APUNTES DE CLASES 2012

FIJACION
PROF. TM. PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ

Definicin
Fijacin: proceso mediante el cual los elementos constitutivos de las clulas y por tanto de los
tejidos, son mantenidos en su estado fsico y parcialmente en su estado qumico lo ms similar al
vivo, lo que les permite resistir tratamientos posteriores sin que ocurra prdida, distorsin o
descomposicin de las muestras de manera significativa. En realidad nunca se alcanza a mantener
igual al estado en vivo

Objetivo: detener el proceso autoltico de las clulas y conservarlas, en la medida de lo

posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto, es un mtodo
histolgico destinado a facilitar la obtencin de preparaciones duraderas que conserven su
estructura morfolgica y qumica y, que permita realizar posteriormente los procedimientos de
coloracin, identificacin e interpretacin, que contribuyen al conocimiento profundo de su
morfologa, funcin y alteraciones en los diversos procesos patolgicos.

Principios Generales.
1. No existe un mtodo universal de fijacin, un fijador adecuado para un tejido puede no
serlo para otro.
2. No todos los fijadores conservan indefinidamente un tejido.
3. Un defecto de fijacin jams podr ser corregido
4. Es intil realizar un estudio histolgico sobre una muestra mal fijada.

Condiciones ideales de los fijadores.

1. Actuar con rapidez; detener los procesos de degradacin que ocurren durante o
tras la muerte celular: autolisis ( liberacin de enzimas lisosmicas) y putrefaccin
(presencia de microorganismos que liberan enzimas lticas), la velocidad de
degradacin depende de la naturaleza de la muestra.
2. Poseer un alto poder de penetracin para asegurar la correcta fijacin de toda la
muestra. Es importante diferenciar capacidad de penetracin de la solucin y
fijacin de la muestra, no son necesariamente dos procesos simultneos.

3. Insolubilizar los componentes celulares, principalmente protenas, de modo de

evitar la prdida de elementos solubles durante o despus de la fijacin
4. Conservar en la medida de lo posible los detalles estructurales en un patrn
morfolgico similar al que presentaban in vivo.
5. Entregar al tejido una consistencia que permita y facilite los procesamientos
posteriores.
6. Impedir la formacin de estructuras artificiales (vacuolas y espacios)
7. Permitir y facilitar la aplicacin de procedimientos posteriores.
8. Ser econmico, estable, fcil manejo y baja toxicidad.
No existe el fijador que rena todas las condiciones anteriores, de manera que es
necesario sopesar de acuerdo a los objetivos del estudio cual de todos los fijadores es el
ms apropiado.
Tipos de fijacin.
Segn mecanismo:
A. fijacin histolgica o citolgica: conservar la arquitectura y estructura de los tejidos
y clulas sin considerar los cambios moleculares, busca morfologa.
B. Fijacin histoqumica: busca preservar la composicin molecular y bioqumica
Segn Forma:
A. Perfusin: penetra el fijador por los vasos sanguneos, se utiliza solo en modelos de
experimentacin animal.
B. Instilacin: gotas del fijador sobre el tejido
C. Inmersin: sumergir la muestra entera en el lquido fijador, debe ser 10 a 30 veces
el volumen del fijador en relacin a la muestra.
Segn mecanismo de accin de los fijadores:
A. Fsicos
B. Qumicos

Fijacin fsica
Son de dos tipos principales: frio y calor.
FISICOS
Calor hmedo
Desecacin
Ultrasonido
Microondas
Frio
Calor seco
Liofilizacin

CRIODESECACIN O LIOFILIZACION: son dos manipulaciones complementarias de carcter

fsico: una congelacin instantnea y luego desecacin por sublimacin directa del agua
congelada a vapor en una bomba de vaco. Procedimiento: congelar el tejido fresco, con
lo que se detienen procesos celulares de autolisis y putrefaccin . Lo ideal es congelar a 170c ( con nitrgeno lquido) con Isopentano previamente enfriado hasta su punto de
congelacin a -170c, ste permite que la congelacin de la muestra sea ms homognea
e instantnea. Pueden usarse crioprotectores (glicerol, sacarosa) que minimizan la
formacin de cristales de hielo. Luego de congelada la muestra, se seca por evaporacin
lenta en una cmara de vacio (sublimacin del agua).
CRIOSUSTITUCION: se fundamenta en la sustitucin lenta y progresiva del agua congelada
por una mezcla de alcohol etlico, acetona y propilenglicol a muy baja temperatura (-40).
El principal problema de esta tcnica es la reversibilidad.
Fijacin por calor: mtodo muy antiguo, se calienta la muestra hasta punto de ebullicin,
antes a la llama, hoy con el calor generado por microondas (clases posteriores)
Fijacin qumica
Empleo de agentes qumicos que detienen la putrefaccin y la autolisis de las muestras
Los agentes qumicos tienen capacidad de interactuar con los componentes del tejido,
tales como protenas, glicoprotenas, proteoglicanos, lpidos, glicolpidos, lipoprotenas,
pigmentos, cidos pcticos y nuclicos; como as tambin, la capacidad de preservar la
composicin y localizacin de carbohidratos: celulosa y almidn en vegetales, quitina en
insectos o glucgeno en tejidos animales y depsitos metlicos (Fe+2, Cu+2, Al+3, Cd+2,
Pb+2, As-3, Cr+2.
Los agentes qumicos se clasifican de acuerdo a sus caractersticas en :

1. Fijadores coagulantes y no coagulantes.

Coagulantes: provocan coagulacin de las protenas del citoplasma, destruyen y
distorsionan los organlos como las mitocondrias y grnulos secretores, pero no provocan
serias alteraciones en el material de soporte extracelular que son slidos antes de
comenzar la fijacin. La unin esponjosa del retculo compuesto por las protenas y el
fijador es fcilmente disuelta por los medios de inclusin e impregnacin.
No Coagulantes: reaccionan con los diferentes sitios qumicos de las macromolculas
tisulares estableciendo a modo de puente uniones que originan una malla que entrelaza,
convierten el citoplasma en un gel insoluble y cada organelo es bien preservado pero no
es realmente penetrado por los medios de inclusin. Es un artefacto de contraccin de
espacios . Algunas mezclas de fijadores tienen fijadores coagulantes y no coagulantes
combinando las ventajas de ambos.

COAGULANTES
ETANOL
METANOL
ACETONA
ACIDO PICRICO
ACIDO TRICLOROACETICO
PROPANOL

NO COAGULANTES
FORMALDEHIDO
GLUTARALDEHIDO
GLIOXAL
HIDRATO DE CLORAL
SALES DE MERCURIO
TETROXIDO DE OSMIO

2. Fijadores aditivos y no aditivos

3. Fijadores reductores y oxidantes

QUIMICOS
OXIDANTES
REDUCTORES
Tetroxido de osmio
formaldehido
Acido crmico
glutaraldehdo
Acido pcrico
Glioxal
Bicloruro de mercurio
Acreolena
Dicromato de potasio
Metanol
Acetona
Paraldehdo
Acido actico
Etanol

FISICOS
Calor hmedo
Desecacin
Ultrasonido
Microondas
Frio
Calor seco
Liofilizacin

4. Segn mecanismo de fijacin: de acuerdo a este criterio, los agruparemos en 4

categoras.

Se conocen cuatro mecanismos de accin principales:

1. DESHIDRATANTES
2. CAMBIO DEL ESTADO COLOIDAL DE LAS PROTEINAS
3. FORMACION DE SALES
4. RETICULARIZACION DE LAS PROTEINASDESHIDRATANTES

1.- DESHIDRATANTES.
Por ser sustancias HIGROSCOPICAS, actan desplazando agua de las protenas y la libre, rompen
los puentes de hidrgeno, destruyen la estructura terciaria de las protenas por denaturacin. Las
protenas solubles coagulan y destruyen los organlos, no precipitan cidos nuclicos. Se establece
una COMPETENCIA por las molculas de agua entre las protenas y el agente deshidratante, stos
agentes higroscpicos se estabilizan formando puentes de H con los iones bipolares del agua
sustrada a las protenas. Fijan y deshidratan al mismo tiempo. Carecen de efecto mordiente. Se
usan principalmente para citologa

A. ALCOHOL ETILICO. CH3-CH2OH

Caractersticas: Inflamable, transparente, voltil, utilizado en concentracin 70-90%
Usos: preserva bien glicgeno y enzimas, adems de pigmentos. Uso en citologa.
VENTAJAS
fija y deshidrata
alta velocidad de penetracin
Precipita rpido protenas y el glicgeno,
poco tiempo de fijacin CONTROLAR,
bactericida.
Preserva glucgeno, pigmentos y algunas
enzimas.
Uso en extensiones citolgicas. (lacas
fijadoras)

DESVENTAJAS
fuerte reductor (incompatible con
dicromato y osmio),
no fija bien cromatina (disuelve cidos
nuclicos y extrae lpidos),
endurece y contrae, pierde actividad al
deshidratar (pues se va hidratando),
carece de efecto mordiente, desplaza
sustancias al fijar por la velocidad de
penetracin,
extrae lpidos

B. ACETONA

CH3-CO-CH3

Caractersticas: transparente, inflamable y voltil. Uso sin diluir a 4

Usos: limitado a HQ e IHQ.
VENTAJAS
Rpido

DESVENTAJAS
Gran retraccin tisular. Artefactos
Alta velocidad de penetracin que obliga a
controlar tiempos de uso
Nunca ms de 2 hrs a 4c
sobre 40 disuelve grasas y lpidos complejos

2.- CAMBIOS EN ESTADO COLOIDAL DE LAS PROTEINAS

Las protenas son molculas anfteras (que actan como base y acido dependiendo del pH),
cuyo punto isoelctrico (mxima disociacin y mnima estabilidad) es cercano a 5.8 pierden
estabilidad pues a ese pH las protenas desprenden el agua ligada (endgena) porque no
mantiene la disociacin electroesttica que fija los iones bipolares del agua a su estructura
molecular. Por este motivo las soluciones coloidales precipitan en presencia de determinados
cidos que bajan el pH hasta alcanzar el Punto Isoelctrico.
a. ACIDO ACETICO CH3-COOH
Acta rompiendo los puentes entre protenas, exponiendo los grupos hidroflicos,
atrayendo agua, siendo absorbido, produciendo expansin. Su uso se basa en la capacidad
de precipitar la cromatina.
Caractersticas transparente, con olor a vinagre. 1 al 5% en mezclas, 5-35% Kiernan
VENTAJAS
ideal para nucleoprotenas y cidos nuclicos
coagulante
descalcificador
de eleccin para cidos nucleicos y
nucleoprotenas pues los pp
precipita protenas sin sustraer agua
provoca edema
penetra rpido

DESVENTAJAS
mal fijador de membranas y citoplasma
destruye mitocondrias
no fija H de C ni lpidos
deja el tejido blando

B.- ACIDO TRICLOROACETICO

CCL3COOH

La coagulacin de las protenas es probablemente por la interaccin electroesttica de

aniones del TCA cargados + con los grupos NH3 de protenas. Adems el grupo no polar CL3C
del TCA penetra dominios hidrofbicos de la protena, esta interaccin rompe los puentes de
H de la protena alterando la normal estructura de la protena.
Caractersticas: cristales incoloros anhdrido crmico solubles en agua. 2,5 al 5%
VENTAJAS
excelente descalcificador
fija bien estructuras nerviosas
excelente fijador estructural

C.- ACIDO CROMICO

DESVENTAJAS
disuelve cidos nuclicos y nucleoprotenas
provoca demasiado edema

H2Cr04

Caractersticas: cristales de anhdrido crmico al 2% en soluciones fijadoras

VENTAJAS
buen fijador estructural
fuerte oxidante, acta como mordiente

DESVENTAJAS
: incompatible con reductores como formol y
alcoholes
baja velocidad de penetracin
da tinte verdoso a los tejidos que obliga a un
lavado intenso

3.- FORMACION DE SALES

Formacin de sales: el agente es un catin metlico (HG++, K++) susceptible de formar
protenatos o picratos con los tejidos. Tienen gran velocidad de fijacin, la formacin de la sal
es casi instantnea, la cual va impidiendo la fijacin en el centro de la muestra obstculo
mecnico/ efecto barrera-. Adems la pp va provocando un gran endurecimiento de la
muestra.

A.- CLORURO DE MERCURIO O SUBLIMADO DE MERCURIO

HgCl2
La qumica de la fijacin es pobremente entendida, aunque se supone una interaccin de los
componentes de las sales y los grupos ACIDOS como son: sulfidrilos SH, carboxilo COOH Y
hidroxilo OH y los residuos fosfricos de las nucleoprotenas.
Algunas mezclas ms acidificadas, con lo que los grupos amino tambin participan en la
reaccin
Caractersticas: polvo txico, se prepara una ss. Acuosa saturada (3-6%) la que es corrosiva.
Aditiva y coagulante.
Usos: el Hg++ forma sales con los carboxilos, hidroxilos y sulfhidrilos y residuos fosfricos de
nucleoprotenas (grupos cidos) Se usa en mezclas
VENTAJAS
excelente para morfologa
De eleccin para tejidos hematopoyticos y
renales
Excelente mordiente
En ss cida es aditivo formando enlaces
cruzados con los grupos sulfhidrilos de las
protenas y nucleoprotenas (disulfuro).
Reaccin Plasmal con los lpidos

B DICROMATO DE POTASIO

DESVENTAJAS
no es bactericida
Baja velocidad de penetracin por lo que las
muestras deben ser pequeas/ Kiernan rpido
Contrae y endurece (no + de 4 horas)
Pp color metlico pardo requiere desenkerizar
Provoca mucha eosinofilia lo que dificulta
identificar zonas de necrosis

K2Cr2O7

Fijador oxidante, se desconoce el mecanismo completo de fijacin, pero se estima que adems
de oxidar interacta con los fosfolpidos hacindolos insolubles, hecho que necesita 1 o 2 das
de fijacin, propiedad utilizada por los neurohistlogos para preservar tejido nervioso.
Caractersticas: polvo rojo amarillento de gran poder oxidante. Que interacta con las
protenas para formar cromatos- sales de cido crmicoUsos: Forma cromatos y quelatos. 1-2% acuoso en mezclas. Reacciona con grupos aminos y
carboxilos

VENTAJAS
Efecto mordiente (ox. Grupos alcohlicos de
grasas y polisacridos de aldehdos)
De eleccin para lpidos complejos (golgi,
mitocondrias y mielina)
Indispensable para demostrar la reaccin
cromafn y realizar tc. De Golgi.

DESVENTAJAS
incompatible con agentes reductores, OH y
formalina
Baja velocidad de penetracin, endurece poco
Artefactos titulares: vacuolas y retracciones
Disuelve cromatina cuando no es acidificado,
por lo tanto debe usarse en
Mezclas con acido actico o TCA.
Se debe lavar post fijacin con ss salina o
tamponada.

Reacciona tanto con carboxilos e hidroxilos rompiendo enlaces internos de protenas

aumentando el nmero de aminos, produciendo un aumento en su afinidad a eosina.
C. ACIDO PICRICO

Es un trinitrofenol, cido fuerte. El anin causa coagulacin y

forma las sales de picrato con los grupos bsicos de las protenas.
Despus de la fijacin las muestras deben ser lavadas, se
recomienda OH70, pero algunos autores no indican diferencias de
hacerlo con agua destilada. Es un cido lo suficientemente fuerte
para hidrolizar DNA y RNA. Si se dejara una muestra un tiempo
excesivo en ste fijador, la muestra se macera. Se usa en mezclas,
las ms usadas son las de Bouin`s y Gendre`s
Caractersticas: agujas cristalizadas amarillas.
Usos: forma picratos. Se uso en mezclas saturado al 2%, 0.5-5% Kiernan
VENTAJAS
efecto mordiente
Excelente estructural
ptimo contraccin de tejidos
Buena penetracin/lenta kiernan
No disuelve glucgeno ni lpidos
Leve efecto descalcificante
Estable
Coagulante, aditivo
Efecto mordiente

DESVENTAJAS
explosivo
Endurece y pp si se excede los tiempos de
fijacin
Endurece y hace quebradizos los tejidos
Requiere lavar post fijacin OH 70%/ agua
Incompatible con celoidina
Disminuye volumen

D. ACETATO DE URANILO

(CH3-COO)2UO2+H2O

Caractersticas: cristales amarillos muy solubles en agua y que se descomponen a la luz

Usos: se utiliza en la tincin para microscopa electrnica

4.- RETICULARIZACION DE LAS PROTEINAS

La denaturacin de las protenas no es por precipitacin, si no que por ruptura masiva de los
puentes de hidrgeno que determinan la estructura helicoidal de la molcula de protena,
formando una malla reticular polipeptdica por asociacin qumica entre los grupos activos
desenmascarados por el lquido fijador. Los grupos qumicos con caractersticas de generar enlaces
entrecruzantes son los aldehdos, los que reaccionan sobre residuos bsicos de los aminocidos y
cambian ligeramente el punto isoelctrico de las protenas. El formaldehido, hidrato de cloral,
glioxal, acrolena y el glutaraldehdo son los principales representantes de este grupo.
FORMALDEHIDO
Es un gas soluble en medio acuoso, sus molculas pequeas (HCHO, de los cuales el CHO-es el
grupo aldehdo) se disuelven rpidamente en agua, con el que se combinan qumicamente para
formar hidrato de metileno, HO-CH 2-OH. El lquido conocido como formalina contiene 37-40%
de formaldehido y 60-63% de agua (en peso), la mayor parte del formaldehido existe como
polmeros (n = 2 a 8 ). Mayores polmeros (N hasta 100), son insolubles, se venden como un
polvo blanco paraformaldehdo, tambin corresponde al precipitado blanco slido en fondo de
botellas antiguas.
El formaldehdo preserva estructuras asociadas a grupos amino primarias (principalmente
aminocido bsico lisina), reacciona muy poco frente a lpidos y por tanto membranas. Si se lava
abundantemente antes de 24 horas de la muestra sumergida en le fijador, la fijacin puede ser
reversible. La solucin comercial contiene impurezas: metanol y cido frmico. Para obtener una
solucin libre de impurezas se obtiene a partir del paraformaldehdo OH (CH2O)NH donde N va de
6 a 100, el paraformaldehdo va liberando monmeros de formaldehido al disolver lentamente en
soluciones tamponadas y a alta temperatura. La concentracin de uso es al 4%, debe prepararse a
pH y osmoralidad controlados.
El formaldehido debe almacenarse a temperatura ambiente, se debe almacenar hermticamente
sellado, ya que la exposicin al aire favorece la oxidacin de formaldehido en cido frmico.
Para ser til como fijador, una solucin debe contener formaldehido monomrico (llamados
hidrato de metileno o metilenglicol) como su principal soluto. La dilucin con agua se rompe los
polmeros pequeos en formalina. Este proceso demora un par de das si se utiliza agua pura,
pero es casi instantneo cuando la formalina se diluye con una solucin tampn a pH fisiolgico.
La hidrlisis de los polmeros es catalizada por los iones de hidrxido presentes en la solucin
ligeramente alcalina.

Al hacer soluble el gas, se forma rpidamente METELINGLICOL y polmeros, hasta alcanzar el

equilibrio entre metilenglicol/polmero antes que con formalina, la que alcanza apenas un 0,1% de
concentracin. Por lo tanto lo primero en penetrar la muestra en metilenglicol (que NO fija),
cuando penetra formaldehido fija las estructuras, disminuye la concentracin del formaldehido, y
se desplaza el equilibrio desde metilenglicol a formaldehido.
H2C=O +H20 OHCH2OH
El formaldehdo reacciona con diversas regiones de las protenas, para formar enlaces
hemiacetales y otros. Por ejemplo, con las aminas primarias, aminocidos N terminales y cadenas
laterales de lisina, con los grupos guanidilo de las cadenas laterales de arginina, grupos sulfhidrilos
de cistena y grupos hidroxilo alifticos de serina y treonina. La unin de la formalina a todos estos
grupos, inhibe la actividad de muchas enzimas, previniendo la autolisis, pero no estabilizando
estructuralmente el tejido, que es otra de las funciones de la fijacin. De hecho, los grupos
hidroximetileno (-CH2OH) que se forma cuando se fija brevemente se pueden eliminar si la
muestra se lava durante varias horas en agua o alcohol (hecho que puede ocurrir durante el histo
procesamiento de la muestra) ; sin embargo, cuando estos mismos grupos hidroximetileno estn
unidos a protenas son capaces de participar en una segunda reaccin con los grupos funcionales
de las mismas protenas o de protenas vecinas formando puentes metilnicos estables. De esta
manera distintas protenas pueden entrecruzarse mediante puentes metilnicos qumicamente
estables. La formacin de estos puentes es la reaccin ms relevante en el proceso de fijacin con
aldehdos. El grupo aldehdo se puede combinar con el nitrgeno y algunos otros tomos de las
protenas, o con dos tomos de este tipo, si estn muy cerca entre s, formando una croos-linkCH2-llamado un puente metileno o enlace de entrecruzamiento. Los estudios de la qumica
indican que el tipo ms frecuente de reticulacin formado por formaldehido en la fibra de
colgeno es entre el tomo de nitrgeno al final de la cadena lateral de lisina y del tomo de
nitrgeno de un enlace peptdico, y el nmero de tales enlaces cruzados aumenta con el tiempo.
La accin fijadora de formaldehido probablemente se deba enteramente a sus reacciones con las
protenas. La penetracin del formaldehido a los tejidos es rpida, pero el efecto sobre la protena
con formacin de puentes de metileno procede mucho ms lentamente. Sustancias tales como
carbohidratos, lpidos y cidos nuclicos se encuentran atrapados en una matriz de molculas de
protenas insolubles y reticulado, pero no estn qumicamente modificadas por el formaldehido, a
menos que la fijacin se prolonga durante varias semanas.

(figura 2 ) (A) La adicin de una molcula Formaldehido a una protena. (B) La reaccin de
formaldehido enlazado con otra molcula de protena para formar un enlace cruzado de
metileno. (C) El detalle de la estructura del croos -linking de una cadena lateral de lisina a
un tomo de nitrgeno pptido

Caractersticas: es un gas, incoloro de un olor penetrante, en solucin alcanza una

concentracin mxima de 40% estabilizado con metanol
Usos: se usa en solucin al 4%. Txico. Irritante
VENTAJAS
barato, de eleccin para trabajos de rutina
buen fijador nico
Fcil de preparar
Buen desinfectante
No endurece en exceso
escasa retraccin tisular
Penetracin intermedia (1 mm/hr) pero fija lento
Se puede acelerar la fijacin o retrasarla con
temperatura
Aditivo no coagulante
Preserva lpidos pero no los insolubiliza
Compatible con la mayora de las tinciones

DESVENTAJAS
vapores de carcter irritante
por accin de luz y oxgeno se transforma en
cido frmico (frascos ambar, usar ss neutra)
Fija lento
Debido a su incorporacin progresiva el tejido en
forma de puentes metlicos, el formaldehdo se
consume durante el proceso de fijacin, por lo
que debe estar siempre en exceso.
Peso y volumen del tejido se aumentan (180mOs)
Soluciones cida produce pigmento formolado

Algunas consideraciones prcticas:

Antes de utilizar una botella la solucin de formaldehido al 37% debe ser transparente, incolora y
no tener ningn precipitado, debe haber sido almacenada en la sala temperatura en una botella
hermticamente cerrada, que no ha sido expuesto a la luz solar.
No recomendamos el uso de una botella de valores que es mayor de 1 ao, importante verificar
fecha de caducidad.
Botellas de 37% de formaldehido que ya estn abiertos no debe utilizarse ms all de los seis
meses. En consecuencia, se recomienda comprar formaldehido con mayor frecuencia y en
presentaciones pequeas.
GLUTARALDEHDO

Usos: para M. Electrnica. El preparado comercial consiste en una solucin acuosa de monmeros
y oligmeros de glutaraldehdo, aunque solo el monmero es activo como fijador, es por este
motivo que es importante prepararlo antes de ser usado, adems de cuidar el pH de la solucin y
temperaturas cercanas a los 4; la pureza de la muestra puede demostrarse por
espectofotometra, pues el pick mximo de absorcin del monmero es de 280 nm mientras que
de el oligmero es de 235 nm. El glutaraldehdo tiene molculas bastante pequeas, cada una con
dos grupos aldehdo, separados por una cadena flexible de 3 puentes de metileno. Es de HCO-

(CH2) 3-CHO. El potencial para la reticulacin es, obviamente, mucho mayor que con
formaldehido debido a que puede producirse a travs de ambos el-CHO grupos y sobre distancias
variables. En soluciones acuosas, el glutaraldehdo est presente en gran parte como polmeros
de tamao variable. Hay un grupo aldehdo libre que sobresale del lado de cada unidad de la
molcula de polmero (fig. 3), as como una en cada extremo. Todos estos grupos-CHO se
combinar con los nitrgenos de protenas con las que entran en contacto, por lo que existe un
enorme potencial para la reticulacin, y eso es precisamente lo que ocurre (Fig. 4).

fig 3

Aspectos prcticos de la fijacin con glutaraldehdo

Varios puntos importantes que deben tenerse en cuenta cuando se utiliza como fijador de
glutaraldehdo para microscopa ptica o electrnica.
1. Si es para ser cualquier uso como un fijador, especialmente para la microscopa
electrnica, la solucin de glutaraldehdo debe contener el monmero y polmeros
(oligmeros) con molculas pequeas como para penetrar en el tejido con bastante
rapidez. Esto significa que se debe comprar un "grado EM" glutaraldehdo (25% o 50% de
solucin), no ms barato "tcnico" de grado.
2. La reaccin qumica de glutaraldehdo con la protena es rpido (minutos a horas),
pero las molculas ms grandes, especialmente los oligmeros, penetrar en el tejido
lentamente.
3 . La reticulacin generada por el glutaraldehido impide la penetracin de las molculas
de parafina bastante grandes.
4. Inmunohistoqumica, para la correcta identificacin de los antgenos se requiere
tantas aminocidos con cadenas laterales intactas como sea posible, lo que se ve
seriamente afectada por la fijacin glutaraldehdo. El entrecruzamiento generado
tambin se traduce en la prdida o reduccin grave de la mayora de las actividades
enzimticas histolgicamente demostrables, aunque algunos se conservan despus de la
fijacin breve

fig 4

Reaccin
de
poli
(glutaraldehdo)
con
grupos amino de las
protenas.

VENTAJAS
penetra lento
fijacin irreversible
requiere de muestras delgadas
Mantiene ultraestructura mejor que
cualquier otro aldehdo

DESVENTAJAS
sobre endurece
Requiere un buffer de soporte
Debe ser preparado antes de usarlo,
soluciones frescas.

GLIOXAL
Es uno fijador nuevo en el mercado, se vende y promociona como un fijador con las caractersticas
de la formalina pero sin ser txico.
El Glioxal es un oxalaldehdo, que en solucin se encuentra como hidrato de glioxal, necesita de
un pH 4.0. En teora fija de manera similar a la formalina pero de una manera ms rpida,
muestras pequeas requieren de 1 hora y grandes de 9 horas. Es un di aldehdo que actan sobre
las protenas, asegurando su mxima preservacin qumica y espacial. Sus potenciales de
oxidacin estn prximos al formol. Es un compuesto miscible en agua y el poder de penetracin
es mayor, a pesar que los pesos moleculares de estos son mayores que el correspondiente al
formol. Generalmente, se preparan en soluciones diluidas a pH fisiolgicos. Fija correctamente
protenas y estructuras celulares y de matriz asociadas a ellas, tales como ADN y membranas. El
glioxal al 5% en buffer de fosfatos a pH 7,4 tiene aplicacin reciente en microtcnica de rutina.

fig 5

TETROXIDO DE OSMIO

Fijador oxidante, se desconoce con certeza su mecanismo de fijacin, pero se sabe que genera
cierto grado de entrecruzamiento entre las protenas, esto se ve por el rpido nivel de
viscosidad de la solucin de protenas que toman contacto con el tetrxido de osmio. El osmio
presenta un alta avidez por los lpidos por lo que adems de fijarlos los contrasta, siendo esto
especialmente til en microscopa electrnica
Caractersticas: cristales amarillentos solubles en agua, muy voltiles y txicos. Se vende en
ampollas de vidrio selladas.
Usos: 1% en tampn fosfato

VENTAJAS
acta por reticularizacin fijando protenas y
grasas
Es el mejor fijador estructural, se usa en M
Electrnica, como segundo fijador y contraste.

DESVENTAJAS
caro y se descompone en presencia de la luz
es algo insoluble
muy txico, debe ser siempre manipulado bajo
campana
penetracin lenta
incompatible con fijadores reductores
(formaldehido ppalmente) y con la coloracin
de PAS.
Al fijar por reticularizacin inactiva casi por
completo las enzimas y altera notablemente la
composicin antignica tisular.

Fuera de las cuatro categoras descritas, en el ao 1997 se patenta el Espaa un fijador

denominado comercialmente COMPLUCAD, al ser este una marca registrada no se dan a
conocer todos sus componentes, sin embargo se sabe que contiene una solucin de
alcoholes y perxidos, se comercializa como libre de formaldehido y por tanto de todos
los riesgos txicos asociados. Inicialmente se promociona con un fijador para
conservacin de cadveres y piezas anatmicas, pero en la actualidad se utilizara en
fijacin de muestras para estudios histolgicos.
Factores que intervienen en la fijacin.
La fijacin es un proceso complejo en el que intervienen toda una serie de factores tanto
propiedades y caractersticas del fijador, como la muestra y factores externos.
1. pH: generalmente suele ajustarse el pH a uno cercano al fisiolgico ( entre 6 y 8),
utilizando para ello tampones o buffers. Fuera del rango fisiolgico se pueden
producir artefactos especialmente visibles a nivel ultraestructural.
2. Osmolaridad: movimiento de agua a travs de una membrana semi permeable, las
soluciones tienden a igualar las presiones. Hay que evitar problemas de retraccin
( si el fijador es hipertnico) o de turgencia ( si es hipotnico). Los fijadores
isotnicos tienden a hinchar levemente la muestra. Isotnico en mamferos es de
300-340 mOsm.
3. Temperatura: si bien no es crtica, elevar la temperatura del fijador reduce de 1220 horas a 1-2 horas de fijacin (40c aprox). Para microscopa ptica debe ser
realizada la fijacin a 4c evitando la difusin por arrastre de los componentes
celulares.
4. Concentracin del fijador:

5. velocidad de penetracin: rapidez con la que un fijador difunde hacia el interior del
tejido, por lo tanto, el tamao de la muestra se relaciona directamente a la
velocidad de penetracin del fijador. A fin de conocer el poder de penetracin de
los agentes fijadores, se ha establecido un valor K, que se define como el
coeficiente de difusin del fijador en el tejido, d es la distancia penetrada ( en
mm)y t es el tiempo (en horas), resulta que:

2
t= d
K
Esta ecuacin nos permite determinar el tiempo de fijacin (tener presente que no
es sinnimo penetracin del agente fijador con fijacin de la muestra)
Se estima que la formalina penetra los tejidos a 0,9 mm/hora y 0,3mm/hora cido
pcrico y sublimados. La mayor velocidad la tienen los alcoholes y acetona.
FIJADOR
FORMALDEHIDO
GLIOXAL
ACIDO PRCRICO
ACIDO ACETICO
GLUTARALDEHIDO
ETANOL
METANOL

K
3.6
3.3
0.8
2.75
3.4
1.3
1.45

6. velocidad de fijacin: en el caso de la formalina la fijacin es posterior a la

penetracin, tarda en estabilizar y precipitar los componentes qumicos de los
tejidos. En el caso de los fijadores que forman sales, estos van generando una
barrera mecnica, demorando aun ms la fijacin.

7. grosor y densidad de la muestra: al aumentar la densidad de la muestra sta opone

resistencia al ingreso del fijador; por este motivo es que las muestras deben
ajustarse a los requerimientos de tamao y grosor adecuados.
8. volumen de fijador: debe ser 10 a 30 veces mayor que el volumen de la muestra.

Bibliografa:

Tcnicas en histologa y biologa celular Luis Montuenga Badia

Manual de Laboratorio Clnico Diagnstico Raimundo Garca del Moral 2000

Histological and Histochemical Methods Theory and Practice Kiernan 4 edicin

Histotechnology A Self- Instructional Text Carson 3 edicin