INSTITUTO TECNOLOGICO DE CONKAL

ASIGNATURA: PROTOZOOLOGIA

PROFESOR: MC. GABRIEL DE JESUS AZCORRA PERERA

“DIFERENTES TÉCNICAS DE TINCIÓN UTILIZADAS EN PARASITOLOGÍA”

INTEGRANTES:
BURGOS MEX DAVID ANGEL
UICAB KANTUN ESTRELLA YAZARI
REJON ACEVEDO JAFET EMMANUEL
SUAREZ BAAS FERNANDA DEL CARMEN
CASTRO DOMINGUEZ MAURICIO ALEJANDRO

FECHA DE ENTREGA: SÁBADO 25 DE MARZO DE 2023

Índice.

INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................2
Métodos de fijación (físicos y químicos).................................................................................3
Métodos de tinción (simples, compuestas, diferenciales, positivas y negativas)........6
Métodos progresivos y regresivos...........................................................................................8
Tipos de tinción.............................................................................................................................9
Tinciones permanentes de protozoarios...............................................................................10
Preparaciones en fresco (frotis)..............................................................................................12
Métodos de montaje en laminillas y preservación (permanentes y semipermanentes)
.........................................................................................................................................................13
Bibliografía....................................................................................................................................15
INTRODUCCIÓN

En el trabajo que se presenta a continuación, se hablara acerca de las diferentes

técnicas de tinción que se usan en parasitología. Debemos que tener en cuenta
que la tinción es el hecho de teñir alguna sustancia o tejido, solo que en química
se le denomina tinción.
Se emplea en los laboratorios con el objetivo de optimizar la visión de aquello que
se observa a través de un microscopio, la tinción, de este modo, consiste en
aplicar un colorante a una sustancia o un tejido para que resulte más simple
detectarlo y analizarlo, aunque no siempre se realiza, sino que solo se hace
cuando es requerido. Se hablará acerca de los métodos de fijación, tinción.
Progresivos y regresivos, algunos tipos de tinción que existen, tinciones
permanentes de protozoarios, preparaciones en fresco (frotis), y los métodos de
montaje en laminillas y preservación.
Métodos de fijación (físicos y químicos)

La fijación es un requisito previo para el procesamiento del material clínico, como

las extensiones de sangre, los cortes de tejido, las muestras ginecológicas y se
conserva en la mayor medida posible la estructura y el estado de la muestra.
Los métodos de fijación se pueden clasificar en dos tipos: físicos y químicos.
Los fijadores físicos se basan en una congelación muy rápida del tejido o bien en
la aplicación de calor elevado. Se utilizan cuando los fijadores químicos alteran la
estructura que queremos observar, cuando necesitamos una fijación muy rápida, o
cuando el tipo de tejido y la técnica que usaremos lo requieran.
La congelación rápida es un buen método de preservación
de las características moleculares, puesto que no son
alteradas por ninguna sustancia química, es conveniente
que la congelación sea rápida ya que así se impide la
formación de grandes cristales de hielo que destrozarían la
estructura del tejido, es por ello que no debemos usar
piezas mayores a 2 mm para que no se retarde la
congelación de las zonas centrales de la pieza.
Una una congelación rápida se consigue sumergiendo la pieza en isopentano (-
170 ºC) enfriado con nitrógeno líquido (-196 ºC), o colocando la muestra sobre un
metal, el cual se sumerge parcialmente en nitrógeno líquido, en mezclas de hielo
seco y acetona (-70 ºC) o incluso en helio líquido (-268 ºC). Asimismo, cuando sea
posible, es conveniente embeber la muestra en anticongelantes, también llamados
crioprotectores. La crioprotección es recomendable, aunque no siempre es posible
ya que normalmente se emplean como agentes crioprotectores al dimetilsulfóxido,
el glicerol y la sacarosa, bien solos o mezclados en diferentes concentraciones.
Hay que tener en cuenta, sin embargo, que una vez que el tejido se haya cortado
se vuelve a descongelar y hay que protegerlo de los procesos de degradación.
La fijación por calor no es frecuente en histología, ya que
produce deterioros de los tejidos, pues su efecto es la
coagulación de proteínas y disolución de lípidos. Sin embargo,
se emplea para la observación de microorganismos, ya que
preserva la forma de éstos y sirve para su identificación. En
cuanto a la fijación química, se suele emplear el calor como
un complemento, así las muestras inmersas en un fijador se
introducen en un microondas y se llevan hasta temperaturas
de unos 55 ºC. Esta temperatura no produce artefactos y tiene
dos ventajas, la primera es que incrementa la velocidad de fijación y la segunda es
que reduce el tiempo fijación desde varias horas o días a decenas de minutos. El
uso del microondas permite que el calor sea homogéneo en toda la muestra de
forma inmediata, se cree que el incremento de la velocidad de fijación se debe
sólo al calor generado y no al efecto directo del microondas.
Los métodos químicos utilizan soluciones acuosas compuestas por moléculas
fijadoras que establecen puentes entre las moléculas del tejido, manteniéndolas
en sus lugares originales e impidiendo su degradación, debemos considerar que
los fijadores químicos afectan en mayor o menor medida al tejido, tanto física
como químicamente y los efectos físicos suelen ser retracciones o distensiones, y
la mayoría endurecen el tejido. Hay dos métodos básicos de fijación con fijadores
químicos: inmersión y perfusión. En cualquier caso, el fijador debe llegar a todas
las partes el tejido lo más rápidamente posible.
En el método de inmersión las piezas de tejido se sumergen en la solución
fijadora. En algunos casos se necesitan fijar extensiones de sangre o cortes por
congelación sin fijación previa, en estos casos siempre se fijan por inmersión en la
sustancia fijadora, cuando se fija por inmersión hay que tener en cuenta algunas
precauciones.

 Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de espesor para que el
fijador alcance el interior de la pieza antes de que ésta comience a
deteriorarse. La velocidad de penetración del fijador depende de cada
fijador y de las características del tejido. Esta velocidad nos dirá el tamaño
de la muestra, pues para fijadores lentos se recomiendan piezas de 0.2 cm
de tamaño. Esto también se ve afectado por el tipo de tejido. Por ejemplo, si
es poroso o con grandes espacios la difusión del fijador será más rápida.
 El volumen recomendado de fijador es de 10 a 20 veces superior al
volumen de la pieza.
 La osmolaridad del tejido y de la solución fijadora deben estar equilibradas.
 El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico.
 El tiempo de fijación, para un mismo tipo de muestra, depende de cada tipo
de fijador: velocidad de difusión y velocidad de fijación (la rapidez e
intensidad con la que establece puentes o coagula proteínas). Debe ser
suficiente para que la muestra quede bien fijada pero no excesivo para
evitar deterioros o alteraciones del tejido. Una agitación suave durante la
fijación ayuda a la penetración del fijador y disminuye el tiempo. En general
no se recomiendan fijaciones mayores de 24 horas, excepto en algunos
casos como el formaldehído, para el que se puede emplear una semana de
fijación.
Perfusión.
Por este procedimiento la solución fijadora se
introduce a través del sistema circulatorio por el cual
accede a todas las células del tejido gracias a la red de
capilares.
El método de fijación por perfusión es mucho más
efectivo que el de inmersión ya que la solución fijadora
llega rápidamente a escasa distancia de todas las
células de la estructura perfundida. Por tanto, la
velocidad de penetración del fijador no es una condición limitante.
Antes de introducir el fijador en el sistema de vasos sanguíneos hay que eliminar
previamente la sangre con una solución de lavado oxigenada, ya que de otra
manera su interacción con el fijador produce trombos que impedirían la fijación de
determinadas zonas del animal o del órgano. Respecto a las precauciones
mencionadas anteriormente en el método de inmersión debemos cuidar aquí
también la osmolaridad, el pH y el tiempo de fijación.
Este método de fijación por perfusión requiere conocer la presión a la que se va a
introducir la solución fijadora en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la
que posee la presión sanguínea normal en estado vivo. La presión que ejercerá la
solución fijadora se puede regular mediante bombas peristálticas o por gravedad,
es decir, variando la altura a la cual se coloca la solución fijadora respecto a la del
animal. Esto es importante porque una presión muy baja podría impedir que la
solución fijadora alcanzara todas las partes de la estructura y una presión muy alta
podría provocar roturas de los vasos sanguíneos y de la propia estructura tisular.

Métodos de tinción (simples, compuestas, diferenciales, positivas y

negativas)

 Tinción simple: Consiste en la aplicación de un solo colorante a la muestra,

esta debe ser posterior a la fijación de la misma, permitiendo la
visualización de la morfología bacteriana. Uno de los colorantes más
indicados es el azul de metileno, que actúa rápida y suavemente sobre
todas las células bacterianas y no oscurece los detalles celulares. Además,
es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras
naturales puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.
  Tinción negativa: Es un tipo de tinción simple, pero con ciertas diferencias,
ya que nos permite observar características estructurales de la bacteria
además de su morfología, se caracteriza por no necesitar fijación previa y
nos permite visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria
además de alguna otra característica estructural, como es la presencia de
cápsulas 1.
 Tinciones diferenciales: Se necesitará fijación previa generalmente por
calor, además se utilizarán dos colorantes, siendo el último el colorante de
contraste. Una de las características más importantes es que además de
visualizar la morfología nos permite observar la composición de la pared
bacteriana, su resistencia a la decoloración ácida, etc.; como sucede en la
tinción de Gram y en la tinción de Ziehl-Neelsen 1.
 

 Tinción Gram: La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más

importantes en el laboratorio bacteriológico. Su utilidad en la práctica de
referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM
1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta.
2. Se añade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol.
En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las
Gram positivas retienen el colorante.
4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias
Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram
positivas les proporciona un color violeta más intenso.
Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos:
1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo.
2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante
en el interior de la célula.
3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante
elimina la fucsina de todas las células excepto de las micro bacterias, que la
retienen debido a su superficie cérea.
4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células
previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de
Mycobacterum, aún teñidas de rojo, v las células restantes del espécimen.
 

Métodos progresivos y regresivos

En la tinción progresiva, el tejido se deja en la solución de tinción el tiempo

suficiente para alcanzar el punto final deseado, mientras que, en la tinción
regresiva, el tejido se deja deliberadamente para una sobretinción hasta que el
tinte satura todos los elementos del tejido y luego se quita la tinción.
La tinción progresiva es una técnica que permite que el tejido permanezca en la
solución de tinción el tiempo suficiente para alcanzar el punto final deseado, por lo
tanto, se necesita un control frecuente de la calidad de la tinción para determinar
la finalización de la tinción, la intensidad de la tinción está controlada por el tiempo
de inmersión.
Por ejemplo, la hematoxilina de Gill y la hematoxilina de Mayer son de naturaleza
progresiva. Para estas dos hematoxilinaciones, se utiliza comúnmente un tiempo
de tinción de 5 a 10 minutos en la tinción progresiva, generalmente, las
hematoxilinas progresivas están menos concentradas. Por lo tanto, tiñen lenta y
selectivamente la cromatina, en la tinción progresiva, la hematoxilina tiñe
principalmente la cromatina con la intensidad deseada, por lo que, no requiere
diferenciación en alcohol ácido diluido para eliminar el exceso de tinción.

Para la tinción regresiva es una técnica de tinción más rápida en la que el tejido se
tiñe deliberadamente hasta que el tinte satura todos los componentes del tejido,
luego, el tejido se elimina de la tinción de forma selectiva hasta que alcanza el
punto final correcto, el paso de decoloración se llama diferenciación, la
diferenciación se realiza para eliminar el exceso de tinciones. Por lo general, se
hace con alcohol ácido diluido
Por ejemplo, la hematoxilina de Harris es el tipo de hematoxilina de uso popular,
las hematoxilinas de Ehrlich y Delafield también se utilizan en la tinción regresiva.
las tinciones regresivas tienen una alta concentración de hematoxilina. Por lo
tanto, se difunden rápidamente por toda la célula y tiñen la cromatina y el
citoplasma, se prefiere la tinción regresiva cuando se requiere una diferenciación
muy clara de los elementos tisulares.

Tipos de tinción
Tinción Simple.
Utiliza un solo colorante.
Tinción Ácido Resistente.
Esta tinción sirve principalmente para clasificar micro bacterias y actinomicetos,
que tienen un alto contenido en lipídico y en ácidos micólicos y que no pueden ser
clasificadas por la tinción de gram.
Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con ácido mineral
reducido. En esta tinción las bacterias ácido resistentes conservan el colorante
primario color rosa o rojo, los demás microorganismos son decolorados por el
ácido y toman el color azul.
Tinción de Giensa.
La tinción de Giensa es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos,
cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad
sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las
células huéspedes. El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando
se sospeche de protozoos en la sangre para observar materias núcleos de las
células.
Tinción de Esporas.
Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.
La envuelta de la endospora es más compleja e impermeable que la envuelta de
las células vegetativas en las que se forma. Sólo se puede teñir el contenido de la
espora alterando su envuelta. La impermeabilidad de las cubiertas dificulta que las
endosporas se decoloren una vez teñidas.
El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva
débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en las células
vegetativa. Cuando se calienta la preparación también penetra las endosporas.
Tinción de Cápsula.
La cápsula bacteriana es una capa de material viscoso o mucoide. El tamaño de
estas cápsulas está influenciado por el medio en el que crece la bacteria. En
algunos casos el grosor de la cápsula es sólo una fracción del diámetro de la
célula, en otros casos la cápsula es mucho mayor que la célula.  Las cápsulas
bacterianas son importantes tanto para la bacteria como para otros organismos. A
las bacterias les proporcionan una cubierta protectora y además sirven de
reservorio de alimento almacenado.
Tinción de Flagelos o leifson.
Es una tinción para lograr observar flagelos de bacterias. Es usada en
laboratorios, pero no de rutina. Los pasos que sigue son el de usar pararosanilina
sirve como tinción principal, y ácido tánico es agregado a la solución como
mordiente.
Los componentes de la tinción son: Fucsina básica en Alcohol etilico al 95%, en
1.27%; ácido tánico en agua destilada, en 3%; Cloruro de sodio en agua destilada,
1.5%. Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del microorganismo.

Tinciones permanentes de protozoarios

Nos centraremos en las técnicas de tinción permanente para muestras fecales.
Generalmente no se recurre a la tinción permanente para el diagnóstico, porque
no son necesarios para la identificación de huevos o larvas de gusano.
Aunque siempre es bueno asegurar los diagnósticos y utilizarlo con el fin de
Identificar los oocistos de Criptosporidium, identificar de trofozoítos de protozoos,
en caso de duda, Confirmación de a especie a la que pertenecen los quistes de
protozoos, en caso de duda, entre otras cosas.
Generalmente se utilizan tres tinciones permanentes para mostrar la presencia de
protozoarios intestinales.

 Tinción de Gomori.
Partimos de muestras que han sido fijadas en formol o Bouin e incluidas en parafina.
Estas muestras se han cortado en secciones de unas 8 µm y adheridas a portaobjetos
recubiertos con gelatina.

Colágeno: verde oscuro-celeste.

Músculo: rojo.
Citoplasma: rosado.
Núcleos: negro.

Secciones de parafina de 8 µm de grosor teñidas teñidas con tricrómico de

Gomori, en oreja de rata.

 1. 2x10 min en xileno para desparafinar.

 2. 2x10 min en etanol 100º

 3. 10 min en etanol 96º

 4. 10 min en etanol 80º

 5. 10 min en etanol 50º

 6. 5 min en agua destilada.

 7. 1h en líquido de Bouin a 56-60 ºC, o 24 h a temperatura ambiente.

La solución de Bouin actúa como mordiente.

 8. Varios lavados en agua destilada hasta que desaparezca el color

amarillo.

 9. 10 min en hematoxilina de Weigert.

Si la solución es vieja puede ser necesario incrementar el tiempo de tinción.

 10. 5-10 min en agua corriente.

Si las muestras pierden su color o se tiñen débilmente, se puede volver a la
 Hematoxilina de Weigert durante 5 minutos más. Se puede comprobar la
tinción mirando por el microscopio.

 11. 15 min en solución tricrómica.

Solución tricrómica:
0.6 g cromo2R (CI 16570).
0.3 g verde luz (CI 42095).
0.8 g ácido fosfotúngstico.
1 ml ácido acético glacial.
Enrasar hasta 100 ml con agua destilada.

 12. 1 min en ácido acético al 1 %.

Este es un paso de diferenciación. Si las muestras no están bien teñidas o
no hay suficiente coloración roja en la muestra, las secciones se pueden
dejar más tiempo en la solución tricómica.

 13. 30 s en agua destilada

 14. 1 min en etanol 100º

 15. 1 min en etanol 100º

 16. 2 min en xileno

 16. 3 min en xileno

 17. Montado de las secciones

 Tinción de hematoxilina Férrica

La técnica de la hematoxilina férrica de Weigert es una combinación de tinciones

utilizados en histología que resulta útil en la identificación de fibras elásticas.
Resulta de la combinación de Orceina, Resorcinol y Fucsina.

Fibras elásticas teñidas de azul.

  Tinción de Zhiel – Neelsen Modificado

La tinción de Ziehl-Neelsen modificada es clásicamente llevada a cabo por teñir un

delgado frotis de materia fecal, fijado con metanol, con una solución de carbol-
fucsina sin diluir por lo menos 15 minutos. Después, la laminilla es enjuagada con
agua corriente y colocada en una solución de alcohol-ácido para remover el tinte y
las estructuras ácido resistentes van a resistir la decoloración. Después de un
nuevo enjuague, se tiñe con azul de metileno, el cual le dará un fondo de contraste
entre el material y las estructuras ácido-resistentes. Se realiza un último enjuague
con agua corriente y se deja secar al aire, puede ser examinada utilizando el
objetivo 10X y el objetivo de aceite de inmersión de magnificación 100X.

Preparaciones en fresco (frotis)

Los frotis en fresco para el examen microscópico directo facilitan la rápida
detección de los parásitos intestinales presentes en materia fecal, la detección de
Entamoeba histolytica de otros protozoarios puede acrecentarse
considerablemente mediante preparaciones teñidas en forma permanente.

 Agregar una alicota de la muestra sólida con un aplicador de madera

extendiéndola.
 Fijar al calor hasta que se seque.
 Agregar 3 gotas de colorante azul de metileno por 1 minuto.
 Eliminar el exceso y enjuagar con agua destilada.
 Secar al calor.
 Observar al microscopio utilizando los objetivos de menor a mayor
aumento.
 Esquematizar las observaciones.

Durante la preparación en fresco hay que procurar que no queden burbujas de

aire. Observar bacterias vivas al microscopio con el objetivo de inmersión (con una
gota de aceite de inmersión) para ello tendremos que tener en cuenta que sólo
puede utilizarse el aceite de inmersión con el objetivo de 100 aumentos, evitar que
se caliente demasiado, para no afectar a la estructura y forma normal de los
microorganismos.

Métodos de montaje en laminillas y preservación (permanentes y

semipermanentes)
Para los análisis microscópicos, los cortes de tejido teñidos, las preparaciones
ginecológicas, las muestras bacteriológicas y las extensiones de sangre se
montan normalmente con medios de montaje acuosos o no acuosos y se cubren
con un cubreobjetos si tienen que conservarse durante un periodo prolongado.
Esto permite una conservación estable y un almacenamiento prácticamente
permanente de la muestra.
Montaje en seco: En un montaje en seco, el tipo más sencillo de montar, el objeto
no es más que colocar en la diapositiva. Una hoja de cubierta se puede colocar en
la parte superior para proteger la muestra y el objetivo del microscopio y para
mantener la muestra y se presiona todavía plana. Este montaje se puede utilizar
con éxito para ver las muestras como el polen, plumas, pelos, etc también se
utiliza para examinar las partículas atrapadas en los filtros de membrana
transparente.
En fresco o montaje temporal: En un montaje húmedo, la muestra se coloca en
una gota de agua u otro líquido contenido entre la corredera y la hoja de la
cubierta por la tensión superficial. Este método se utiliza comúnmente, por
ejemplo, para ver los organismos microscópicos que crecen en el agua del
estanque o de otros medios líquidos, especialmente cuando el estudio de su
movimiento y el comportamiento. Se debe tener cuidado para eliminar las burbujas
de aire que puedan interferir con la visualización y dificultar los movimientos de los
organismos. También se utiliza para investigaciones rápidas que no se requiera un
registro permanente, así como para examinar líquidos fisiológicos como la sangre,
la orina, la saliva, el semen, y la secreción vaginal.
Montaje preparado o montaje permanente: Para la investigación patológica y
biológicas, la muestra por lo general se somete a una preparación histológica
compleja que puede involucrar el corte en secciones muy finas con un microtomo,
que se fijan a prevenir la caries, la eliminación de cualquier agua contenida en ella,
la tinción partes específicas del mismo, la limpieza para que sea transparente, e
impregnando o infiltrante con alguna sustancia sólida transparente.
Bibliografía
Cuales son los tipos de fijacion? – Respuesta Corta
Metodos de fijacion (slideshare.net)
Tinciones y cultivos para el estudio de los parásitos | Parasitología médica,
4e | AccessMedicina | McGraw Hill Medical (mhmedical.com)
MANUAL DE METODOS PARASITOLOGICOS E HISTOPATOLOGICOS EN
PISCICULTURA (fao.org)
Metodos diagnosticos en parasitología - 2. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS Se ha
descrito varios métodos para - Studocu
Examen En Fresco De Microorganismos. Preparación De Un Frotis
Bacteriano Y Tinción Simple. - Ensayos - chukyman12 (clubensayos.com)
Técnicas de diagnóstico de cryptosporidium spp. en bovinos - BM Editores
rev PED 47 No 3 2008.pdf (scielo.org.bo)