materia prima
- Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración
- La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos
- La inmediata alteración del producto

El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimen-


tos.

Métodos normalizados

ISO 4833 Directiva general para el recuento de microorganismos. Método por re-
cuento de colonias a 30º C

Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, verti-


do en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a
examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de
otros productos.

En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra


o de la suspensión madre. Incubación a 30º C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir
del número de colonias obtenidas en las placas de Petri, calcular el número de microor-
ganismos por mililitro o por gramo de muestra.

AF V 08-01 Método de rutina para el recuento de microorganismos. Método de recuen-


to de las colonias a 30º C

Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, verti-


do en una placa de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a exa-
minar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de
otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obteni-
das de la muestra o de la suspensión madre. El recuento podrá ser realizado utilizando
un sembrador espiral (NF V08-100) Incubación a 30º C, en aerobiosis durante 72 horas.
A partir del número de colonias obtenidas en las placas de Petri escogidas, calcular el
número de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

ESQUEMA:

A EROBIOS M ESÓFILOS
ISO4833 AF V 08-051

10 g muestra +
90 ml agua peptona 10-1

Diluciones decimales

1ml
10-2 10-3 10-4
1ml 1ml 1ml

Agar PCA
Incubación
30ºC / 72 h

Recuento de colonias

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

B. MOHOS Y LEVADURAS

Los hongos son organismos eucarióticos, cuya pared celular contiene quitina y β-
glucanos. Son unicelulares o filamentosos, de reproducción sexual o asexual, saprófitos
mutualistas o parásitos.

En función de la temperatura de crecimiento se dividen en:


- termófilos: 20 – 50º C (40 – 50º C)
- termolatentes: máximo 50º C, mínimo por debajo de 20º C
- mesófilos: 10 – 40º C (20 – 35º C)
- psicrófilos: por debajo de 10º C (por debajo de 20º C)

Los hongos engloban los mohos y las levaduras. Los mohos son multicelulares filamento-
sos cuyo crecimiento en un alimento se reconoce por su aspecto aterciopelado. Las leva-
duras crecen en agregados de células independientes, cuando crecen en los alimentos
forman colonias características.

- Mohos habitualmente transmitidos por los alimentos:

División: Zygomyceta
Clase: Zygomycetes
Orden: Mucorales
Familia: Mucoraceae
Género: Mucor, Rhizopus, Thamnidium
División: Ascomyceta
Clase: Pleitomycetes
Orden: Eurotiales
Familia: Trichocomaceae
Género: Byssochlamys, Eupnicillium, Emericella, Eurotium

División: Deuteromyceta
Clase: Coelomycetes
Familia: Coelomycetaceae
Género: Colletotrichum

Clase:Hypomycetes
Orden: Hypomycetales
Familia: Moniliaceae
Género: Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Penicillium,.....

- Levaduras habitualmente transmitidos por los alimentos:

División: Ascomycotina
Familia: Saccharomycetaceae
SubFamilia: Nadsonioideae
Género: Hanseniaspora

SubFamilia: Saccharomycotoideae
Género: Debaryomyces, Issatchenkia, Kluyveromyces, Saccharomyces, ................

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

SubFamilia: Schizosaccharomycotoideae
Género: Schizosaccharomyces

División: Deuteromycotina
Familia: Crypteococcaceae
Género: Brettanomyces, Candida, Crytococcus...............

El significado de la contaminación fúngica de los alimentos viene determinado por su ca-


pacidad para deteriorar los alimentos, produciendo defectos en el aspecto modificaciones
químicas, alterando el valor nutricional, variando sus características organolépticas y difi-
cultando su conservación. Algunos mohos pueden producir infecciones en el hombre e
incluso reacciones alérgicas. Además, muchos mohos producen gran número de toxinas
a las que el hombre es susceptible.

Las micotoxinas son un grupo de metabolitos tóxicos, producidos por ciertas cepas de
mohos cuando crecen en unas condiciones determinadas, en una amplia variedad de
alimentos.

El estudio de los mohos productores de micotoxinas ha sido bastante completo debido a:


- la ubicuidad de sus esporas
- que pueden estar presentes en alimentos organolepticamente aceptables
- que los alimentos constituyen un sustrato orgánico adecuado para su crecimiento.
Estos mohos producen micotoxinas que al ser ingeridas por los animales originan me-
tabolitos tóxicos secundarios, que pasan a la leche, carne o huevos y son absorbidos
indirectamente por el hombre
- al riesgo cancerígeno, sobre todo de las aflatoxinas

Toxicológicamente nos interesan más las micotoxinas y los factores que puedan afectar
la capacidad de su producción, que los mohos productores.

En la mayoría de los casos las intoxicaciones son producto de la acción combinada de


varias micotoxinas. Rara vez un alimento es contaminado por una sola especie y cada
especie suele producir varias micotoxinas.

Los alimentos que más fácilmente son contaminados por micotoxinas y las micotoxinas
más frecuentes son:
1.- Semillas oleaginosas y alimentos derivados
2.- Aceites vegetales no refinados
3.- Cereales y alimentos derivados
4.- Frutos secos
5.- Zumos de frutas
6.- Legumbres
7.- Bebidas alcohólicas
8.- Leche y productos lácteos
9.- Carne y productos cárnicos

Para la prevención y control sanitario de las intoxicaciones por micotoxians es necesario:


- conocer los factores que afectan al crecimientos de los mohos y a la producción de
las micotoxinas
- conocer el periodo entre la germinación y la producción de micotoxinas, para estimar
el potencial tóxico del alimento
- evitar la contaminación
- evitar, durante la manipulación, las posibles lesiones de los granos y las frutas

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

- mantener unas condiciones de almacenamiento que eviten en lo posible el crecimien-


to de los mohos

El recuento de mohos y levaduras es un índice de las condiciones higiénicas de una ma-


teria prima y de las condiciones de manipulación. Su significado es similar al de los aero-
bios mesófilos.

Métodos normalizados

ISO 7954 Directiva general para el recuento de levaduras y mohos. Técnica de enu-
meración de las colonias a 25º C

Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo selectivo de-


terminado, en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el produc-
to a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el
caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales
obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas en aerobio-
sis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días. Cálculo del número de levaduras y mohos por mililitro o
por gramo de muestra a partir del número de colonias obtenidas en las placas escogidas
a los niveles de dilución que dan un resultado significativo.

NF V 08-059 Método de rutina para el recuento de levaduras y mohos. Técnica de enu-


meración de las colonias a 25º C

Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo definido, reparti-


do en placas de Petri, con una cantidad definida de muestra por ensayo si el producto a
examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de
otros productos. El recuento puede ser igualmente realizado en profundidad. Incubación
de las placas en aerobiosis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días. En el caso de recuento de es-
pecies de mohos supuestos conocidos la temperatura de incubación puede ser diferente
de 25º C, buscando después el acuerdo entre las dos partes (20º C ó 22º C) e indicándo-
lo en el informe del ensayo. A partir del número de colonias obtenidas en las placas de
Petri retenidas, calcular el número de levaduras y mohos por mililitro o por gramo de
muestra.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

ESQUEMA:

M OHOS Y LEVA DURA S


ISO7954 AF V 08-059

10 g muestra +
90 ml agua peptona 10-1

Diluciones decimales

1ml
10-2 10-3 10-4
1ml 1ml 1ml

Agar
Incubación Saboureaud
25ºC / 5 días

Recuento de mohos y levaduras

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

C. ENTEROBACTERIAS

Cada vez es más frecuente recurrir a la determinación de microorganismos indicadores


para determinar la inocuidad de un alimento. Estos indicadores deben cumplir una serie
de requisitos:
- fácil y rápido de detectar
- fácilmente diferenciable de otros representantes de la flora de un alimento
- tener antecedentes de asociación con el patógeno del que es indicador
- ser un microorganismos con cifras, que en teoría coincidan con las del patógeno a
indicar
- tener condiciones y velocidad de crecimiento semejantes a las del patógeno
- tener una tasa de muerte paralela a del patógeno y que persista algún tiempo más
que este
- no existir en alimentos exentos del patógeno, salvo en cantidades mínimas

Actualmente se reconocen 29 géneros de enterobacterias, que incluyen más de 100 es-


pecies diferentes. El 99% de los aislamientos clínicos pertenecen únicamente a 23 espe-
cies.

Atendiendo a su poder patógeno se dividen en dos grupos:


- Enterobacterias patógenas: EScherichia coli enteropatógeno, Shigella, Salmone-
lla, Yersinia
- Enterobacterias oportunistas: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus,
Hafnia, Edwardsiella, Providencia, Morganella

El recuento total de enterobacterias se utiliza como indicador de contaminación fecal, y


como uno de los indicadores de Buenas Prácticas de Fabricación. Se utiliza como indica-
dor de la calidad microbiológica de alimentos procesados, y recuentos elevados señalan
una elaboración inadecuada o una contaminación posterior, o ambas cosas a la vez;
siempre implica un riesgo higiénico-sanitario.

Métodos normalizados

ISO 7402 Directiva general para el recuento, sin revivificación, de las Enterobacteria-
ceae. Técnica del NMP y método por recuento de colonias

Esta directiva expone dos métodos para el recuento de enterobacterias. El primero de


ellos se recomienda utilizar en muestras que se sospecha que presentan contaminación
baja (1 – 100 por mililitro o gramo de muestra). Para ello se siembran en tres tubos de
medio de doble concentración, una cantidad determinada de la muestra problema si la
muestra es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los
otros productos. Después y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con me-
dio de concentración simple con la primera dilución decimal obtenida a partir de la mues-
tra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 35º C ó 37º C (según
acuerdo) durante 24 horas. A partir del número de tubos positivos confirmados se calcula
el número más probable de Enterobacteriaceae por mililitro o por gramo de muestra de
ensayo mediante la tabla NMP.

El segundo método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal
violeta glucosa, en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a exami-

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

nar, si el producto es líquido o una cantidad determinada de la suspensión madre en el


caso de los otros productos. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales
obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Incubación de las
placas a 35º C ó 37º C durante 24 horas +/- 2 horas. Cálculo del número de Enterobac-
teiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del número de colonias característi-
cas confirmadas obtenidas en las placas de Petri

NF V 08-054 Método de rutina para la enumeración de Enterobacteriaceae mediante el


recuento de colonias

Este método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal viole-
ta glucosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a exami-
nar, si el producto es líquido o una cantidad determinada de la suspensión madre en el
caso de los otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa del mismo medio.
En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la
muestra problema o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 30º C durante
24 horas +/- 2 horas. Cálculo del número de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo
de muestra, a partir del número de colonias características confirmadas obtenidas en las
placas de Petri.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

ESQUEMA:

enteroba cteria s
ISO7402 AF V 08-054

10 g muestra +
90 ml agua peptona 10-1

Diluciones decimales

1ml
10-2 10-3 10-4
1ml 1ml 1ml

Agar VRBG +
Incubación 2ª capa
30ºC / 24 horas

Recuento. Colonias Rosas

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

D. COLIFORMES TOTALES

En conjunto los coliformes están representados por cuatro géneros de la familia Entero-
bacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, y Klebsiella. Todos ellos son fer-
mentadores de la lactosa en 48 horas.

Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, y también en el suelo, las


plantas, etc. No son muy buenos como indicadores, pero se utilizan como indicadores de
contaminación fecal y son buenos indicadores de un proceso o de un estado sanitario
poco satisfactorio.

En un recuento de coliformes es conveniente determinar la incidencia de E. coli dado que


es la especie más indicativa de una contaminación fecal.

Hay que destacar que el recuento de coliformes tiene sus limitaciones como indicador en
ciertos alimentos:
- Productos lácteos: reflejan el estado higiénico del establo y de la planta industrial, no
es indicador de contaminación fecal
- Hortalizas congeladas blanqueadas: la presencia de E. coli puede ser indicativo de
que en el proceso existe algún problema. Los coliformes están habitualmente asocia-
dos con la vegetación
- Derivados de aves de corral: los coliformes no son indicadores higiénicos apropiados,
las aves pueden tener salmonella antes del sacrificio

A pesar de todo lo anterior, los coliformes tienen un valor acreditado como indicadorres
de inocuidad. Su principal aplicación como integrantes de un programa para la determi-
nación de la inocuidad de los alimentos la tienen dentro del sistema APPCC.

Pueden crecer en presencia de sales biliares, que inhiben el crecimiento de las bacterias
Gram negativas. Son capaces de fermentar la lactosa con producción de gas, siendo esta
característica suficiente para hacer determinaciones presuntivas. Su facilidad de cultivo y
de diferenciación los hace casi ideales como indicadores.

Métodos normalizados
I
SO 4831 Directiva general para el recuento de coliformes

Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo


de doble concentración con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una
cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de otros productos. A continua-
ción, se siembran tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de concentración
simple con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una cantidad determi-
nada de la suspensión madre en el caso de otros productos. Después y en las mismas
condiciones, se siembran tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concen-
tración simple con una cantidad determinada de la primera dilución decimal obtenida a
partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 30, 35 ó
37º C durante 24 horas para los de doble concentración, y 24 – 48 horas los de concen-
tración simple. A partir de cada tubo incubado que presenta desprendimiento de gas en la
campana se inocula con asa un tubo con medio de confirmación (BGBL). La reacción es
positiva cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Duirham,

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

como consecuencia de la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares. Se


realizan las lecturas a las 24 – 48 horas.
A partir del número de tubos positivos confirmados se calcula el número más probable
de coliformes por mililitro o por gramo de muestra de ensayo.

NF V 08-050 Método de rutina para la enumeración de coliformes mediante el recuento


de colonias a 30º C.

Se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta lactosa, en
una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una can-
tidad determinada de la suspensión madre en el caso de otros productos. Se recubre la
placa con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones, siembra de
diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra o de la suspensión madre. Incuba-
ción de las placas a 30º C 24 horas. Cálculo del número de coliformes por mililitro o por
gramo de muestra, a partir del número de colonias características obtenidas en las placas
de Petri.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

ESQUEMA:

Coliform es tota les ISO4831

10 g muestra +
90 ml agua peptona

10 ml
10-1
10 ml
1 ml 10-2
Caldo lactosado (con campana Durham)

37ºC / 48 horas
Gas = +

Confirmación

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

Coliform es tota les ISO4831

Confirmación

Tubos positivos

Asa de siembra

Tubos con Caldo Verde brillante


con campana Durham
45ºC / 24 horas

Gas = +

COLIFORM ES TOTA LES NF V 08-050

10 g muestra +
90 ml agua peptona 10-1

Diluciones decimales

1ml
10-2 10-3 10-4
1ml 1ml 1ml

Agar VRBA
Incubación
30ºC / 24 horas

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

E. ESCHERICHIA COLI

Escherichia coli es un coliforme fecal. Los coliformes fecales son un grupo de microorga-
nismos seleccionados por incubación de los inóculos procedentes de un caldo de enri-
quecimiento de coliformes a temperaturas superiores a las normales (44 +/-0,5º C) y son
muy indicativos de una posible contaminación de origen fecal del alimento. Se definen por
la producción de ácido y de gas en caldo EC a 44 – 46º C (44,5 – 45,5º C). Las cepas
enterohemorrágicas de E. coli no crecen a 44,5º C en la formulación convencional de EC,
pero lo hacen cuando el porcentaje de sales biliares se reduce del 0,15 al 0,112%.

Sólo unas pocas cepas son patógenos verdaderos, enteropatógenos; o patógenos opor-
tunistas.

Es muy resistente en suelo y agua. Muere a 60º C en 15 minutos, y con 0,5 p.p.m. de
cloro.

Vive en el tracto intestinal del hombre y animales, por eso su presencia en un alimento
indica contaminación directa o indirecta de origen fecal. Es indicador de posibles patóge-
nos entéricos en el agua, moluscos, productos lácteos,.....

Métodos normalizados

ISO 7251 Directiva general para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica
del NMP

Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de enriquecimiento selectivo de doble


concentración con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una
cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. A continuación se
siembran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una canti-
dad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la
suspensión madre para otros productos. Después y en las mismas condiciones se siem-
bran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentración simple con la primera dilu-
ción decimal obtenida de la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se
incuban a 35 – 37º C según acuerdo durante 24 – 48 horas, y se realiza el examen en
busca de tubos con gas. A partir de cada tubo que muestra desprendimiento de gas se
inocula un tubo con medio selectivo líquido EC. La reacción es positiva cuando se produ-
ce desprendimiento de gas recogido en la campana de Durham, como consecuencia de
la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares a 45º C. Se hacen las lecturas
a las 24 y 48 horas. A partir del número de tubos positivos en medio selectivo EC se
siembra una nueva serie de tubos con agua de triptona. Incubación a 45º C, 24 – 48
horas y se examina la producción de indol. A partir de los tubos positivos a la producción
de gas en medio selectivo y a la producción de indol en agua de triptona, se calcula el
número más probable de E. coli por mililitro o gramo de muestra de ensayo.

NF V 08-053 Método de rutina para el recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa posi-


tivos

Este método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar PTX o PTG, en una
placa de Petri con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una
cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. En las mismas con-
diciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión
madre. Incubación de las placas a 44º C durante 18 – 24 horas. Cálculo del número de
Escherichia coli por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias ca-
racterísticas obtenidas en las placas de Petri.

ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación 26


MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

ESQUEMAS:

Escherichia coli ISO7251

10 g muestra +
90 ml agua peptona

10 ml
10-1
10 ml
1 ml 10-2
Lauril triptosa (con campana Durham)

37ºC / 48 horas
Gas = +

Confirmación

ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación 27


MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

Escherichia coli ISO7251

Confirmación

Tubos positivos

Asa de siembra

Tubos con Caldo EC con campana

45ºC / 24 horas

Gas = +

Tubos positivos

Asa de siembra

Agua de triptona

37ºC / 24 horas Amarillo -


0,5 ml reactivo
Kovac´s
Prueba del indol Rojo +

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

Escherichia coli NF V 08-053

10 g muestra +
90 ml agua peptona 10-1

Diluciones decimales

1ml
10-2 10-3 10-4
1ml 1ml 1ml

Agar
Incubación CROMOGÉNICO
44ºC / 24 horas

Colonias Violáceas

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

F. STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Staphylococcus aureus es un microorganismo de distribución en el medio ambiente muy


amplia, se encuentra de forma natural en el hombre, los animales de granja, el polvo y
diversos alimentos y otros productos en los que la contaminación se debe principalmente
a los manipuladores.

El principal problema a nivel de la microbiología de los alimentos es que S. aureus puede


producir una enterotoxina termoestable, y otras toxinas.

Estas toxinas actúan sobre receptores intestinales cuyo estímulos alcanzan el centro del
vómito del cerebro, por lo que deberían considerarse como neurotoxinas.

El mayor inconveniente de estas toxinas es su elevada resistencia a los tratamientos tér-


micos habituales, soportando tratamientos de pateurización a 72º C / 13 segundos, e in-
cluso 100º C / 30 minutos. Se inactivan a temperaturas de esterilización de 115º C, resis-
ten la irradiación y las enzimas proteolíticas.

Para la producción de toxinas en un alimento tienen que concurrir los siguientes requisi-
tos:
- contaminación del alimento por Staphylococccus aureus: en origen, por los manipula-
dores o por falta de higiene en locales o utensilios
- la multiplicación de una cepa enterotoxigénica del microorganismo en el alimento al-
canzando al menos 106 células por gramo.

Staphylococcus auerus se multiplica en alimentos proteicos, soporta concentraciones


normales de azúcar e incluso elevadas de sal y el tratamiento con nitritos.

Métodos normalizados
ISO 6888 Directiva general para el recuento de Staphylococcus aureus. Método me-
diante enumeración de colonias

Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo sólido, preparan-


do dos series de placas, con una cantidad determinada de la muestra problema si es lí-
quida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. En las
mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la
suspensión madre. Incubación de las placas a 35º C durante 24 – 48 horas. Cálculo del
número de Staphylococcus aureus por mililitro o por gramo de muestra a partir del núme-
ro de colonias características obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilución
que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa.

NF V 08-057-1 Método de rutina para la enumeración de estafilococos cuagulasa positi-


vos mediante recuento de colonias a 37ºC. Técnica de confirmación de las colonias.

Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo sólido selectivo,


repartido en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra problema si es
líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. Incu-
bación de las placas a 37º C durante 24 – 48 horas. Cálculo del número de estefilococos-
cogulasa positivos por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias
características y/o no características obtenidas en las placas escogidas a los órdenes de
dilución que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagu-
lasa.

ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación 30


MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

MÉTODOS:

Staphylococcus aureus

ISO6888 AF V 08-057 - 1

10 g muestra +
90 ml agua peptona 10-1

Diluciones decimales

1ml
10-2 10-3 10-4 Asa de Dirglasky
1ml 1ml 1ml

Placas de
Incubación Baird - Parker
37ºC / 48 horas

Colonias Negras o Grises con zona parcialmente opaca Confirmación

ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación 31


MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

Staphylococcus aureus
Confirmación

Asa de siembra

Caldo Cerebro Corazón Caldo RM -VP

37ºC / 24 horas Prueba de la acetoína

1 ml caldo
+ 0,3 ml A + 0,1 ml B
Prueba de la coagulasa
15 min
0,5 ml caldo
+ 0,5 ml plasma conejo Rojo fresa = +

37ºC / 24 horas

Coagulación = +

37ºC / 24 horas

ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación 32


MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

G. SALMONELLA

El género Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias y constituye un grupo


muy complejo de microorganismos patógenos para el hombre, pudiendo afectar a diver-
sos animales.

Comprende dos especies:


- Salmonella enterica dividida en seis subespecies
- Salmonella bongori

Todas ellas se pueden identificar por características fenotípicas fáciles de ver.

Métodos normalizados

ISO 6579 Directiva general concerniente a los métodos de investigación de Salmonella.

Este método se basa en las investigación de Salmonella en cuatro etapas sucesivas:

. Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agau de


peptona tamponada e incubación a 37º C (35º C) durante 16 – 20 horas
. Enriquecimiento en medios selectivos líquidos: Con el cultivo del preenriqueci-
miento siembre en verde malaquita con cloruro de m,agnesio e incubación a 42º C 24
horas, y en caldo selenito cistina e incubación a 37º C 24 horas y 24 horas suplementa-
rias.
. Aislamiento e identificación: A partir de los cultivos anteriores se siembran dos
medios sólidos, agar rojo fenol verde brillante y otro medio selectivo a elección. Ambos se
incuban a 37º C 24 horas y si es necesario 48 horas.
. Confirmación: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirma-
ción en los medios de ensayos bioquímicos y serológicos apropiados.

V 08-052 Método de rutina para la investigación de Salmonella

Este método se basa en las investigación de Salmonella en cuatro etapas sucesivas:

. Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agua de


peptona tamponada e incubación a 37º C durante 16 – 20 horas
. Enriquecimiento en medios selectivos líquidos: Con el cultivo del preenriqueci-
miento siembra en caldo verde malaquita con cloruro de magnesio e incubación a 42º C
24 horas, y en caldo selenito cistina e incubación a 37º C 18 – 24 horas.
. Aislamiento e identificación: A partir de los cultivos anteriores se siembra en un
medio sólido selectivo a elección. Se incuba a 37º C 24 horas y si es necesario 48 horas
y se examinan las características de las colonias.
. Confirmación: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirma-
ción en los medios de ensayos bioquímicos y serológicos apropiados.

ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación 33


MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

ESQUEMAS:

sa lm onella
ISO6579 AF V 08-052

25 g muestra +
225 ml agua peptona

37ºC / 20 horas

0,1ml 2 ml

Caldo Rappaport Caldo Selenito - Cistina

42ºC / 24 horas 37ºC / 24 horas

XLD XLD
Hektoen Hektoen

Colonias Negras

ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación 34


MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

sa lm onella

Colonias Negras

Confirmación

Asa de siembra:
siembra en estría
por agotamiento
Agar nutritivo

37ºC / 24 horas

Tira API

37ºC / 20 horas

ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación 35