formaldehido se diluye, generando una oxidación de la
formalina, la cual es una reacción llamada REACCIÓN DE
Detección de todos los procesos autolíticos, es fundamental
para nuestro trabajo, ya que sin ella todos los componentes
del tejido se degradarían.
Su objetivo principal es mantener las características
morfológicas claras para su estudio posterior, mantener las
características del tejido y de la célula lo mas parecido a su
estado original.
Es fundamental poner el tejido en fijador tan pronto como se
corte el suministro sanguíneo.
Objetivos:
- Preservar la morfología
- Preparar el tejido para los pasos posteriores
- Conservar inmunoreactividad de antígenos
- Conservar la ubicación de las macromoléculas
Consideraciones generales:
- Volumen: debe ser 20 veces el volumen de la muestra
- Renovación del fijador
- Contacto del tejido con el fijador
- Tiempo
- Tejidos especiales
La fijación puede ser por inmersión o perfusión, es decir,
sumergir el tejido en el líquido o solución fijadora o pasar a
través de vasos, bronquios el fijador con una jeringa.
En caso de que el espécimen no quede bien fijado, se terminar
de fijar en los alcoholes.
Se espera que la solución fijadora sea ligeramente hipotónica,
para que le entre agua a la célula y de esta forma se dilate
un poco.
El fijador ayuda a cambiar el contenido soluble de la célula,
volviendo a las sustancias insolubles para que estas sustancias
no se pierdan durante el procesamiento posterior del tejido.
[Inactiva las enzimas al estabilizar las proteínas]. Esta fijación
puede ser mediante procesos químicos [soluciones fijadoras] o
métodos físicos [calor o desecación], ósea un proceso de
desnaturalización. La función de la desnaturalización es hacer
que las proteínas se desplieguen y los enlaces internos se
rompan.
La formalina es un gas disuelto en agua, esta agua es la que
permite penetrar los tejidos, para que esto suceda el
CANIZZARO, la cual forma un metanol y un ácido fórmico.
En estado monomerico la formalina se denomina
metilenglicol. Este metilenglicol se une a grupos radicales que
poseen Hidrógenos reactivos, generando grupos hidroximetil,
los cuales reaccionan con otros hidrógenos reactivos
formando puentes de metileno/puentes
entrecruzados/crosslinking, los cuales ayudan a que la
formalina fije el tejido. Estos grupos hidroximetil pueden ser
removidos con lavados en agua, pero ojo que ya cuando se
forman los puentes de metileno entre los distintos radicales
de proteínas son súper estables e irreversibles.
Punto critico:
Algunas proteínas sin enmascaradas por los grupos aminos
de los puentes de metileno
- Metilenglicol se oxida para liberar una molécula de
H2O, la cual en el tejido ayuda a formar
crosslinking/puentes de metileno, los cuales ayudan
al proceso de fijación. Paraformaldehido puede
enmascarar las proteínas no permitiendo estudios
enzimatico.
- Metilnglicol, tiende a polimerizarse formando
paraformaldehido, la cual ayuda a relentizar el
proceso de fijación
Al 10% el formaldehido se encuentra en estado monomérico
(metilenglicol), el metilenglicol se une a los grupos radicales
que posean un H reactivo, de esta reacción se genera un
hidroximetil, estos reaccionan con otros H reactivos formando
el puente de metileno, por lo tanto el metilenglicol es quien le
entrega al formaldehido la capacidad de ser un fijador
La fijación puede ser química o física
Fijación física:
- Calor: Ayuda a estabilizar y desnaturalizar las
proteínas. El tejido es sometido a altas t°, dando como
resultado la coagulación de proteínas y fusión de
lípidos. Se usa un microondas, ojalar no usar este
equipo a más de 68°C, porque pueden provocar
picnosis en los núcleos o lisis de eritrocitos.
- Frio: ojala que la congelación sea instantáneo para
minimizar la formación de cristales de hielo y no
producir ruptura en el tejido, para ello se opta por
una congelación rápida o por uso de un crioprotector
o Congelación rápida: puede ser usando
isopentano a -170°C, nitrógeno líquido,
dióxido de carbono solido o helio líquido a -
268°C
o Agentes crioprotectores: dimetilsulfoxido,
propilenglicol o sucrosa
Hay 4 tipo de fijadores químicos:
- Aldehídos
- Alcoholes
 - Ácidos Ejemplo: alcohol, acetona, se utiliza para histoquímica
- Sales enzimática (mantiene los grupos reactivos de las enzimas) o
Se clasifican en: citología
- Aditivos: La denaturacion de una proteína cambia la reactividad de los
- Coagulantes grupos funcionales haciendo inaccesibles parte de la
Aditivos: el agente químico interactúa con las proteínas moléculas a los reactivos, alterando la velocidad a que tales
quedando unido a esta, causando su desnaturalización o reactivos se difundan en la proteína, aproximando grupos
insolubilización. previamente separados en la molécula proteica con lo que se
No aditivo: el agente químico interactúa solo con las moléculas producen nuevas reacciones estereoquímicas.
de agua de las proteínas, causando su denaturacion e Permite la conservación del glicógeno.
insolubilización. Los alcoholes son malos mordientes, por lo que la tinción no
Coagulantes: preservan escasamente organelos, conservan es óptima.
bien la matriz de soporta y endurecen excesivamente los Los alcoholes aceleran la fijación, pero compiten por el agua
tejidos. de las proteínas, las deshidratan, por lo tanto, las desnaturaliza.
No coagulantes: actúan entrecruzando estructuralmente Los alcoholes son buenos fijadores en citología.
macromoléculas del tejido, preservando organelos
citoplasmáticos, forman un estado de “gel insoluble” con las
proteínas y causan un endurecimiento leve a los tejidos Bajan el punto isoeléctrico de las proteínas, generando la
La clasificación es solo para fijadores solos, no aplica a las desestabilización de las proteínas, al desprenderse del agua
mezclas fijadoras como zenker. endógena.
Se caracterizan por su velocidad de fijación y su poder
Tipo de fijador aditivo coagulante descalcificador
Aldehídos aditivo No coagulante El ácido pícrico, actúa como sal, es un coagulante aditivo, se
Alcoholes No aditivo Coagulante une al grupo amino y forma un picrato, lo que le da una carga
Sales Aditivo Coagulante altamente positiva.
Este acido actúa como fijador, descalcificador y colorante, ya
que deja los tejidos de un color amarillo
Los ácidos, son los peores fijadores, ya que daña el tejido

Consisten en cationes metálicos susceptibles de formar

proteinatos metálicos junto con los aniones de las proteínas.
Se caracterizan por poseer una gran velocidad de
penetración y fijación, dejando libre los grupos aminos
permitiendo la posterior tinción, sin embargo, generan
precipitación metálica, lo que provoca endurecimiento del
tejido, además el mercurio es altamente toxico.

En la práctica utilizamos la formalina, ya que esta

Son agentes que eliminan el agua libre de los tejidos y
precipitan y coagulan las proteínas, desnaturalizan las
proteínas al romper los enlaces hidrofóbicos responsables de
mantener la estructura terciaria de las proteínas
Son sustancias alcohólicas que actúan atrayendo el agua.
Generan la precipitación de las proteínas, disminuyendo su
solubilidad, provocan alteraciones importantes en la
organización y estructura celular, producto de la
desestabilización de la estructura terciara de las proteínas.
estandarizada.
La formalina trabaja mediante los puentes de metileno.
Existen 4 fijadores aldehídos
El glutaraldehído es un dialdehído, es decir tiene: de reactividad
química a diferencia del formaldehído que tiene sólo 1, permite
que la fijación sea corte en el tiempo, se utiliza
preferentemente en microscopia electrónica
El paraformaldehído es la polimerización del formaldehído,
juntan 4 moléculas de formaldehído se forman para
paraformaldehído, es una fijación de tipo gaseosa, se utiliza
para fijar estructuras complejas, en trabajos de investigación,
es el único fijador que puede fijar sin realizar modificaciones in
situ, no genera la pérdida de ningún elemento soluble, ya que
no se utiliza ningún solvente en su preparación, puesto que se - Tamaño de la muestra: cortar los tejidos para que el
está utilizando un gas, impidiendo que exista solubilidad de los fijador pueda penetrar
componentes del tejido a estudiar. - Elección del fijador: según el tipo de tejido y
El glyoxal, también es un dialdehído, fija muy rápido y también procedimientos que se realicen a posterior
penetra rápido, ya que está disuelto en agua y se evita la - pH y osmolaridad: debe ser lo mas parecido al medio
paradoja del formaldehído en que se encuentra la célula, lo mas similar a su
Formaldehido o formalina penetra rápido, pero fija lento, va medio natural
disuelta en agua por lo que llega a todos los sitios del tejido
muy rápido, pero para ir fijando lo hace lento, ya que debe
formar los puentes de metileno entre cada - Fijación deficiente
proteína/aminoácido - Exceso de fijación
- Enmascaramiento antígeno
- Difusión de moléculas
Las mezclas fijadoras tienen por objetivo potenciar las - Endurecimiento
características de los distintos fijadores para poder usarlo en - Retracción
algún estudio especial. Permiten una mejor fijación - Hinchazón del tejido
Ejemplos: - Bloque de estructuras tisulares
- BOUIN: acido pícrico+acito acetico+formalina 37% - Fijación incompleta o parcial
- Carnoy: etanol+cloroformo+acido acetico
- Methacarn: acido acetico+metanol+clorofomo
El alfac es una mezcla de fijadores que contiene formol,
alcohol y ácido acético. El ácido acético es para preservar los
ácidos nucleicos, el alcohol fija más rápido, atraviesa el tejido
altiro, y la formalina al ser lenta se demora más, pero
establece las uniones químicas que sean posibles

La fijación se utiliza en:

- Biopsia diferida
- Inmunohistoquímica
- Inmunofluorescencia
- Cualquier estudio que requiera preservar la
morfología y detallo celular
-

Tissue safe: no es una fijación como tal, detiene el proceso

autolítico y lo deja como si estuviera fresco hasta 72 horas.
Detiene el proceso y es como si lo conservara en fresco.
Retrasa los efectos de la autolisis
Es un sistema de vacío de muestras histológicas, estas se
refrigeran a 4°C.
Con esta maquina se evita el uso de la formalina, las muestras
se mantiene frescas, se conservan los colores originales de la
muestra, se ralentiza el proceso autolítico, se evitan derrames,
se logran optimizar los proceso de fijación

- Tiempo de fijación adecuado

- Volumen del fijador
- Que la muestra este totalmente sumergida y todos
sus lados estén en contacto con el fijador
- Recambio del fijador

Descalcificación es la completa eliminación de las sales de
calcio presentes en los tejidos después de haber realizado la
fijación.
Se realiza de forma sistemática sobre tejidos mineralizados
como dientes y huesos, como también de forma esporádica
sobre material anatomopatologicos con calcificaciones que
dificulten o impidan el corte y/o observación microscopia de
las lesiones
Para descalcificar se debe tener los tejidos bien fijados, ya que
el descalcificador es acido, por lo que va a actuar como fijador,
bajando el punto isoeléctrico de las proteínas, primero actúa
fijando y luego descalcifica.
- Concentración, se utilizan generalmente al 10%, son
concentraciones no muy altas que solubilizan los
ácidos, cualquier concentración nos serviría como
descalcificador, pero las concentraciones están
definidas para proteger las partes blandas
- Temperatura; puede acelerar el proceso
- Agitación: muestra más se agite la muestra es más
rápido, acelera el proceso
- Acceso del fluido, debe mejorar la difusión y
penetración de la solución, la ionización y remoción
del calcio.
- Suspensión: la muestra debe estar suspendida para
que no entre en contacto con el calcio
- Tipo de hueso: un hueso compacto toma mas tiempo
que uno esponjoso y este mas tiempo que la medula.
Compacto>esponjoso>medula ósea.
Hay 2 tipos de descalcificadores:
- Ácidos: pueden ser fuertes o débiles
- Agentes quelantes
Los ácidos fuertes se utilizan generalmente para el hueso
compacto, mientras que los débiles se utilizan para hueso
esponjoso.
Los agentes quelantes, como el EDTA se utiliza para medula
ósea, ya que no la daña.
Si no se cuenta con alguno de estos según el tipo de hueso, se
puede utilizar cualquier agente descalcificador, solo hay que
regular el tiempo.
Los fuertes entre los más comunes son el HCL o en HNO3 en
concentraciones entre 10 a 14%. Son rápidos en su acción, en
tiempo excesivo causa la perdida de tinción nuclear y se
masera el tejido.
son rápidos, actúan solubilizando los cristales de calcio, se usan
en diagnósticos rápidos, de menos de 24 hrs en tejido óseo
compacto o muy mineralizado.
La solución puede saturarse con iones de calcio, por lo que
ésta debe ser cambiada con frecuencia. El tejido debe fijarse
completamente antes de su descalcificación. Ejemplos: Ác.
Clorhidrico, Ác. Nitrico, Ác. Sulforico.
Los ácidos débiles, como el ácido fórmico, es más lento, pero
es mucho más suave en su acción en los tejidos, preserva
mejor la tinción nuclear.
Los ácidos débiles son lentos, son descalcificadores primarios,
ayudan a evitar los efectos nocivos de los ácidos, forman
buffers. Se usan de preferencia n trozos de huesos pequeños
o hueso esponjoso, medula ósea, estos ácidos ayudan a
preservar mejor la tinción nuclear. Ejemplos: ac. Fórmico, ac.
Acético, ac. Citrico.
El tejido calcificado es sumergido en una solución
descalcificadora, con el fin de remover los iones de calcio
hacia el líquido de la solución descalcificadora, esto provoca
una reacción química en el líquido descalcificador, dejando su
solución tamponada, con esto el descalcificador pierde su
capacidad de retirar calcio del tejido, este proceso es para
asegurar que la muestra esté lo suficientemente blanda para
facilitar el corte con un micrótomo sin interferir con el proceso
de tinción posterior.
Los agentes ácidos actúan alterando el equilibrio iónico de la
hidroxiapatita, debido al exceso de H+, realizando una
extracción continua de iones calcio, fosfato e hidroxilos, de
manera que la hidroxiapatita experimenta disolución.
El agente quelante es un componente orgánico capaz de
unirse a los iones de calcio formando nuevos compuestos
denominados quelatos, estos son muy estables y no se
descomponen fácilmente., por lo que no liberan el ion al que
se unieron.
Los agentes quelantes son lentos, son componentes orgánicos
que pueden unirse a iones metálicos formando un quelato.
EDTA forma sales con el sodio y metales alcalinos para formar
quelatos estables y solubles, cuando el tejido es sumergido en
EDTA los iones de calcio libre son eliminados por quelación. Al
ser un agente quelante es capaz de secuestrar o quelar
metales.
Se une el calcio ionizado en el exterior del cristal de apatita y
a medida que esta capa se agota mas iones de calcio se
reforman desde el interior, por lo tanto, el cristal se vuelve
paulatinamente más pequeño durante el proceso de
descalcificación. Este es un proceso lento que no daña los
tejidos ni su tintibilidad. Las enzimas requieren condiciones de
pH especificas para mantener la actividad, y las soluciones
EDTA se pueden ajustar a un pH específico para su tinción.
La solución de EDTA inactiva la fosfatasa alcalina, que es
enzima hidrolasa responsable de eliminar los grupos fosfatos
de varios tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y
otros compuestos fosforilados, pero esta actividad se puede
restaurar mediante la adición de cloruro de magnesio, a pH 7 El Surgipath es un descalcificador comercial, este utiliza
es más rápido usarlo a pH 10, pero el tejido puede dañarse al formalina, por lo que fija y descalcifica a la vez.
alcalinizar el pH. Milestone KOS es un microondas que ayuda en el
procesamiento rápido de tejidos, en la descalcificación y
procesamiento de medula ósea, entre otros ejemplos:
Algunas veces el hueso al ser tan grande viene en fresco y - Descalcificación rápida: mediante agitación,
rodeado por piel y musculo, lo primero que se realiza es la manteniendo continuamente la superficie del hueso
macroscopia, seguido de la fijación. en contacto con el descalcificador “fresco”
El corte no se realiza inmediatamente, puesto que se pierde - Endurecimiento del tejido: endurece de forma rápida
mucho material, así que se deja fijando por 24 horas, y luego y eficaz en la solución fisiológica para un proceso de
se procede a cortarlo, para que el fijador penetre mejor. desbroce oportuno
Una vez que esta 100% fijado, se pone a descalcificar, eligiendo - Fijación: optimiza los tiempos de fijación. El equipo
el agente descalcificador según el tiempo de hueso, de no posee protocolos de tiempo y temperatura
tenerlo solo se controla el tiempo, para no dañar el tejido. específicos que ayudan a estandarizar el
Se debe ir renovando el descalcificador a medida que se valla procedimiento
saturando.
Una vez que el hueso o tejido este descalcificado se lava en
agua antes de ponerlo en el procesador de tejido.
También se realiza un mapeo del hueso
En caso de encontrarnos con un trozo del tejido calcificado a
la hora de cortar, se puede poner el bloque sobre acido de
manera de descalcificar la superficie.
Fijación de tejido óseo: las muestras deben ser fijadas antes de
ser descalcificadas y procesadas, mediante el uso de
formalina tamponada al 10%. No se utilizan fijadores en base a
alcohol para la descalcificación, ya que deshidratan la
muestra a la vez que la fijan, provocando endurecimiento de
la muestra y retracción de los tejidos, también carecen de
efecto mordiente.
Recomendaciones: probar soluciones en punto final, cambiar
diariamente el agente utilizado, aumento de la temperatura
acelera el proceso, temperaturas bajas provocan reacciones
más lentas, la óptima es de 18-25°C.
Procedimiento en descalcificación de medula ósea: acido
nítrico al 5% y el método de fijación de BOUIN el cual fija y
descalcifica tejidos como la medula ósea la cual como
protocolo se deja en Bouin aproximadamente 4 horas, luego
lo ponemos en acido nítrico al 5% hasta el otro día, para luego
lavarlo en agua y pasar a alcohol de 70% en el inicio del
procesamiento de tejidos.

para saber si el tejido esta totalmente descalcificado se

pueden realizar distintas tipos de prueba, se puede realizar
una radiografía o una prueba mecánica, en donde se
determina la dureza de hueso, esto se puede hacer con una
aguja, bisturí y usando nuestro dedos.
También se puede utilizar oxalato de calcio, esta se agrega a
la muestra, si se pone opaca quiere decir que la
descalcificación está incompleta, pero si es trasparente la
muestra está totalmente descalcificada.

Consta de 3 etapas:
- Deshidratación
- Aclaramiento
- Impregnación
La idea del procesamiento de tejidos es que el tejido adquiera
una consistencia uniforme, que quede lo más homogéneo
posible.
Este puede ser manual o automático.
Utilizamos el tipo carrusel, consta de 12 frascos, los últimos 3
están conectados a la corriente, ya que ellos contienen el
medio de inclusión
La deshidratación es para remover el agua de los tejidos, debe
ser gradual o realizada lentamente para no generar una
distorsión celular.
El agente deshidratante puede ser cualquier alcohol, pero este
no debe alterar ninguna estructura y no puede ocasionar
retracción del tejido
El alcohol modifica el índice de refracción de las proteínas.
La deshidratación debe ser completa, de no ser así se genera
un bloque húmedo.
Factores a considerar:
- Que sea gradual
- Volumen y renovación
- Tiempo
- Empleo de agentes accesorio
Los baños múltiples implican:
- Menor permanencia en cada baño
- Menor índice de saturación de alcohol con agua
- Mejor control sobre el grado de deshidratación de la
muestra
- Menor riesgo de alteración de la célula por cambios
bruscos en la fuerza de extracción del agua.
La exposición prolongada al agente deshidratante endurece
los tejidos.
Las muestras no pueden pasar mas de 3 horas en alcohol de
100%
Se utiliza xilol, este líquido físicamente aclara la muestra, se ve
traslucida, el xilol restablece el índice de refracción de las
proteínas
Los agentes aclarantes sirven para retirar el alcohol de la
etapa previa y facilitar la infiltración en parafina, debe facilitar
la llegada a la parafina y que esta entre sin ningún problema.
También se conocen como agentes intermediarios entre la
deshidratación y la impregnación, por lo que debe ser
miscibles en ambos reactivos (alcohol y parafina).
El agente aclarante debe:
- Penetrar rápido
- Sacar al deshidratante
- Fácil de remover para la parafina fundida
- Que produzca mínimos daños a los tejidos
- Poco inflamable, poco toxico y de bajo costo
Las muestras no pueden pasar más de 3 horas en xilol.
Tanto el alcohol como el xilol disuelven lípidos, por lo tanto,
estos no se pueden ver
Consiste en rellenar las cavidades que ya están deshidratadas,
es decir, llenar con parafina o alguno otro medio todas las
cavidades del tejido.
Estos medio deben ser líquidos al momento de la
impregnación.
Hay medios hidrofílicos e hidrofóbicos.
Los hidrofílicos tienen afinidad por el agua, por lo que el
proceso es mucho más corto.
Los hidrofóbicos no son inmiscibles en agua, por lo que
requieren de deshidratación y aclaramiento.
La consistencia del tejido no puede ser mayor a la del medio
de inclusión, la consistencia de ambos debe ser lo mas similar
posible, de manera de crear un bloque homogéneo.
Se programa según el tiempo y el tipo de muestras que serán
procesadas.
Hay que recordar que la deshidratación debe ser gradual.
Mínimo 2 frascos de alcohol de 100% y de xilol, y no sobrepasar
las 3 horas en ambos.
Los últimos 3 frascos son de parafina.
Dependiendo del tiempo del proceso, si este sobrepasa las 24
horas, como en un fin de semana largo, el primer frasco
comienza con formalina.
Tejidos frágiles como cerebro, pulmón, embrionario, comienza
con alcohol de mas baja gradualidad (30%), para no dañar el
tejido.
Lo ideal es comenzar a asignar el tiempo por los alcoholes y
el xilol.
Rutina
Fijar el tejido en formalina tamponada por 4 horas mínimo,
luego deshidratar desde el alcohol de 70%, la deshidratación
no debe superar las 3 horas por cada alcohol y dejar mas
frascos de 100%, xilol y parafina.
Ejemplo: alcohol 70% - alcohol 95% - alcohol 100% - alcohol 100%
- alcohol 100%- xilol – xilol – xilol – parafina – parafina –
parafina, el fin es usar el mismo reactivo 3 veces para que el
ultimo frasco este menos saturado.
Tejido adiposo
Unos de formalina tamponada mínimo 24 horas, posterior a
esos usar alcoholes desde 30% a 100%, este ultimo al menos 2
veces para que este menos saturado, posterior a eso xilol y
parafina mínimo 2 veces, este tipo de tejidos hay que
considerar el factor tiempo, ya que no se debe dejar más de
3 horas por frasco, en sí, no mas de 3 horas en alcohol de 100%,
en xilol y parafina. En los tejidos grasos como el tejido
mamario, es posible extender el tiempo de impregnación.
Tejido nervioso
Siempre tener en cuenta el tipo de tejido, numero de muestras
y el tiempo de procesamiento del tejido, para tejido nervioso
lo ideal es una fijación en formalina lo más posible, mínimo 24
horas y luego empezar la deshidratación del tejido por alcohol
de 30%, los alcoholes no deben exceder las 2 horas en el ultimo
frasco. El tiempo total en xilol y parafina debe ser máximo de
3 horas en cada uno.
Cuando el tejido se sumerge en un fluido, se produce un
intercambio entre el fluido interno del tejido y la solución
circundante. La velocidad de intercambio de fluidos, o difusión,
depende del tamaño y la densidad del tejido, así como de las
propiedades físicas y la concentración de los reactivos de
procesamiento. Hay varios factores que influyen en la
velocidad a la que se produce la difusión.
Viscosidad: Cuando el tejido se sumerge en un fluido, se
produce un intercambio entre el fluido interno del tejido y la
solución circundante. La velocidad de intercambio de fluidos, o
difusión, depende del tamaño y la densidad del tejido, así como
de las propiedades físicas y la concentración de los reactivos
de procesamiento. Hay varios factores que influyen en la
velocidad a la que se produce la difusión.
Agitación: Esto aumenta el flujo de soluciones alrededor del
tejido. El mecanismo de agitación en los procesadores
automatizados incorpora la oscilación vertical o rotatoria o la
extracción y sustitución presurizada de fluidos a intervalos de
tiempo.
Calor: Un aumento de la temperatura mejora el intercambio
de fluidos y la tasa de penetración, pero debe utilizarse con
moderación para reducir la posibilidad de producir artefactos
morfológicos por calor. Una exposición excesiva al calor puede
provocar la contracción y el endurecimiento del tejido, lo que
afecta negativamente a la tinción y la inmunohistoquímica
posteriores.
Vacío y presión: Ambos aumentan la movilidad de los fluidos,
incrementando así la tasa de infiltración y disminuyendo el
tiempo necesario para completar cada paso del proceso. El
vacío ayuda a eliminar las bolsas de aire en los tejidos porosos,
por ejemplo, el pulmón.
Contaminación por disolventes de procesamientos: El número
de bloques en cada tanda, el tipo de tejido, el tamaño, la
frecuencia de las tandas, el uso de esponjas y la
contaminación cruzada de los disolventes del procesador
influirán en la frecuencia con la que deben rotarse las
soluciones entre las estaciones o cambiarse para mantener la
calidad del procesamiento.
Recambio de los reactivos:
- Según el número de muestras procesada
- Numero de ciclos
- Tiempo de los reactivos
Si se corta la luz, las muestras se quedan en donde están, no
hay sitio seguro a donde dirigirla.
También debemos considerar:
- Agitación
- Vacío
- Temperatura
- Humead
La agitación de las muestras favorece la penetración de las
moléculas, la temperatura, puede incrementar hasta 45°,
incluso 60°C, asegurando el mantenimiento del tejido.
La viscosidad, las moléculas mas pequeñas penetran mucho
más rápido, lo que mejora la velocidad de impregnación. El
vacío y la presión para incrementar el procesamiento de
tejidos.
Los procesadores de transferencia de fluidos, en lugar de que
el frasco con las muestras pase por cada frasco de disolvente,
en este el disolvente es quien se va moviendo.
Los reactivos de procesamiento se bombean
secuencialmente dentro y fuera de la cámara de retorta
donde se cargan los casetes de tejidos, lo que reduce en gran
medida la exposición a los vapores de los disolventes.
Procesadores microondas los procesadores de tejidos
cerrados tienen la opción de añadir calor a la cámara para
calentar el disolvente desde cualquier estación, lo que acelera
la difusión en el tejido a un ritmo más rápido que a
temperatura ambiente.
Los modelos de procesadores de tejidos por microondas van
desde los que requieren la colocación manual de los reactivos
en la cámara hasta los que están completamente
automatizados.
Las microondas tienen límites de penetración, por lo que las
muestras no deben tener un grosor superior a 3 mm, ya que
las muestras más gruesas requerirían el mismo tiempo que el
procesamiento convencional.
Los avances tecnológicos han permitido desarrollar un
"procesador rápido de tejidos de entrada continua". Este
procesador cerrado utiliza tecnología de microondas,
infiltración al vacío y reactivos patentados que se describen
como "respetuosos con las moléculas". Un brazo robótico
desplaza los casetes de tejidos por las estaciones que
contienen acetona, isopropanol, polietilenglicol, aceite mineral
y parafina. Se utilizan microondas y agitación para acelerar
la difusión de los disolventes en el tejido. Se utiliza una
tecnología de microondas patentada que funciona a baja
potencia continua en lugar de pulsar altos niveles de energía
de microondas. La cámara de retorta cilíndrica permite que
las microondas circulen alrededor de la cavidad y elimina los
puntos calientes y fríos. El rendimiento continuo permite
cargar tejidos en el sistema cada 20 minutos, lo que mejora el
flujo de trabajo en el laboratorio y los consiguientes tiempos
de respuesta.

Es la orientación de la muestra de tejido en un medio de
soporte para crear un "bloque" de tejido adecuado para el
seccionamiento.
Formación del bloque para su posterior seccionamiento.
La densidad del bloque debe ser homogénea, de manera que
la navaja crea que está cortando lo mismo.
.El medio de incrustación debe ser completamente compatible
con el medio de infiltración para evitar la separación de las
secciones de tejido y facilitar el seccionamiento.
La inclusión es el método más común de endurecer el tejido y
consiste en infiltrar la muestra con sustancias líquidas que tras
un proceso de polimerización o enfriamiento se solidifican, sin
afectar a las características del tejido. Con ello se consigue
obtener cortes del orden de µm a nm, según el medio de
inclusión, sin que el tejido se rompa o se deteriore. Además, son
un buen método para preservar las muestras durante largos
periodos de tiempo. Existen diferentes sustancias o medios de
inclusión dependiendo del grosor del corte y de la técnica que
necesitemos realizar. Cuando se quieren hacer secciones para
su observación con el microscopio óptico el medio de inclusión
más frecuentemente usado es la parafina, mientras que si
vamos a realizar observaciones con el microscopio
electrónico la inclusión se realiza con resinas, principalmente
de tipo acríclicas o epoxy. Hay otros medios de inclusión que
se usan cuando al técnica lo requiere como son la celoidina,
nitrocelulosa, polietilen glicol o poliésteres de ceras.
Hay 2 tipos:
- Hidrofílicos o acuosos:
- Hidrófobos o anhidros:
Los acuosos son miscibles en agua, no es necesario el
procesamiento previo, su uso es limitado y no se conservan en
el tiempo, por ende, su uso es super limitado.
Ejemplos: carbowax, agar, gelatina.
Por otro lado, los anhidros no son miscibles en agua, por ende,
el tejido debe ser previamente deshidratado.
Los medios anhidros no deben producir solubilización y
retracción de los componentes tisulares,
Pueden ser conservados en el tiempo y permite la óptima
observación del tejido
Ejemplo: parafina, paraplast, celoidina y plásticos
Los más comunes son:
- Incrustación en parafina
- Inclusión en resina
La mayoría de los laboratorios utilizan centros de incrustación
modulares que constan de un dispensador de cera de
parafina, una placa fría y un área de almacenamiento
calentado para los moldes y los casetes de tejido procesados.
La cera de parafina se dispensa desde una boquilla en un
molde caliente del tamaño adecuado. El tejido se orienta en el
molde, se fija al fondo del mismo utilizando la placa fría y, a
continuación, se coloca un casete encima del molde y se llena
completamente de cera. Este bloque de tejido final se coloca
en una placa fría para que la parafina se solidifique.
El proceso de resina es similar al de la incrustación en parafina,
pero estos bloques se endurecen (polimerizan) con calor, luz
ultravioleta o catalizadores químicos, según el tipo de resina
utilizada
En el AFIT sale:
Inclusión en celoidina, en el pasado era mas ventajoso utilizar
celoidina a parafina, ya que provee un mejor apoyo en tejidos
duros (hueso, útero) y frágiles (ojos, tejido neurologico).
La celoidina no requiere calor durante su procedimiento y se
recomienda para impregnación e inclusión en espécimen que
puedan ser afectados por soluciones calientes, pero toma
mucho tiempo, de 7 a 10 días para infiltrar el espécimen, atrae
humedad, lo que dificulta que se solidifique, es difícil obtener
secciones de menos de 10 micras.
Nitrocelulosa de baja densidad (LVN) puede usarse en lugar de
la celoidina para propósito similares, demora de 6 a 11 en
impregnarse, el bloque final es mas duro que la celoidina, pero
las secciones pueden romperse durante la tinción.
También existen medios de inclusión hidrosolubles, estos
permiten tomar la muestra directamente desde el fijador, sin
necesidad de pasar por los alcoholes y el xilol, son ideales
cuando es necesario demostrar sustancias que podrían ser
disueltas en xilol o que son inactivadas por calor
Los hidrofílicos se emplean en estudio enzimáticos, requieren
seccionamiento en un microtomo de deslizamiento,
conservan sustancias solubles en solventes orgánicos.
Los hidrófobos proveen un medio elástico y resistente para
permitir el seccionamiento del tejido sin distorsionarlo, estos
medios protegen la muestra y proporcionan brillo óptico al
colorante.
La parafina se utiliza para microscopia óptica, mientras que la
resina se utiliza en microscopia electrónica, ya que esta es
estable al haz de electrones
Las parafinas blandas tienen un punto de fusión de 45° C
aproximadamente y funcionan bien con tejidos blandos, las
parafinas duras se derriten a 60°C y son mejores para tejidos
duros.
Para la observación de la ultraestructura celular es necesario
hacer secciones de tejido muy delgadas, del orden de
nanometros, denominadas ultrafinas, y usar un microscopio
electrónico de transmisión. La obtención de secciones
ultrafinas implica que tenemos que endurecer enormemente
el tejido. Esto se puede conseguir mediante congelación,
obteniendo entonces la secciones con un ultracriotomo. Sin
embargo, lo más frecuente es incluir el tejido en un material
de alta dureza como son las resinas de tipo epoxy, o en menor
medida las resinas acrílicas como el metacrilato. Ambas se
infiltran en el tejido en forma líquida y posteriormente
polimerizan sin afectar a la ultraestructura celular.
La capacidad de ver la morfología tisular deseada en la
sección depende de la correcta colocación u orientación de la
muestra en el bloque. Una orientación incorrecta puede dañar
los elementos tisulares de diagnóstico durante la microtomía
u ocultarlos de la vista microscópica, impidiendo un
diagnóstico correcto
La orientación del tejido debe ofrecer la menor resistencia del
tejido contra la cuchilla durante el seccionamiento.
Ejemplos:
La parte más plana de la muestra va hacia abajo, apoyada en
la superficie del molde.
La parte mas dura de la muestra va hacia arriba, de manera
que la cuchilla corte desde lo mas blando a lo mas duro, de
esta manera los tejidos mas duros no comprimen a los tejidos
más blandos
En las estructuras tubulares debe verse el lumen
 La superficie que haya sido marcada con tinta y que debe ser
incluida en forma opuesta a la superficie de corte no debe
verse en las secciones.

Aquellas muestras que contengan una superficie epitelial

deben orientarse de tal forma que en el corte se vean todas
las capas de la pared.
La superficie epitelial debe ser la última en cortarse así se evita
que se comprima.

Cuando son múltiples muestras, se pone una al lado de la otra,

muy juntas y con la misma orientación, de manera que la
navaja crea que esta cortando una sola muestra.

Los quistes se posicionan con la parte lisa boca bajo.

Las muestras que estén marcadas con tinta china o

colorantes deben posicionarse de tal manera que la tinta
pueda observarse en el borde de la sección.
 A menudo se denomina "Minot" en honor a su inventor. El
mecanismo básico requiere la rotación de un volante de
avance fino en 360º, desplazando la muestra verticalmente
más allá de la superficie de corte y devolviéndola a la posición
La microtomía es el medio por el que se secciona el tejido y se inicial. El microtomo rotativo puede ser manual, es decir,
fija a la superficie de un portaobjetos de vidrio para su completamente manipulado por el operador;
posterior examen microscópico.. semiautomatizado con un motor para avanzar el volante fino
El instrumento utilizado para cortar secciones es el microtomo. o el grueso; o totalmente automatizado, cuando dos motores
Tiene un mecanismo de avance que mueve el objeto, el bloque accionan el volante de avance fino y el grueso. El mecanismo
de parafina, durante una distancia predeterminada hasta que de avance del bloque puede ser retráctil o no retráctil.
entra en contacto con la herramienta de corte, el cuchillo o la Entre sus ventajas se encuentran la capacidad de cortar
cuchilla. El espécimen se desplaza verticalmente a través de secciones finas de 2-3 μm y su fácil adaptación a todo tipo de
esta superficie de corte y se produce una sección de tejido. seccionamiento de tejidos. Los avances tecnológicos en la
Antes de realizar el corte se debe exponer la superficie de la automatización de la microtomía han mejorado la calidad de
muestra, por lo que es necesario retirar la parafina o medio las secciones, han aumentado la productividad y han
de montaje sobrante alrededor de la muestra y luego realizar mejorado la seguridad laboral del tecnólogo. La eliminación del
el desgaste. manejo manual del microtomo reduce la incidencia de
También se debe tener en consideración la correcta posición trastornos por movimientos repetitivos, un problema de salud
de la muestra n el soporte laboral común en el laboratorio de histología.
El microtomo de rotación provoca el corte gracias a la
transformación de un movimiento de rotación en otro de
ascenso y descenso del portamuestras. En el movimiento de
bajada sobre la cuchilla se produce un acercamiento del
portamuestras hacia la cuchilla según el grosor de corte
seleccionado. En el portamuestras existe un sistema mecánico
que permite orientar la superficie de corte de la muestra
respecto a la cuchilla. En estos microtomos la cuchilla se
mantiene fija durante el proceso de corte, pero puede
regularse el ángulo de ataque, es decir, el ángulo de la hoja de
la cuchilla respecto a la superficie de la muestra.
Existen varios tipos de microtomos, cada uno de ellos diseñado
para un propósito específico, aunque muchos tienen papeles
multifuncionales.: En este caso, la muestra se
- Microtomo rotatorio mantiene inmóvil y la
- Microtomo deslizante cuchilla se desliza por la
- Microtomo balanceo parte superior durante el
- Microtomo de congelación o criostato seccionamiento. Se utiliza
- Ultramicrotomo principalmente para
bloques grandes, tejidos
duros o montajes
Los microtomos completos, y es
para cortar material especialmente útil en patología neurológica y oftálmica, pero
incluido en parafina las secciones de 3 μm son difíciles de producir.
son probablemente Se utiliza para inclusión en celoidina o bloques grandes.
los más usados en Se realiza un movimiento horizontal para obtener los cortes.
los laboratorios de Con el microtomo de deslizamiento se obtienen cortes
histología. Todos mediante un movimiento de deslizamiento de la cuchilla sobre
poseen varias partes el bloque.
comunes: una En estos microtomos el movimiento lo proporciona
cuchilla, un directamente la mano y es de ida y vuelta, siendo en la vuelta
portamuestras y un sistema mecánico que permite acercar cuando se eleva la posición del bloque, o disminuye la de la
el bloque de parafina, con la muestra dentro, a la cuchilla, a cuchilla, una distancia que nos dará el grosor del corte.
una distancia que se corresponde con el grosor de la sección
que pretendemos obtener, y realizar el corte.
El bloque de tejido se Tejidos:
monta en el extremo de un - Tejidos duros: corte con impulso firme y rápido
brazo móvil de resorte. - Tejidos blandos: corte con movimientos suaves y
La navaja va fija en lentos
posición horizontal con el - Tejido nervioso, ganglio linfático: corte lento y
filo hacia arriba y uniforme.
ligeramente inclinado Corte:
hacia el bloque. - H&E, especiales: 2 a 4 micrones
Satisfactorio para cortes seriados - Hueso: 5 micrones
- Nervioso: 8 micrones
- Tejido graso: 5 -6 micrones
Destinado a la obtención rápido de - Criostato: 5 a 8 micrones
cortes de congelación - IHC: 3 a 5 micrones.
Compuesto por:
- Platina de congelación
- Dispositivo de
refrigeración de la navaja
- Tubo de conducción de CAUSA SOLUCION
anhidrido carbónico La cinta de secciones consecutivas está curvada
Es utilizado para la congelación de Los bordes del bloque no son Recortar el bloque hasta
los tejidos es una manera rápida paralelos dejarlo paralelo
de endurecerlos sin necesidad de Filo de la cuchilla sin brillo Sustituir la cuchilla o
inclusión. desplazarse a otra zona
Exceso de parafina Recorte el exceso de parafina
Tejido de consistencia Reorientar el bloque
variable
Utilizado exclusivamente Secciones gruesas y finas
para la microscopía Parafina demasiado blanda Enfriar el bloque con hielo o
electrónica. para los tejidos o las volver a introducirlo en cera
Para la observación con condiciones de mayor punto de fusión
detalle de la ultraestructura Ángulo de separación Aumentar el ángulo de
insuficiente separación
celular es necesario realizar
Mecanismos de microtomo Mantener el micrótomo -
secciones muy delgadas, del defectuosos lubricar y calibrar.
orden de nanómetros, Comprobar si hay fallos
denominadas ultrafinas, y observarlas con el microscopio evidentes en el micrótomo,
electrónico de transmisión. las piezas pueden estar
El Ultramicrotomo tiene un diseño para cortar de un modo desgastadas
similar al microtomo de parafina de rotación, pero mucho Cuchilla o bloque suelto en los Apretar el bloque y la hoja
más preciso y sofisticado. Quizá el sistema más delicado sea el soportes
que hace avanzar el bloque sobre la cuchilla pues debe Chatter - zonas gruesas y finas paralelas al filo de
la cuchilla
hacerlo a intervalos de varios nanómetros.
Cuchilla o bloque suelto en Apretar los soportes de las
Al realizar cortes muy delgados cualquier vibración o cambio
sus soportes cuchillas y de los bloques
de temperatura afecta la homogeneidad del grosor del corte, Ángulo de separación Reducir el ángulo
por tanto el Ultramicrotomo debe situarse en una habitación excesivamente pronunciado
donde no haya vibraciones y mantenerla a temperatura o inclinación de la cuchilla
constante para evitar dilataciones del brazo que porta la Tejido o cera de parafina Utilizar líquido suavizante
muestra, dentro de lo posible. Además, estos aparatos se demasiado duros para el
colocan sobre mesas especiales para disminuir las vibraciones. seccionamiento
Zonas calcificadas en el tejido Rehidratar y descalcificar la
superficie
Deshidratación excesiva del Volver a incrustar en
tejido parafina fresca
Hoja sin filo Sustituir o utilizar una nueva
zona de la cuchilla, limpiar el
 borde de la cuchilla para Sección demasiado gruesa Reducir el grosor de la
eliminar el exceso de sección
parafina
Rotura de secciones en ángulo recto con el filo
de la cuchilla
Muescas en la cuchilla Utilizar otra parte de la hoja o
sustituirla
Partículas duras en el tejido Descalcificación de la
superficie si hay depósitos de
calcio
Partículas duras en la Retirar con un bisturí de
parafina punta fina si el mineral u otra
partícula
Las secciones no formarán cintas
Parafina demasiado dura Reintegrar en parafina de
para las condiciones de menor punto de fusión
seccionamiento
Escombros en el filo de la Limpiar con un paño húmedo
navaja de xileno
Ángulo de despeje incorrecto Ajustar el ángulo óptimo
Las secciones se adhieren al bloque en la carrera de retorno
Ángulo de separación Aumentar el ángulo de
insuficiente separación
Escombros en el borde de la Limpiar con un paño húmedo
cuchilla de xileno
Escombros en el bloque Recortar los bordes del
bloque
Electricidad estática en la Humedezca el aire alrededor
cinta del micrótomo, coloque un
protector de estática o hojas
de secador cerca del
micrótomo
Sección incompleta
Impregnación incompleta del Reprocesar el bloque de
tejido con parafina tejido
Tejido incorrectamente Vuelva a colocar el tejido,
incrustado asegúrese de que la
orientación es correcta y que
el tejido está plano en el
molde
Secciones cortadas Reforzar el bloque, cortar
superficialmente más profundamente en el
tejido
Compresión excesiva
Cuchilla embotada Sustituir la cuchilla
Parafina demasiado blanda Enfriar la cara del bloque y
para el tejido volver a cortarlo
Las secciones se expanden o se desintegran en
baño de agua
Mala impregnación del tejido Reproceso de tejidos
Temperatura del agua Reducir la temperatura del
demasiado alta en el baño de baño de flotación
flotación
Las secciones se enrollan en una bobina en lugar de
permanecer planas en el borde de la cuchilla
Cuchilla desafilada Utilizar una cuchilla nueva
Ángulo de rastrillo Reducir la inclinación de la
demasiado pequeño cuchilla si el ángulo de
separación es excesivo

La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son
incoloros y por ello necesitamos teñirlos para observar sus
características morfológicas con el microscopio óptico. Ello se
consigue con el uso de los colorantes, sustancias coloreadas
que son capaces de unirse de manera más o menos
específica a estructuras del tejido aportandoles color. Se
utilizan normalmente para teñir a las células y componentes
tisulares que van a ser observados con el microscopio óptico
y por ello se realizan habitualmente sobre secciones de tejido,
siendo las más utilizadas las secciones obtenidas a partir de
inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato. Los
colorantes son los elementos principales de las tinciones
generales
El color es la percepción del ojo, el ojo es quien percibe el color.
El colorante es una sustancia orgánica, su base es un anillo
aromático y posee una configuración electrónica que absorbe
luz, es capaz de ionizarse, es decir, descomponerse y
reaccionar con otra estructura.
La coloración es el proceso por el cual trasmitimos color a los
tejidos.
La base de todos los colorantes es el benceno, este es un anillo
aromático.
La absorción de radiación electromagnética excita a un
electrón desde el orbital molecular mas externo desocupado
creando un estado de excitación de la molécula.
La molécula de un colorante tiene normalmente dos
componentes importantes: uno que aporta el color,
denominado cromógeno, y otro que posibilita la unión a
elementos del tejido denominado auxocromo. El cromóforo es
la organización molecular dentro del cromógeno responsable
de la absorción de un espectro determinado de longitudes de
onda. El auxocromo que se une al cromógeno puede influir en
su coloración y muchos colorantes tienen más de un grupo
auxocrómico. El auxocromo puede ser un grupo ionizable, un
grupo que reacciona covalentemente con iones metálicos
(mordientes) o puede reaccionar covalentemente con el
sustrato, en este caso el tejido. Los colorantes son
normalmente hidrosolubles, aunque hay colorantes que
carecen de grupos ionizables y sirven para teñir sustancias
grasas, como gotas de lípidos.
El cromóforo es el responsable de la absorción química, el le
da las característica al colorante y cada colorante tiene uno
único
El auxocromo son los grupos ionizables, los que le dan la
capacidad al cromóforo de unirse al tejido.
Un cromógeno es el anillo aromático más el cromóforo
Los colorantes usados en histología se emplean a muy altas
concentraciones y la cantidad que se une al tejido es
realmente pequeña. Por eso, una solución de colorantes se
puede usar muchas veces sin que se agote. La manera en
cómo se consigue una tinción adecuada se puede dividir en
dos tipos: progresiva y regresiva. La tinción progresiva consiste
en obtener una coloración adecuada controlando el tiempo
de la sección en el colorante, de modo que a más tiempo más
coloración. La tinción regresiva consiste en la eliminación lenta
de colorante de una tinción que ha sido teñida en exceso. Esta
eliminación se consigue normalmente con soluciones
alcohólicas y al proceso se le denomina desteñido. La
concentración de la solución y tiempo de diferenciación nos
aporta la coloración adecuada.
En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos
tisulares de manera específica y para ello usamos colorantes
que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la
tinción denominada azán contiene azocarmín y naranja-
anilina-ácido acético que tiñen los núcleos de rojo y sobre todo
destaca el conectivo intensamente teñido de azul. Otra tinción
combinada es el tricrómio de Mallory que tiñe el colágeno de
verde y las células musculares de rojo.
Cuando un colorante se une al tejido y aporta un color
diferente al que tiene en solución se dice que ha ocurrido un
fenómeno de metacromasia. Esto se debe a que las
propiedades de absorción de la luz del colorante cambian al
unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul de
toluidina se vuelve púrpura cuando se une a ciertos gránulos
de los mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el
mismo color que en solución se denomina ortocromasia.
Físicos:
- Longitud de onda
- Composición del colorante y del tejido
- temperatura
Químicos:
- Grupos químicos del colorante
- Carga
- Fijación
La absorción de radiación electromagnética excita a un
electro desde el orbital molecular de primer orden ocupado,
el orbital molecular mas extremo desocupado, creando un
estado de excitación en la molécula.
En sistema aromáticos altamente conjugados, la energía
requerida para generar estos estados es menor, siendo una
radiación de baja frecuencia.
La energía absorbida por las moléculas genera cambios en los
niveles de energía de los electrones unidos por enlaces
covalentes, y en los pares de electrones asociados con
algunos átomos, los sistemas cromóforos conjugados de un
colorante usualmente incluyen dobles enlaces dentro de uno
o mas anillo aromáticos
 Diferenciación (Extracción selectiva del exceso de colorante, es
controlado) v/s Decoloración (No es selectiva, decolora todo;
por ejemplo, la tinción de gram)
Agentes diferenciadores: Solvente (Mismo solvente del
La base de todo colorante es el benceno, este tiene una colorante usado), control de pH (remoción por disolución:
longitud de onda de 200, por lo que no es perceptible por el Competencia de H+ con colorantes catiónicos por grupos
ojo humano. ácidos del tejido; se extrae en donde está más débil mediante
A medida que vamos uniendo mas bencenos va aumentando un solución ácida), mordientes (similaridad estructural y de
la longitud de onda, al igual que si vamos complejizándolo aún carga; se usa una concentración más baja de la que ya se usó),
más, es decir, agregando auxocromos. oxidantes y otros colorantes (desplazamiento).
A medida que se agreguen las auxocromos se intensifica el *Oxidantes: KMNO4, CrO3, NAIO3
color. *Ácidos: Alcohol, ácidos (0,5- 1%)
El cromóforo se une al auxocromo y este ultimo es el que
permite que el colorante se una al tejido, ya sea por fuerzas: Colorante Solvente Tinción
- Covalentes Acido Acido Se incrementa la coloración
- No covalentes Acido Básico Decae la coloración
Básico Acido Decae la coloración
- Electrostáticas
Básico Básico Se incrementa la coloración
- No electrostáticas
En el caso del colorante ácido más el solvente ácido, se
- Fuerzas de van der Waals
protonan todas las estructuras que se quieran intensificar y
- Uniones hidrofóbicas
viceversa
Los colorantes pueden actuar por:
En el caso del colorante ácido más el solvente básico, se
- Por afinidad química elemental
desprotonan las estructuras que se quieren teñir y viceversa.
- Por difusión simple del colorantes
- Por la metacromasia del colorante
- Por reacción con grupos químicos específicos
- Desenmascarar reacciones enzimáticas La estructura de los colorantes esta dada por el benceno, son
- Histoautoradiografia grupos aromaticos
Los colorantes contienen en su estructura un cromógeno
central, el cual le da intensidad a la molécula, el cual se
organiza en función de enlaces C-C.
- Tamaño de la molécula de colorante: (Está dado por
Rodeando al grupo central se encuentran los auxocromos, los
el PM, en donde las moléculas de los colorantes
cuales le permiten unirse al tejidos.
tienden a formar agregados reversibles; se producen
Cromóforos:
con moléculas de gran tamaño en soluciones
- Grupo nitro (NO2),
concentradas y bajas T°). Las moleculas mas grandes
- grupo carbonilo (C=O),
difunden de manera más lenta.
- grupo nitroso (N=O)
- Porosidad del sustrato
- grupo azo (N=N).
- Efecto interfase: (Consecuencia de la baja tensión
Auxocromos:
superficial entre el agua y los solutos. El colorante
- Grupo sulfónico (H2SO4),
tiene una mayor concentración en la superficie de la
- grupo carboxilo (R-COOH),
solución).
- grupo hidroxilo (R-OH),
- diferenciación: es un proceso por el cual es removido
- grupo amino (NH2),
el exceso del colorante en los tejidos, con el fin de
- cloro (CL2).
optimizar el contraste entre las estructuras.
- acentuadores: son facilitadores de la coloración,
“intensificadores”
- Concentración
- Solvente del colorante/medio
- Fuerza iónica de la solución
- Temperatura
- pH
- grupos del colorante
 o Ejemplos de colorantes básicos son la
tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de
metileno o la hematoxilina.
- Neutro: poseen una porción ácida y otra básica,
ambas con capacidad para aportar color. Por tanto,
un mismo colorante puede teñir tanto las partes
básicas como las ácidas de los tejidos
o Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.
- Indiferente: realmente no se unen a elementos de los
tejidos por afinidad química sino porque se disuelven
en ellos.
o Por ejemplo, el colorante Sudán se disuelve
en los lípidos y por tanto teñirá a las gotas
de lípidos, especialmente en los adipocitos.
- Mordientes: son aquellos que se usan en combinación
Mecanismo químico con sales metálicas, que actúan como mordiente.
- directa: colorante puro que tiene toda la estructura Estas sales se pueden emplear junto con el colorante,
de un colorante, por ejemplo, la eosina antes o después. En algunos casos el colorante
- indirecta: como la hematoxilina que requiere mordiente puede ser también aniónico o, menos
mordiente para unirse al tejido frecuentemente, catiónico. Normalmente se
- progresiva: el colorante tiene un tiempo óptimo de emplean para teñir los núcleos.
acción o Por ejemplo, la hematoxilina férrica de
- regresiva: se sobretiñe y luego se utiliza un líquido Heidenhain
diferenciador
- simple: como Orange G, eosina, fucsina acida
- combinada: se mezclan 2 o más colorantes para
Afinidad química diferente: Variables dependientes del tejido y
hacer una tinción
el colorante
- pancromica: todos los colorantes están en el mismo
Densidad diferente: Solo depende del tejido (Fijación; número
baño
de ácidos o aminos disponibles), ya que los componentes del
- panóptica: es una tinción sucesiva
tejido no tienen la misma permeabilidad.
Permeabilidad diferente: Del tejido y del colorante

Según la naturaleza química del radical auxocromo los

colorantes se clasifican en:
- Acido: son sales con el anión coloreado y la base
incolora. Son derivados de grupos sulfónicos,
carboxilos o hidroxilos fenólicos. Tienen apetencia por
sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas
localizadas en el citoplasma celular y también por el
colágeno de la matriz extracelular. La unión es por
atracción eléctrica.
o Ejemplos de colorantes ácidos son la fucsina
ácida, verde rápido, naranja G o la eosina
- Básico: son sales en las que la base, normalmente
una amina, aporta el color, mientras que la parte
ácida es incolora. Es decir, son colorantes catiónicos.
Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido
como el ADN o ciertos componentes de la matriz
extracelular como los glicosaminoglicanos. La unión
es por atracción eléctrica. Así, ponen de manifiesto el
núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los
ribosomas por ser muy abundante, así como ciertas
matrices extracelulares ricas en componentes
ácidos.
- Ortocromasia: Cuando un colorante transmite hacia
un tejido por una unión química el mismo color
(colorante azul: en el tejido se verá azul).
- Metacromasia: Actúa por afinidad química, pero
cuando tiñen, forman puentes de hidrógeno (se
polimerizan). Se hace de una forma ordenada y
entregan distintos colores. [Colorantes básicos: se
unen a unidades de carácter ácido]. NO pueden pasar
por alcohol, se requiere un medio de montaje acuoso
y todos son planos (Tienen anillos aromáticos). La
metacromasia depende de la particularidad del
colorante y las características del tejido de sus
componentes.
o Hipsocromia: es el desplazamiento a la
longitud de onda azul. (metacromasia
negativa)
o Batocromia: es el desplazamiento de
longitud de onda al rojo (máxima expresión
de la metacromasia)
- Policromasia: un solo colorante es capaz de teñir de
2 colores
Colorante anfótero: Se anulan las cargas
Colorante indiferente: Lipofilicos, no reaccionan químicamente
(no tiene auxocromos ionizables: métodos físicos).
Colorante natural que se extrae de un árbol y es de un
carácter más bien básico.
Tiene una estructura química central (cromóforo, que le da la
identidad), en donde radica todas las características del
colorante; como tiñe, disuelve, en qué pH se ioniza, que color
tiene.
Por fuera de esta estructura hay muchos radicales químicos
(grupos funcionales), que son encargados de unirse al tejido;
auxocromos.
La Hx NO tiene auxocromos, por ende, requiere de un
mordiente (puede ser un metal; fierro, aluminio).
Al agregarse el mordiente, el pH sube (4 a 6 más o menos), ya
que al ser metálico, entrega grupos funcionales capaces de
unirse al tejido. Al alcanzar este número de pH, tiene afinidad
por estructuras aún más ácidas que él (grupos fosfatos
presentes en el núcleo, grupos sulfatos y COOH que están en
las mucosustancias).
Si la Hx tiene aluminio como mordiente, los núcleos serán
azules y si tiene fierro, serán café oscuro o negro. - La Hx tiene
que ser oxidada (madurada)
Si se sobreoxida, el colorante se precipita, teniendo poca
posibilidad de unirse al tejido o se pega al tejido. El colorante
no tiñe. La solución a esto es añadir ácido acético ya que
disuelve todos los precipitados y favorece la intensidad de
tinción.
Cuando se oxida, la Hx pasa a llamarse hemateína.
Primero, la Hx se debe oxidar para posteriormente agregarle
el mordiente.
La Hx por sí sola no es un colorante, en cambio su forma
oxidada (hemateina), si.
La hematina puede conseguirse de 2 maneras: Natural (al aire
y el proceso dura de 3 a 6 meses); la cual tiene una capacidad
de acción más prolongada. La otra forma es la química
(aniónica, afinidad pobre con el tejido y su tinción es muy
innadecuada sin ningún mordiente; entonces añadiéndolo
confiere una capacidad positiva neta y es capaz de unirse a
las estructuras ácidas).
Oxidantes: Óxido de mercurio
El mordiente se define como: Metal polivalente o ión metálico
polivalente que forma un complejo coordinado con ciertos
colorantes.
El complejo de coordinación se define como quelato que es
una unión covalente simple y una unión covalente coordinada;
el agente quelante es el aluminio o el fierro.
Colorante + Mordiente = Laca→ Complejo de coordinación
Proceso de tinción: Primero viene el desparafinado con xilol
para luego hidratar la muestra con alcoholes de manera
decreciente. Se aplica la Hx, se deshidrata la muestra con
alcohol de manera creciente y por último pasa por xilol.
El tiempo para teñir con Hx va a variar por el tipo de Hx y el
tiempo de uso (oxidación), tipo de tejido y que se requiere teñir.
Cuando no marca una tinción, puede ser por mala
deshidratación, que no se estire el corte en agua limpia, que
no sea desparafinada o que no sea bien diferenciada.
La Hx es soluble en agua, alcohol, etilenglicol y glicerol
Se emplea para la tinción de núcleos, mielina, fibras elásticas,
fibrina, neuroglia, estriaciones musculares.

Hematoxilina Aplicación Oxidante Mordiente

Ehrlich Tinción nuclear utilizada con eosina y tiñe algunas Natural Alum
mucinas
Delafield Tinción nuclear con eosina Natural Alum
Mayer Tinción nuclear utilizada con eosina y Yoduro de sodio Alum
contratinción nuclear
Harris Tinción nuclear con eosina Óxido de mercurio Alum
Cole Tinción nuclear con eosina Yodo Alum
Carazzi Tinción nuclear utilizada con eosina en secciones Yodato de potasio Alum
congeladas
Gill Tinción nuclear con eosina Yodato de sodio Alum
Weigert Tinción nuclear utilizada con colorantes ácidos Natural Hierro
Heidenhain Detalle intranuclear, estrías musculares Natural Hierro
Verhöeff Fibras elásticas Natural Hierro
Loyez Mielina Natural Hierro
Mallory PTAH Fibrina, estrías musculares, fibras gliales Natural Tungsteno
Thomas Colágeno, gránulos de células endocrinas Peróxido de hidrógeno Molibdeno
Solcia Gránulos de células endocrinas Sin oxidante Plomo
Mallory Hierro, cobre, plomo Sin oxidante Sin mordiente
Weigert-Pal Mielina en la preparación de bloques Sin oxidante Cromo-cobre
 Métodos de estudio de tejido conectivo
- Van Gieson: es de 1 paso,
- Masson: múltiples pasos, utiliza poliácidos

Fijación: zenker, Bouin, formol u otros fijadores

El tricrómico es un método que tiene como objetivo diferenciar
Tejido a utilizar: piel hígado, tráquea
estructuras para su posterior identificación, es una tinción
Soluciones:
diferencial de estructuras básicas con colorantes ácidos en un
A. Solución Picro-Ponceau:
medio acido.
Ponceau S (C.I. 27195) al 1% (10ml): calcular con %m/m
Es una tinción diferencial de fibras colágenas y musculares.
Ácido acético glacial (5ml): respetar proporción 1:1. Se debe
Pueden ser de 1 o múltiples pasos, se ven con claridad 3 colores.
exigir el para análisis, viene con trazas de agua
El medio ácido protona las proteínas que están en el tejido,
Solución acuosa saturada de ácido pícrico (90ml)
puesto que se necesita que el tejido tenga las proteínas muy
B. Hematoxilina férrica de Weigert:
disponibles, para una tinción intensa.
Hematoxilina 75290, vienen cristalizada en polvo y solo cambio
Cuando fijamos el tejido, lo más común es sobrefijarlos, por lo
el mordiente y el oxidante para preparar todas las hx
que hay menor disponibilidad de proteínas, se enmascaran
Procedimiento
más proteínas, entonces al tener menor receptividad de las
1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada.
proteínas se necesita ayudarlas con un medio acido, se van a
2. Tinción nuclear con Hematoxilina férrica de Weigert.
protonar (NH2 a NH3) y su capacidad con el colorante acido
(Sol. B) a 10 minutos en placas.
será mayor.
3. Lavar abundantemente en agua corriente, hasta que
El fundamento de los tricrómicos es una tinción nuclear con
los núcleos se observen nítidamente negros. Pasar
hematoxilina férrica y luego una tinción diferencial de
por agua destilada.
citoplasma, colágena, fibras musculares y eritrocitos.
4. Teñir en la solución de Van Gieson o (Picro-Ponceau)
Los colorantes aniónicos que se utilicen son de diferente peso
durante 1 a 2 minutos.
molecular, uno grande y otro chico para que uno vaya a las
5. Sin lavar, someter los cortes directamente en el
estructuras más permeables y el otro a las menos
alcohol al 95%.
permeables. La fuerza electrostática funciona muy bien y el
6. Deshidratar en el alcohol absoluto, aclarar y montar
pH acido aumenta la fuerza de unión electrovalente.
en resina sintética.
Base de acción:
Resultados:
- Estado del tejido: como estuvo la fijación y los
- Fibras colágenas: Rojas
componentes que formen parte del tejido
- Núcleos: Azules a negros.
- Estado del colorante: si el colorante tiene un peso
- Fibras musculares: Amarillas.
molecular alto o bajo, da cuenta de la afinidad
- Citoplasma: Amarillo.
química que presente. El colorante grande se acerca
a la estructura compacta, como el glóbulo rojo, ya
que tiene afinidad química con él, pero después del
primer lavado se va a ir todo, ya que no está unido, Fijación: Bouin, zenker, Helly, formol al 10%
no lo penetra. En cambio, un colorante pequeño que Tejidos a utilizar: piel, hígado, tráquea
se una a un tejido compacto, si el colorante es capaz Soluciones
de adentrar al tejido a. Hematoxilina férrica de weigert
- Poliácidos y desplazamiento: son estructuras b. Solución de Biebrich Scarlett-Fucsina acida
cationes, que se utilizan para diferencial ciertas Biebrich Scarlett 1% solución acuosa (C.I 260905): 90 ml
estructuras y dejarlas libres para que pueda actuar Fucsina Acida 1% solución acuosa (C.I 42685):10 ml
el colorante que sigue Ácido Acético Glacial: 1 ml
El colorante pequeño es el ácido pícrico (amarillo), glóbulos c. Solución de poliácidos
rojos, citoplasma y musculo se tiñen con él, mientras que el Ácido fosfomolibdico: 5 g
Ponceau (rojo) es más grande y tiñe la colágena. Cada uno tiñe Ácido fosfotungstico: 5 g
estructuras distintas a pesar de ser ácidos, su diferencia es el Agua destilada 200 ml
tamaño o PM y la estructura que tiñen, una es más permeable d. Solución de azul de anilina o azul de metileno
que la otra. Azul de Anilina soluble en agua (C.I. 42755): 2.5 gr.
Los tricromicos más frecuentes son: Ácido acético glacial: 2 ml.
Agua destilada: 100 ml.
e. Solución de ácido acético glacial
Procedimiento
1. Desparafinar e hidratar los cortes hasta el agua
destilada.
NOTA: Si el tejido ha sido fijado en formol,
a. Mordentar en solución de Bouin, por una hora a 56
grados Celsius o toda la noche a temperatura
ambiente.
b. Enfriar y lavar en agua corriente hasta que
desaparezca el color amarillo, diferenciar en alcohol
amoniacal 1% (solvente: alcohol 70°) lavar en
abundante agua corriente por 5 minutos.
c. Lavar en agua destilada.
2. Teñir en Hematoxilina de Weigert durante 10
minutos.
3. Lavar en agua corriente por 10 minutos.
4. Lavar en agua destilada.
5. Teñir en la solución de Biebrich Scarlett Fucsina
Acida, durante 30 “ A 2 minutos.
6. Lavar en agua destilada.
7. Colocar en la solución c durante 10 a 15 min. Lavar
rápidamente en agua destilada.
8. Teñir en solución d por 5 minutos-(Para sistema
nervioso central de 15 a 20 minutos).
9. Lavar en agua destilada.
10. Colocar en solución e durante 3 a 4 minutos
(Descartar la solución).
11. Deshidratar en alcohol al 96 % y luego en alcohol
absoluto. Aclarar en xilol. Montar en resina sintética.
Resultados
- Núcleos: Negros
- Citoplasma, queratina, fibras musculares: Rojas
- Fibras colágenas: Azules o verdes
Se debe realizar una post fijación a las muestras que tengan
desde la formalina, para esto se utiliza un fijador en base a
sales, los cuales se unen a los grupos carboxilos de las
proteínas dejando los grupos aminos libres
La tinción nuclear debe ser con hematoxilina férrica, ya que la
de alumbre se decolora debido al medio acido, se utiliza
hematoxilina de wigert y debe ser preparada en el momento
de utilizar
Tener en consideración el peso molecular del colorante, ya
que necesitamos que sean de pesos distintos para que cada
uno vaya a identificar una estructura diferente.
El medio debe ser acido para protonar el tejido, de manera de
tener más proteínas disponibles.
El ácido acético debe tener la misma concentración que el
colorante, en este caso 1%..
Como los colorantes son preparados en agua, la lámina debe
lavarse en agua destilada y luego se realiza la tinción nuclear.
Antes de pasar por cualquier colorante, la lamina debe pasar
por agua destilada.
No pasar van Gieson por agua corriente, ya que se modifica
el pH .
después de pasar por van Gieson no se lava, se pasa directo
al alcohol de 95%, ya que el agua va a sacar la coloración del
ácido pícrico y se debilitara la tinción de las colágenas.
En masson debemos estar atentos a la diferenciación con los
poliácidos y con el colorante de mayor peso molecular, ya que
puede desplazar al primero y dejar todo del mismo color, se
debe detener cuando obtenga el contraste requerido
Masson se diferencia con ácido acético para azul de celestina
y poliácidos para Biebrich Scarlett.
SOLO es recomendado el ácido pícrico para la sobreoxidación
con formalina con la técnica de Masson, ya que este tiene la
particularidad de que se hace un contraste amarillo. En el caso
de otras preparaciones, se modifica el pH.
orden de tinción según la permeabilidad de los componentes
del tejido (del menos permeable al más permeable)
1. Eritrocitos
2. Gránulos de eosinófilos
Menos permeable
3. Queratina
4. Fibrina
5. Musculo
6. Citoplasma
7. Hueso y tendón
8. Colágeno
9. Tejido conectivo areolar.
La utilización de tricrómico de MASSON o VAN GIESSON
depende del tipo de patología a utilizar, si es inflamatoria es
VAN GIESSON, pero si es neoplásica lo común es el MASSON
Se realiza control de calidad interno, es decir, se hace en base
a las obviedades de la muestra.
Por ejemplo, un vaso sanguíneo, este estará rodeado por fibras
musculares y por fuera siempre habrá fibras colágenas
Observar y diferenciar las fibras elásticas del resto del tejido.
Hay 2 principales métodos:
- Orceina de unna-tanzer
- verhoeff
Verhoeff es la más común y la que mejor se entiende
En Verhoeff se realiza una modificación de la fibra elástica.
El centro proteico de la elastina está rodeado por un
componente microfibrillar que equivale a la elastomucina, es
decir, elastina y mucina, la primera es una proteína, la segunda
un hidrato de carbono, por lo tanto, es una glicoproteína
La glicoproteína otorga estabilidad a la elastina y en
condiciones normales es acidofila, en un H&E se tiñe de color
rosado, nuestro problema es que no podemos observarlo, por
lo que se realizaron todas las pruebas y métodos para
identificarla, pero solo 2 son recomendables dan un buen
diagnóstico.
Cuando uno oxida la elastomucina se vuelve basófilo, por lo
que tiene afinidad por colorantes básicos, más básicos que su
pH La elastina está formada por muchos enlaces de disulfuro,
que son los que se afectan por la oxidación, para llegar a una
estructura que sea más a fin con los colorantes que vamos a
utilizar, se debe modificar esta estructura
Se modifica a través de la oxidación, por ejemplo, con KMNO4,
yoduro de sodio o lugol, lo que ocurre que se transforma en
un OSO3-, una estructura anionica.
Si la proteína antes era acidofila con características de carga
positiva, se cambia a una carga negativa producto de la
oxidación, se crean los derivados sulfonicos y crea grupo
altamente basófilos.
La orceina es un colorante natural, tiñendo con la orceina, tiño
las fibras elásticas, pero no es muy específica para las fibras
elásticas, estas se diferencian por su forma, pero presentan el
mismo color que las otras estructuras.
técnica carece de contraste, el único que se le puede hacer es
teñir los núcleos de color azul, de manera de tener una mejor
visualización de la técnica
la técnica de Verhoeff es mas especifica ya que solo marca
las fibras elásticas, en cambio la orceina es mas sensible, ya
que permite observar fibras maduras e inmaduras.
La orceina tiñe de rojo las fibras elásticas
Verhoeff tiñe de negro las fibras elásticas maduras
Fijación: Formol neutro 10%, alfac, etc.
Tejido a utilizar: piel, pulmón y tráquea
Soluciones: Orceina: (Tanzer)
▪ Orceina: 1 g
▪ Alcohol 70%: 100 ml
▪ Ácido Clorhídrico concentrado. (d: 1,19): 1 g
▪ Hematoxilina: (ver colorantes nucleares).
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar hasta Alcohol 70°.
2. Teñir durante 30 minutos a 2 hrs. en solución de
Orceina, a temperatura ambiente, o durante 15
minutos a 37°C.
3. Lavar en alcohol al 70%. Observar al microscopio.
Diferenciar en alcohol clorhídrico al 1%. (solo si es
necesario).
4. Lavar abundante en agua destilada 5 minutos.
5. Teñir nuclear con Hematoxilina 5 o 10 minutos.
(Dependiendo de la hematoxilina que se use)
6. Lavar en agua corriente 10 a 15 minutos.
7. Deshidratar, aclarar y montar en resina sintética
Nota: Para obtener una coloración de contraste, pasar por
una solución alcohólica saturada de ácido pícrico después del
paso 6.
Resultados:
- Fibras elásticas: café rojizo
- Núcleos: azules.
Fijación: Formol al 10%, Alfac u otros fijadores
Soluciones:
a. Hematoxilina de Verhoeff
b. Solución de Cloruro Férrico al 2%
c. Solución Van Gieson
d. Tiosulfato de Sodio (Hiposulfito) al 5%
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada.
2. Teñir con Hematoxilina de Verhoeff durante 15
minutos
3. Lavar con agua destilada
4. Diferenciar con cloruro férrico al 2%. Controlar la
diferenciación al microscopio.
5. Lavar en agua corriente y luego en Agua destilada
6. Colocar el Tiosulfato de Na al 5% por 1 minuto
7. Contrastar en solución de Van Gieson por 10 seg o en
Floxina al 0.5%
8. Diferenciar en alcohol de 95%
9. Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
- Fibras Elásticas: azul oscuro o negro
- Núcleos: azul a negro Fibras
- Colágenas: rojo
- Otros elementos titulares: amarillos
La oxidación de la fibra elástica es fundamental en la técnica
de Verhoeff, ya que de esta manera pueden ser teñidas con
la hematoxilina.
El medio en que se prepara la orceina es en alcohol de 70%,
por lo que presenta alcohol y trazas de agua, de manera que
la parte hidrofilica va a identificar las fibras maduras, mientras
que la parte hidrofóbica va a identificar las fibras inmaduras.
Si lo hago solo en agua, la probabilidad de que tiña todo es
muy alto.
La técnica de orceina se puede hacer en la estufa o a
temperatura ambiente, si se hace en estufa a 37°C es
recomendable bota la solución, ya que se va concentrando
cada vez más.
En la orceina primero se tiñe la fibra y luego viene la tinción
nuclear.
El alcohol clorhídrico es el diferenciador de la orceina, se utiliza
para aclara un poco el fondo de manera de resaltar la fibra
elástica.
En Verhoeff la fijación no es tema.
El tiosulfato de sodio limpia los precipitados que quedaron, de
manera que la tinción quede más definida.
La diferenciación de Verhoeff se hace basado en un puro
campo
Las soluciones de Verhoeff se preparan en el momento de
utilizar.
La hematoxilina, cloruro férrico, van Gieson y tiosulfato se
preparan en agua destilada.
Orceina:
Enfermedades vasculares y piel/ La T° debe ser arriba de los
37°C y un error es reutilizarla para una tinción.
Se usa como solvente alcohol de 70° ya que limita la polaridad
del medio (limita las reacciones)
Verhoeff
Lo mismo que la orceina pero en este caso solo se visualizan
las fibras elásticas maduras.
Control interno
La impregnación metálica puede ser de oro, plata u osmio, la
más utilizada es la plata, por el precio, es soluble en agua, los
procedimientos son breves.
Se basa en el depósito de una sal metálica sobre algunas
estructuras específicas, la más importante son las estructuras
fibrilares.
Se deposita una plata iónica, solo disuelta en agua, en algunas
ocasiones la tenemos inestable (placa amoniacal) sobre el
tejido.
Sobre el tejido se pone un reductor, para que cambie de color
y se pegue, estos pueden ser físicos o químicos.
Físicos: luz y color, son comunes ya que al actuar sobre la plata
la reducen.
Los reductores químicos son la formalina al 20%, hidroquinona,
pirogalol. Actúan químicamente sobre la plata y la reducen.
La plata tiene afinidad por las estructuras fibrilares, pero
también por las estructuras que se transformados
químicamente en CHO (aldehídos),
estos se forman solo por oxidación de hidratos de carbono,
para que ocurra debe tener los grupos OH vecinos.
Es un mecanismo físico-químico, físico por la solución de plata
y química por la modificación de las fibras reticulares que
forman parte del tejido
Se pueden dividir en 2 grandes grupos:
- ARGENTAFIN: es cuando el tejido reduce la plata,
como la plata en un tejido de piel y la melanina
reduce la plata y queda negra. El reductor está en el
tejido es interno.
- ARGIROFILO: cuando el reductor es externo
Otra clasificación que también existe es: que se divide en:
- Física – química: es cuando modificamos los
aldehídos químicamente, ya que el tejido no tenía
aldehídos y modificamos la plata, la sobre oxidamos
e inestabilizamos (plata amoniacal)
- Histoquímica: es el equivalente al argentafin, tenemos
una estructura, o macromolécula que reduce la
plata, está dentro del tejido.
También pueden ser de:
- 1 tiempo: es cuando la solución no requiere una sobre
oxidación o inestabilidad, solo la plata diluida en agua.
- 2 tiempos: es cuando hacemos una modificación
Fijación: Formalina al 10%
Tejido a utilizar: Riñón, ganglio, hígado
Soluciones:
a. Solución de Plata Amoniacal:
A 20 ml de Nitrato de Ag al 10% agregue 10 a 15 gotas de
Hidróxido de Potasio (KOH) al 10%. Se forma un precipitado que
se disuelve agregando Amoniaco puro (28%) gota a gota,
agitando el frasco continuamente, hasta la disolución del
precipitado. Agregue cuidadosamente solución de Nitrato de
Plata al 10%, gota a gota, hasta que el precipitado que se forma
desaparezca al agitar. Duplique el volumen con agua destilada
y se filtra. .
Nota: use material de vidrio muy limpio.
b. Permanganato de Potasio (KMNO4): 1%
c. Metabisulfito de Potasio: 2%
d. Alumbre de Fierro: 2%
e. Formalina: 20%
f. Cloruro de Oro (1x500) al 02% 20 cc. de agua destilada
más 20 gotas de AuCl2 al 1%
g. Tiosulfato de Na: 2%
Procedimiento.
1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada
2. Oxidar en Permanganato de Potasio 2 minutos.
3. Lavar en agua corriente. 2 minutos. Pasar por agua
destilada
4. Decolorar en Metabisulfito de Potasio 1minuto, hasta
que el tejido blanquee.
5. Lavar en agua corriente 2 minutos. Pasar por agua
destilada
6. Sensibilizar en Alumbre de Fierro 2 minutos.
7. Lavar en agua corriente 2 minutos y en agua
destilada en dos cambios de 30 segundos c/u.
8. Impregnar en solución de Plata por 1-3 minutos.
9. Lavar en agua destilada 30 segundos.
10. Reducir en la solución de Formalina 3-5 minutos. El
corte se tornará oscuro.
 11. Lavar en agua corriente 3 minutos y en agua
destilada 30 segundos. En medula ósea, para ver su organización
12. Virar en Cloruro de Oro rápidamente dando un par Observar lamina basal
de inmersiones. Los cortes se tornan de color gris Sistema nervioso
púrpura.
13. Lavar en agua destilada
14. Reducir en Metabisulfito de Potasio 1 minuto. Lavar en
agua Destilada. No presenta control
15. Fijar en Tiosulfato de Sodio 1 minuto. Lavar en agua
Destilada.
16. Tinción de contraste si se desea,
17. Deshidratar en alcohol de 95%, (*3) ,100 (*3), xilol (*3) y
montar.
Resultados:
- Fibras reticulares: Negras.

Hay que tomar todas las precauciones para el uso de la plata:

- No se utilizan espátula metálica, ya que reduce la
plata.
- No exponer excesivamente a la luz.
- Hay que tener cuidado con el agua que se utiliza, ya
que las soluciones de plata son muy solubles en agua,
pero deben se agua destilada, ya que los metales
tienden a reaccionar con la plata y generar
precipitados.
- Si la solución no se utiliza de inmediato se deja en el
refrigerador a 4 grados en un frasco ámbar.
- Hay que utilizar plata para análisis, no la de grado
técnico.
- Tener cuidado con la luz.
Hay que oxidar el tejido, para que se formen los grupos
aldehídos.
La plata amoniacal debe está bien preparara, debe ser gota
a gota y se va agitando para eliminar el precipitado, no
pasarse del pH 11.
Primero hay que oxidar el tejido y al reducirse se produce un
precipitado negro, esto hay que sacarlo con metaldisulfito, si
es que el oxidante fue permanganato de potasio o algún otro
que deje precipitado metálicos, en cambio si se utiliza H2O2, no
es necesario, ya que el oxidante es blanco.
El alumbre de fierro es opcional, este se utiliza para sensibilizar,
tiene afinidad por las estructuras fibrilares, marca el camino
en donde debe depositarse la plata amoniacal, esta desplaza
al alumbre férrico.
Después de agregar la solución de plata no se puede pasar
por agua corriente, debe ser agua destilada.
Luego se reduce con formalina, si se desea se puede realizar
un viraje con cloruro de oro, de manera de generar un mayor
contraste.
Los tiempos deben ser respetados

Es el estudio de las células y tejidos que componen la medula
ósea, se requieren tinciones espaciales como GIEMSA ya que
esta permite observar las granulaciones de los linfocitos.
No lo observamos en frotis, en donde podemos diferenciar
claramente un tipo de célula de otra, lo estudiamos en el tejido,
por lo que hay que encontrar una célula sanguínea entre todo
el tejido que lo rodea, por lo que la tinción debe ser lo más
precisa posible para poder ubicar e identificar a la célula.
También observamos las condiciones de la medula, si esta
esta anaplásica, si se encuentra desorganizada, fibrosis, entre
otras, por lo que se utilizan tricromicos, reticulares, entre otras
para poder observarlo.
El patólogo no se va a basar solamente en la morfología de la
célula, en su forma y tamaño, ni la relación núcleo/citoplasma,
también se basa en la coloración de la célula, para poder
definirla. Estas células se encuentran en la medula ósea y
ganglios y órganos que tienen gran centro germinales con
linfocitos y elementos de defensa como amígdala, apéndice
Tejido hematopoyético
- Muestras de medula ósea, linfonodos, partes del
estómago, etc
- Se deben de usar colorantes neutros (Mezcla de
colorantes catiónicos y aniónicos que actúan en base
a la metacromasia).
Médula ósea:
- Elementos estromales: Fibroblastos, adipocitos,
células fibroreticulares, vasos sanguíneos, fibras
nerviosas, MEC.
- Médula roja: Células hematopoyéticas
- Medula amarilla: Tejido adiposo.
También se realiza IHC, para determinar la célula clonada que
da origen a la patología.
Se basa en la metacromasia, que consta en colorantes
básicos que varían al tomar contacto con el tejido y ocurre
cuando se una <determinado sustratos de este (cualquier
sustancia que contenga polianiones), en donde hay un cambio
en la absorción de luz.
Se deben formar agregados dimericos y poliméricos, que
proyectan otro color
Se recomienda NO pasar por alcohol, ya que quitaría todo el
efecto de metacromasia, por ende, es recomendable usar un
medio acuoso.
Otro factor que influye es la distancia, donde el colorante
actúa por polimerización, formando puentes de hidrogeno y
las moléculas se van uniendo una a una.
Si el auxocromo causa una absorción del cromóforo hacia
longitudes de onda mayores se denomina batocrómico.
Si el auxocromo causa una absorción del cromóforo hacia
longitudes de onda menores se denomina hipsocrómico
- Concentración del colorante (mayor concentración
favorece),
- T° (baja T° favorece),
- pH (bajo pH favorece),
- disolvente acuoso,
- alineamiento de moléculas del colorante
(hidrofóbicas e hidrofílicos).
Tener en consideración los factores que intervienen en
tricromicos y reticulares y tomar las precauciones en cada
caso.
- Aplicaciones clínicas: Estudios de desviación celular,
fibrosis, necrosis por quimioterapia (metástasis),
granulomas (TBC, infecciones fúngicas), depósitos de
hierro (hemosiderina).
- Descalificantes: EDTA, Ana morse (citrato de sodio y
ácido fórmico), aunque este último es un método
antiguo de descalcificación que es muy poco usado
actualmente.
Para las células fibroreticulares se puede usar la técnica de
gomori (Imp. argéntica), por sospecha de una patología, ya
que la medula es muy organizada.
- Giemsa (elementos celulares, gránulos),
- H/E (visión general),
- Tricromicos (presencia de fibrosis),
- Reticulares (organización de la medula ósea)
- Azul de perls (depósitos de hierro: Hemosiderina).
Colorantes neutros:
- Panóptico (Pasos sucesivos): May Grunwald, por
ejemplo
- Pancrómico: (Paso de un solo baño): Wright, Giemsa o
Romanowsky.
METODO DE GIEMSA
Fijador: formol 10%
Soluciones: giemsa al 2% en agua destilada
Procedimiento:
 1. Desparafinar e hidratar cortes hasta agua destilada El moco se debe dispersar antes de la tinción por DTT-
2. Colocar en solución giemsa 2% por 30 seg TA Carbowax.
3. Lavar en agua corriente Su fijación puede ser con: Metanol, etanol al 95% o liquido de
4. Deshidratar rápidamente, aclarar y montar con Carnoy.
resina Tinción de PAP; Se tiñe con colorantes ácidos. [Orange G +
Nota: si se desea conservar metacromasia, el tejido no debe Eosina + Verde luz con PTA + Hx de Mayer].
deshidratarse, se seca con papel filtro Métodos enzimáticos para leucocitos; métodos histoquímicos
El giemsa es un colorante muy versátil, es una mezcla de en frotis y médula ósea
colorante, colorante neutro, ya que tiene una parte acida y Fosfatasa alcalina: método más específico de estudio para las
otra básica y ambas son activas. células plasmáticas en cuanto a su mecánica enzimática.
Es giemsa es una mezcla de colorantes que incluye un
colorante ácido y 2 básicos metacromáticos, generando una
tinción diferenciada.
Al ser una mezcla de colorante sirve para todo, el giemsa
reconoce parásitos, quiste diatidico en pulmón o hígado
humano se ve con mucha claridad
Sirve para identificar todo tipo de gusanos, sus estructuras.
El giemsa para dar un bien diagnostico depende del ojo del
observador
Giemsa: azul A + azul B + eosina

Toma y recopilación de la muestra para ser procesada y las

células pueden estar suspendidas de manera natural o
artificialmente.
Usos comunes: Hematología, ginecología, cepillados y
aspirados bronquiales, etc
Extendidos sanguíneos: Se dejan secando al aire libre en donde
la gota de sangre debe ser extendida (si la muestra no se
ocupara de inmediato, se aplican anticoagulantes).
Se fija con etanol para obtener el efecto metacromático
Método de sedimentación: No muy usado. Las células
suspendidas en cualquier fluido menos viscoso que el plasma
se hundirá y se unirá al portaobjetos. (Como el LCR), es un
método muy lento.
TINCIÓN ROMANOWSKY: Tinción neutra ya que tiene una parte
aniónica y catiónica, [Azul de metileno policromado; en donde
cualquiera de este tipo será capaz de formar una sal + Eosina]
que es utilizado para frotis sanguíneo como base de otros
colorantes como Wright, Giemsa o Leishman
TINCIÓN GIEMSA: Es de tipo Romanowsky (tiene derivados de
azul de metileno + eosina) en donde es Azur A + Azur B +
Eosina. Se fija con metanol y se usa con frecuencia en
hematología y citología exfoliativa. Con calor se puede
acelerar el proceso.
TINCION WRIGHT: Tipo Romanowsky, [Azur B + Eosina Y]. Estará
disuelto en metanol.
TINCIÓN DE LEISHMAN: Su uso es para diferenciar e identificar
leucocitos, parásitos de la Malaria y triposomas. [Azur A +
Eosina B].
El extendido citológico es la recolección y preservación celular.
Se usa un medio de transporte llamado Sacomano. [Por ej el
PAP]. Las células son recogidas con una espátula, se untan en
el portaobjetos y se fijan o se inmersa en el medio de soporte.
 Métodos de estudio de microorganismos
Diferenciar bacterias gram positivas y gram negativas y su
forma de organización.
Ambas bacterias difieren en la composición de su capa de
peptidoglucano, las positivas presentan una capa gruesa que
resiste la decoloración y retienen el cristal violeta, en cambio
las negativas, presentan una capa delgada la cual no resiste
la decoloración, por lo tanto pierde el cristal violeta y son
teñidas posteriormente con safranina.
Fijación: formalina al 10%
Soluciones
a. Cristal violeta
- Cristal violeta CI42555: 2 gr
- Alcohol de 95%: 20 ml
b. Oxalato de amonio
- Oxalato de amonio: 800 mg
- Agua destilada: 80 ml
- Cristal violeta (solución de trabajo): mezclar solución
ayb
- La solución dura de 2 a 3 años
c. Yodo de Weigert
- Sol de yoduro de potasio: 2 gr
- Yodo: 1gr
- Agua destilada: 100 ml
d. Safranina al 0,5%
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
2. Colocar 30 seg en solución de trabajo (en lamina)
3. Lavar brevemente en agua destilada. Secar con
papel filtro
4. Colocar 2 min en solución de yodo de Weigert
5. Decolorar con alcohol-acetona 10-15 seg (hasta que
salga el color) controlar que no se pierda la
coloración de algunas bacterias
6. Lavar en agua y luego en agua destilada
7. Tinción de contraste con safranina por 15-30 seg
8. Deshidratar (10-15 seg) por goteo, con acetona
9. Tratar los cortes con una mezcla de acetona y xilol,
seguido de 2 cambios de xilol
10. Montar en resina sintética
Resultados:
- Bacterias Gram+: azul negro
- Núcleos: rojo oscuro
- Bacterias Gram-: rojo
- Citoplasma: rosado
- Nucléolos de hígado: azul oscuro
La diferencian es crucial, ya que si me paso del tiempo puedo
diferenciar todo.
Hay que tener muy afinado el ojo para poder reconocerlas
entre las células, ya que estas también se terminan tiñendo
con safranina.
Para bacterias es necesario el control positivo, para verificar y
validar la técnica.
Mediante la impregnación de plato reconocer hongos en los
tejidos.
Se deben oxidar la pared de los hongos, esto se hace con
ácido crómico en lugar de permanganato de potasio, ya que
la pared del hongo esta muy poco expuesta, entonces de
utilizo permanganato de potasio se me va a oxidar todo el
tejido y no solo la pared del hongo.
En sus primeros 2 pasos es igual a gomori, se necesita un
oxidante y un decolorante, pero luego viene el complejo de
metenamina de plata, la cual actúa como un buffer para la
plata.
La reducción se hace con calor, en la estufa a 56-58°C
También se deben tener en cuenta las recomendaciones para
el uso de la plata.
Fijación: formol 10%
Soluciones:
a. Acido crómico al 5%
b. Metalbisulfito de sodio al 1%
c. Solución de cloruro de oro al 0,2%
d. Tiosulfato de sodio al 5%
e. Verde luz al 1% en ácido acético al 0,1%
f. Ácido acético al 0,1%
g. Solución de metanamina de plata
- Hexamethylenetetramine 3%: 50 ml
- Nitrato de plata al 5%: 25 ml
- Bórax a saturación: 5ml (no debe estar precipitado)
Preparación: a 50 ml de solución hexamethylenetetramina
agregar 25 ml de nitrato de plata, luego 5 ml de bórax
(previamente entibiar para que no esté precipitado). Esta
solución debe ser preparada en el momento de usar.
Como todas las técnicas de plata, se debe usar material limpio.
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
2. Colocar los cortes a oxidar con ácido crómico, por 1
hr a TA n oscuridad
3. Lavar bien con agua y luego pasar a agua destilada
4. Retirar el exceso de ácido crómico colocando los
cortes por 1 min en una solución de metabisulfito de
sodio
5. Lavar bien en agua corriente
6. Pasar por tres cambios de agua destilada
7. Calentar solución de trabajo como sigue:
A baño maría: calentar la solución de metanamina
de plata hasta que este a aproximadamente 56-65°C
(tomar temperatura con termómetro)
Colocar los cortes en la solución así calentada,
seleccionar potencia 40W en microondas y calentar
por 1 min. Este procedimiento puede ser también en
estufa a 60°C, dejar los cortes durante media hora
hasta controlando al microscopio
8. Dejar reposar hasta que los cortes estén e un color
café (controlar al microscopio)
9. Colocar los cortes en agua destilada tibio por 3
cambios
10. Pasar por solución de cloruro de oro rápidamente,
controlando en microscopio hasta que las hifas de
los hongos tomen una coloración negra
11. Lavar con agua destilada, por 2 cambios
12. Colocar en solucion de tiosulfato de sodio 5% por 1
min
13. Lavar varias veces con agua destilada
14. Deshidratar, aclarar y montar los cortes
Nota: si quiere contrastar andes del paso 15
- Colocar los cortes en solución de ácido acético al 0,1%
por 30 seg
- Pasar por verde luz 0,2% por 30 seg
- Retirar el exceso de coloración con ácido acético al
0,1%
- Continuar con deshidratación
El contraste se realiza con verde luz para destacar la tinción
de los hongos.
Pasos críticos:
- Oxidación, sin ella no se generan aldehídos y no se
pueden identificar los hongos
- Blanqueamiento, siempre que se utilice
permanganato o acido crómico, si se utiliza un
oxidante blanco no es necesario.
- Uso de la metenamina.
Condiciones ideales:
- Requiere control positivo
- Recomendaciones para el uso de la plata
- Mecanismo de acción de la metenamina
Recomendaciones para tinciones de plata:
- Preparación de la plata en agua
- Respeto por la temperatura, tiempo
- Conservación del tejido
La metenamina es una mezcla entre amoniaco y formalina.
La metenamina de plata actúa como un buffer para la plata,
le da estabilidad, ya que tiene 2 componentes que actúan
sobre la plata, el amoniaco que la oxida y la formalina que la
reduce, entre los 2 se inhiben y forma una molécula que
reacciona con la plata, pero que no genera cambios en ella,
es decir la estabiliza.
La mezcla además tiene bórax o tetraborato de sodio, este es
un oxidante, es una sal, la cual oxida.
Se forma la mezcla de metenamina con plata y sobre esta se
agrega bórax y esta mezcla toma contacto con el tejido para
impregnar los hongos.
La mezcla de la metenamina con la plata y el bórax genera
lo mismo que la plata amoniacal, es decir, plata oxidada.
Control positivo, este es obligado, no podemos hacer la técnica
si no tenemos una lamina con hongos que permita validarla
Técnica para la demostración y diferenciación de bacterias y
parásitos acido-alcohol resistentes.
Utiliza principalmente carbol fucsina y fenol
El fenol tiene la capacidad de disolver el material lipídico de las
paredes y así permitir el ingreso del colorante carbol fucsina,
este queda impregnado en las paredes y resiste a la posterior
decoloración de alcohol.-acido
Reactivos
- Solución de carbol fucsina
- Alcohol acido 1%
- Solución de azul de metileno.
Procedimiento:
1. Aplicar carbol fucsina durante 1 hora a temperatura
ambiente.
2. Lavar
3. Diferenciar con alcohol clorhídrico 1%
4. Lavar
5. Contrastar con azul de metileno
Resultados:
- Bacilos acido-alcohol resistentes: rojos, rosado
- Fondo azul
 4. Lavar bien y rápidamente en agua caliente para
T° ambiente y contraste detener la reacción
5. Deshidratar y aclarar a través de alcohol de 95%,
alcohol absoluto y xilol, 2 cambios de cada uno, 2 min
6. Montar
Control positivo Resultados:
- Fondo: de amarillo a color canela
- Espiroquetas y otros microorganismos: azul

Modificando el pH de la solución de plata se puede identificar Correcta preparación y pH del agua acida.
un microorganismo en el estómago. Orden en la solución reveladora, se debe respetar el orden de
Se necesita de agua acida, con esta se preparan todas las manera que la plata no reaccione con la hidroquinona
soluciones. inmediatamente.
Es una técnica para identificar espiroquetas Hay que estar mirando y muy atento durante el revelado, hay
que ver como va cambiando de color, una vez que se obtenga
el color dorado, la reacción debe detenerse.
Fijación: formalina neutra al 10% La correcta preparación de las soluciones es fundamental, se
Secciones: 6 micrones debe respetar los tiempo para el resultado sea el esperado.
Soluciones La mezcla debe ser preparada en la proporción definida: 9gr
a. Solución de ácido cítrico al 1% de nitrato de plata, 22,5 gramos de gelatina al 5% y 12 ml de
- Ácido cítrico: 1 gr hidroquinona.
- Agua destilada: 100 ml La temperatura de la estufa y el baño deben ser las
b. Solución de agua acidulada adecuadas.
- Agua bidestilada: 1000ml
- Agregar suficiente cantidad de solución de ácido
cítrico al 1% hasta alcanzar un pH 4.0 Control positivo
c. Solución de impregnación de plata al 1%
- Nitrato de plata: 2 gr
- Agua acidulada: 100 ml
- Colocar el frasco en baño flotante a 54°C
d. Solución de gelatina al 5%
- Gelatina: 5gr
- Agua acidulada: 10 ml cómo es para identificar BAAR, se debe ocupar el fenol.
- Colocar el frasco en el baño de flotación a 54°C El fenol tiene la capacidad de disolver el material lipídico de las
e. Solución hidroquinona al 0,15% paredes y así permitir el ingreso del colorante
- Hidroquinona: 0,15g
- Agua acidulada: 100 ml
f. Solución reveladora
Fijación: formalina o cualquier tejido bien fijado
- Solución de nitrato de plata al 2%: 1,5 ml
Soluciones:
- Solución de gelatina al 5%: 3,75ml
a. Carbol fucsina
- Solución de hidroquinona al 0,15%: 2 ml
- Fucsina básica: 1gr
- Antes de usar combinar las soluciones en un frasco
- Alcohol absoluto: 10 ml
pequeño en el orden indicado. Mezclar bien la
- Agua fenicada al 5%: 90 ml
solución de nitrato de plata y la solución de gelatina,
- Dura años (filtrar antes de usar)
antes de agregar la solución de hidroquinona.
b. Alcohol acido
Procedimiento:
- Alcohol clorhídrico 1% o 2 cc de ácido clorhídrico más
1. Desparafinar e hidratar hasta llegar al agua
100 ml de alcohol absoluto
destilada
c. Azul de metileno al 1%
2. Impregnar con la solución de nitrato de plata al 1%
Procedimiento:
durante 30 min
1. Desparafinar e hidratas hasta el agua destilada
3. Colocar las láminas en la solución reveladora hasta
2. La tinción con carbol fucsina (sol a) puede realizarse
que se coloquen de color marrón amarillento.
tiñendo sobre la lámina por 30 a 60 min
 3. Lavar en agua corriente
4. Diferenciar en alcohol clorhídrico (sol b) hasta que no
se desprenda colorante (20 seg a varios minutos)
5. Lavar en agua corriente 2-3 min
6. Tinción de contraste con azul de metileno al 1% por
30 seg a RT
7. Lavar en agua corriente, secar el corte
8. Dejar secar al aire, xilol y montar en resina
Resultados:
- Bacilos alchol.-acido resistente: rojos
- Nucleos: azules

Calor y uso del fenol

Control positivo

El sistema nervioso es un conjunto de células especializadas en
la conducción de señales eléctricas y está formado por
neuronas y células gliales.
Se divide en:
- Central
- Periférico
- Autónomo
Esta formado por neuronas, células gliales, meninges y vasos
sanguíneos.
Las muestras del sistema nervioso central son las más difíciles
de obtener, ya que las biopsias de este tipo son muy
complejas.
Las técnicas toman mucho tiempo en realizarse, la
preparación de reactivos es muy complicada, los
procedimientos deben ser muy controlados.
En los demás procedimientos uno puede no respetar
rigurosamente el tiempo, el resultado saldrá igual, se pueden
hacer modificaciones forzadas, en el SN es más sensible, todos
los factores que se aplican son mucho más complejos.
El tejido nervioso es de extremo cuidado, es friable, es muy
frágil.
Las neuronas son la célula principal son las encargadas de
trasmitir la información, realizan la sinapsis. Presenta soma,
núcleos, árbol dendrítico y axón.
Las gliales, son las células de sostén mecánico, metabólico y
protección de las neuronas, entre ellas se encuentran:
- Astrocitos
- Oligodendrocitos
- Células ependimales
- Microglias
Al entramado nervioso se le conoce como neuropilo.
Las meninges recubren el SNC, con 3 capas protectoras,
duramadre, aracnoides y piamadre
Los astrocitos son las células mas numerosas de la glías, tienen
forma estrellada irradiada de su soma células, solo están
presentes en el SNC.
Se encargan del soporte estructural, soporte metabólico de
neuronas y algunas presentan pies vasculares.
Los oligodendrocitos son mas pequeños y con menos
proyecciones, se localizan en todo el SNC
Su función es producir y conservar vainas de mielina en las
neuronas del SNC.
Las células de Schwann se localizan solo en el SNP, crea vainas
de mielina en un segmento único de un axón
Las microglías están diseminadas por todo el SNC, son células
pequeñas u oscuras, de citoplasma escaso y núcleo oval a
triangular.
Su función es fagocitar los desechos y estructuras lesionadas
en el SNC.
Con H&E sus núcleos son oscuros y alargados, en contraste
con los núcleos redondos de otras células gliales.
Las células ependimales son células de tipo epitelial cilíndrico
cuboidea, revisten a los ventrículos cerebrales y al conducto
central de la medula espinal, en algunas regiones estas células
son ciliadas, lo que facilita el movimiento del LCR
Dentro del medio ambiente del SN encontramos
neurofilamento, sinatptofisina, enolasa neuronoespecifica, y
GFAP.
La S-100 es del SNP, se puede encontrar en todo tejido
originado del exodermo.
Es importante reconocer las células del sistema nervioso,
como también su ambiente.
- Extracción del cerebro, a veces puede incluir la
medula espinal
- Fijación debe ser inmediata luego de la extracción
- Corte y macroscopia para buscar anomalías
- Procesamiento de tejido
- Tinción H&E y microscopia
- IHQ de ser necesario
La fijación para sistema nervioso lleva mucho tiempo, debido
a su alto contenido lipídico
La fijación recomendada siempre está basada en la formalina,
en tiempo superior a las 24 horas, ya que con la cantidad de
líquido que contiene el SN hace un poco más lento la fijación,
por lo que se deja más tiempo.
Hay que estar recambiando la formalina, ya que se consume
en la medida que va actuando
Los formoles unidos a cationes permiten conservar todas las
estructuras, ya que los fosfolípidos son de carácter acido al
igual de los fosfolípidos estos son muy bien conservados y
rescatados por el catión metálico, como por ejemplo el formol
zinc o formal calcio.
Los fosfolípidos son de carácter acido, por lo que son bien
conservado por el catión metálico que se asocia a la formalina
La formalina forma sus puentes de metileno y los cationes se
hacen cargo de las estructuras acidas que contiene el tejido.
El cerebro debe colgarse desde el polígono de Willis, no debe
tocar las paredes del recipiente, ya que puede deformarse y
se recomienda cortarlo en rebanadas para que la fijación sea
más rápida y el fijador debe ser 20 veces el volumen de la
muestra
Si se le agrega NaCl al fijador el cerebro flota.
No se pone con pinzas para que no se oxide ni se desgarre
La medula espinal debe fijarse estirada, por lo que se le pone
un peso para que quede estirada.
Al ser tejido frágil, lo recomendable es comenzar por el alcohol
de más baja graduación, de manera de o dañar el tejido, los
cambios entre cada alcohol no deben ser bruscos, por lo que
de ser gradual.
Ejemplo: alcohol 30%, alcohol 50%, alcohol 70%, alcohol 95%,
alcohol 100%, xilol y parafina.
Se debe tener en consideración las recomendaciones
generales para el procesamiento de tejido, es decir, no mas de
3 horas en alcohol de 100% y 3 horas en xilol.
Los cortes de sistema nervioso nunca son menores a 10
micrones.
Debido a la poca densidad celular del sistema nervioso, y la
gran distancia entre una célula y otra debemos realizar cortes
mas gruesos para poder observar a las células.
Pueden utilizarse tanto colorantes, como impregnaciones y
estudios inmunohistoquímicos
Con H&E no se ven las dendritas y axones, se pierden, tampoco
se ve el neurofilamento.
La IHC es el gold estándar para sistema nervioso
Los métodos de estudio pueden ser con impregnación
metálica o no impregnación., es decir colorantes. Ambas
tienen sus diferencias y pequeñas ventajas, entonces en
algunos casos se utiliza uno y en otros el otro.
Las impregnaciones metálicas nos permiten hacer las
mejores imágenes, nos permite ver las prolongaciones y todos
los detalles, en cambio la IHC nos permite ver las
prolongaciones y con mayor detalle las alteraciones a nivel de
las macromoléculas
Célula o estructura Técnica
Cuerpos de Nissl: Violeta de cresilo
Axones y procesos Palmgren, Preparación de Golgi
neuronales:
Mielina Azul rápido de luxol
Células ependimales Hematoxilina-eosina
Astrocitos IHC: GFAP, S-100, aB-cristalina,
glutamina sintetasa
Oligodendrocitos Hematoxilina-eosina, violeta de
cresilo / IHC: Olig2
Microglias IHC: CD68, HAM-56, MHCII, HLA-DR-II
Cuando hago H&E no se diferencian, no se visualizan las
prolongaciones, las dendritas y los axones se pierden, no se ve
el componente intermedio característico del SN, el
neurofilamento. no se ven las prolongaciones, ya que aparte
de ser muy extensas el SN tiene una densidad células baja,
entre una célula y otra hay una gran distancia la cual está
cubierta por neurofilamento, GFAP, sinatptofisina, enolasa
neuronoespecifica.
Dentro del medioambiente del SN hay neurofilamento y GFAP
(proteína acida fibrilar glial). La GFAP se identifica con
inmunohistoquímica. Es importante reconocer las células que
conforman el SN, pero también es importante reconocer el
medioambiente.
Clasificación según mecanismo general de acción:
- Métodos impregnantes: impregnación metálica
- Métodos no impregnantes: colorantes
Clasificación según estructura de estudio
- Métodos para neuronas y neurofibrillas
- Método para células de la glía:
- Métodos para terminaciones nerviosas
- Métodos para mielina
- Métodos para estructuras citológicas: está orientado
al corpúsculo de Nissl
Las autopsias en las enfermedades neurodegenerativas no
sirven para el diagnóstico, sin embargo, ayuda a la
investigación y orientación de los familiares, ya que la mayoría
son de orden genético
Ayuda al diagnóstico de enfermedades como demencia
vascular, Alzheimer, FTLD
- Biopsia cerebral o medular, tener cuidado con su
manejo
- Fragmentos tumorales: cuando hay metástasis
- Necropsias: se consigue en pacientes autorizados
para esto
- Biopsias de nervio periférico, en aquellas
enfermedades en donde haya afecciones nerviosas
periféricas, que son diagnosticadas con H&E primero,
y luego S-100