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MTODOS DE

ESTUDIO EN
HISTOLOGA
M.C.D. Ma. De Lourdes Urquizo Ruvalcaba
Esp. Patologa y Medicina Bucal

MTODOS DE ESTUDIO EN
HISTOLOGA

HISTOLOGA
Estudia la microanatoma de las clulas, los
tejidos y los rganos y correlaciona su funcin.

HISTOTECNOLOGA
Conjunto de tcnicas que se llevan acabo para
la preservacin y preparacin de los tejidos y
clulas, para su estudio con microscopio de luz
y sus variantes

MTODOS DE ESTUDIO EN
HISTOLOGA
OBJETIVOS DE LA HISTOTECNOLOGA

Preservacin optima y funcional de los diferentes


materiales tisularesy celulares que llegan al
laboratorio.

Conocer los principios de las tcnicas rutinarias y


especiales, as como sus indicaciones precisas
para el estudio de los tejidos

TCNICA HISTOLGICA

Comprende la preparacin de tejidos


para su estudio microscpico.

Se logra sometindolos a una serie de


procesos:

Obtencin del tejido a estudiar


Fijacin
Deshidratacin
Aclaramiento
Inclusin
Corte
Montaje
Observacin (Diagnstico)

TCNICA HISTOLGICA
OBTENCIN DEL TEJIDO A ESTUDIAR
BIOPSIAS

Incisional
Excisional

NECROPSIA O AUTOPSIA
CITOLOGA EXFOLIATIVA
FROTIS

TCNICA HISTOLGICA: FIJACIN

Se refiere al tratamiento del tejido con sustancias


qumicas que tienen varias finalidades:

Preservar el tejido de la putrefaccin, autolisis, etc.

Conserva la estructura morfolgica y qumica de las


clulas y tejidos al estado vivo (citoarquitectura y
ultraestructura)

Aumenta la dureza del tejido para facilitar la


preparacin de finas pelculas de ste.

Y permite realizar, posteriormente, los procedimientos


de coloracin o de identificacin que facilitan el
completo conocimiento de su constitucin ntima

TCNICA HISTOLGICA: CUALIDADES DE


UN FIJADOR

Actuar con rapidez, matando y fijando a las


clulas antes de que aparezcan autlisis,
desintegracin, etc.)

Poseer alto poder de penetracin para


asegurar la fijacin correcta hasta en las
capas profundas.

Conservar, en lo posible, los detalles


estructurales que presentaban in vivo

TCNICA HISTOLGICA: CUALIDADES DE


UN FIJADOR

Permitir o favorecer el empleo de los


procedimientos necesarios para su
observacin ulterior (ejecucin de cortes,
coloracin, etc.)

No provocar o impedir la produccin de


estructuras artificiales

No retraer excesivamente los tejidos ni


volverlos friables o quebradizos.

TCNICA HISTOLGICA:
Cmo actan los fijadores?

Vara con la composicin o naturaleza


Coagulando las protenas sin combinarse con
ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor)

Formando combinaciones qumicas con las


sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales), o
reducindose en contacto con las mismas y
originando un precipitado sumamente fino
(cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).

La mayor parte de los fijadores actan como


oxidantes, favorece la coloracin ulterior de los
tejidos.

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES


QUMICOS

Son los ms utilizados


Pueden ser:
Fijadores simples

constituidos por una sola sustancia qumica

Fijadores compuestos

cuando varias fijadores simples intervienen


en su constitucin
racionalmente elegidos con el fin de completar
la accin de cada uno de ellos o atenuar sus
efectos

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES


QUMICOS
FIJADORES SIMPLES
Formol al 10%

es el ms usado.
Reacciona con los grupos aminos de las protenas, formando
enlaces transversales y conservando las estructuras de la
clula.
Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se
disponga de un fijador especial, principalmente cuando se
trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos
topogrficos.

Alcohol etlico absoluto o de 96%

Se usa generalmente en microqumica.


Preserva el glucgeno.
Causa distorsin del detalle nuclear y comprime el
citoplasma.

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES


QUMICOS
FIJADORES SIMPLES
Alcohol metlico.

Se emplea con frecuencia para fijar frotis


desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo,
lquidos de puncin, etc.)

cido smico al 1 2%
Es poco penetrante pero enrgico, conserva muy
bien estructuras celulares.

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES


QUMICOS
FIJADORES SIMPLES
Bicromato de potasio al 3-5%.

Fija el citoplasma y no se precipita.


Nunca se usa solo.
Despus de la fijacin loes especmenes
deben ser lavados exhaustivamente para
remover el oxido que se forma

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES


QUMICOS
FIJADORES COMPUESTOS
Lquido de Fleming, mezcla cromoosmio-actica.
Lquido de Zenker, mezcla bicromatosublimado-actica.
Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
Lquido de Bouin, mezcla picro-formosactica.
Liquido de Duboscq-Brasil, o
Bouinalcohlico

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES


FSICOS

Desecacin.
Calor seco.

Coagulacin de las protenas


No es buena ya que las clulas se destruyen.

Calor hmedo.
Fro y Congelacin .

Se congela el tejido con dixido de carbono o N


liquido
Es mejor que el calor pero se pueden formar
cristales.

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
I. FIJACIN

Fijacin en formol al 10% (1 parte


de formol y 9 partes de agua
destilada) por lo menos durante 6
hs.

II. DESCRIPCIN
MACROSCPICA Y CORTE

Se describe forma, color, textura,


superficie, consistencia al corte y se
mide.

Se le da el tamao deseado a la
pieza

Enjuaga durante 15 min.

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
III. DESHIDRATACIN

Debido a que una gran parte del tejido est constituida


por agua, se aplica una serie gradual de soluciones
acuosas de menor a mayor de agente deshidratante.
Se debe deshidratar el tejido, ya que la parafina nos es
hidrosoluble

Alcohol 70, 1h30'.


Alcohol 96, 1h30'.
Alcohol 100 (l), 1h30'.
Alcohol 100 (ll), 1h30'.
Toluol O Xilol , entre 1h30' y 3hs. (Aclaramiento)

NOTA: si se colocara el tejido en una solucin al 100% de


alcohol inmediatamente, el agua saldra muy rpido del tejido y
se deformara.

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
ACLARAMIENTO

Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solucin de


una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como
con el medio de inclusin (PARAFINA) a utilizar.

Se sustituye el alcohol por un lquido intermediario


normalmente el hidrocarburo bencnico (xilol, benceno,
toluol).

Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna


transparente o claro en el xileno, esto se debe a que
cambia su ndice de refraccin.

Nota: El alcohol y el xileno disuelven los lpidos de la


clula y por lo cual al extraerse tambin se extraen
las grasas y los lpidos de la clula.

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
IV. INCLUSIN

A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos


para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser
incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme.
gelatina y parafina.

El objeto de la inclusin es:


Distinguir entre s las clulas superpuestas en un tejido y la
matriz extracelular.
Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y
corte.
La parafina penetra en los vasos, en los espacios
intercelulares y en el interior de las clulas embebiendo el
tejido y haciendo ms fcil la obtencin de cortes en el
microtomo.

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
IV. INCLUSIN

Infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusin


en estado lquido al tejido, que disuelve el medio de
aclaramiento y penetra en el tejido.
1.Secado de la muestra con gasa.
2) Parafina 56 (l), 1h30'.
3) Parafina 56 (ll), 1h30'.
4) Formacin de la barra.
5) 30' de frezzer.
6) Fractura del taco

NOTA: Debido al calor, el xilol se evapora y los espacios

anteriormente ocupados por el son ahora ocupados por la


parafina

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
V. CORTE

El taco ahora se puede cortar en secciones lo


suficientemente delgadas como para permitir el
paso de la luz.
La mayor parte de los preparados para
microscopia ptica tienen un grosor entre 3 a 10
micrmetros (5)
MICROTOMO.

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
VI. COLORACIN Y MONTAJE

Los cortes todava no son aptos para su examen


con el microscopio, puesto que los tejidos se
hallan infiltrados en parafina y carecen de color.

Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que


se les ha agregado una pequea cantidad de
Albmina, la cual acta como adhesivo.

La parafina se elimina en un solvente orgnico, de


nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra se
rehidrata hacindola pasar por una serie de
graduaciones decrecientes de alcohol etlico hasta
llegar a una solucin 100% y agua.

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
VI. COLORACIN Y MONTAJE

Ya rehidratado se TIE EL TEJIDO.


Los colorantes ms utilizados son la
HEMATOXILINA Y la EOSINA.
Una vez teido, se deshidrata de nuevo, de tal
manera que pueda fijarse de modo permanente el
CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el
MONTAJE (por ejemplo una gota de Blsamo de
Canad o similar).

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
VI. COLORACIN Y MONTAJE

1.Xilol o toluol(I), 15' en estufa.


2. Xilol o toluol(II), 2'.
3. Alcohol 100, 30".
4. Alcohol 96, 30".
5. Alcohol 70, 30".
6. Alcohol 50, 30".
7.Agua destilada, 30".
8. Hematoxilina, 130".
9. Agua corriente, 2.
10. Alcohol 50, 15".
11. Eosina, 30".
12. Alcohol 96, 10".
13. Alcohol 100, 10".
14. Xilol, 1 por lo menos.
15. Montaje con Blsamo de Canad sinttico.

VI. COLORACIN Y
MONTAJE
Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:
Colorantes que diferencian los componentes
cidos y bsicos de la clula.
Colorantes especializados que distinguen los
componentes fibrosos de la matriz
extracelular.
Sales metlicas que se precipitan en los
tejidos y forman depsitos de metales con
ellos

HEMATOXILINA Y EOSINA

Tincin PAS
(cido perydico-reactivo de
Schiff)

Es uno de los mtodos qumicos ms empleados en histologa.

Tie carbohidratos y macromolculas ricas en


carbohidratos.

Se usa para detectar :

glucgeno en las clulas

Moco en diversos tipos celulares

Membrana basal subyacente a los epitelios

Fibras reticulares del tejido conectivo

Los anillos de las hexosas (carbohidratos) poseen carbonos


adyacentes, cada uno con un grupo hidroxilo

El ac, perydico rompe la unin entre estos tomos de carbono


adyacentes y forma grupos aldehdo.

Estos aldehdos reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un


color prpura intenso (rojo luminoso)

Tincin PAS
(cido perydico-reactivo de
Schiff)

Tincin PAS
(cido perydico-reactivo de
Schiff)

Tricromico de Masson

Es una tcnica para la coloracin de fibras


colgenas y elsticas. Se observan tres colores
distintos:

Ncleos: Negro

Msculo, citoplasma y queratina: rojo

Colgeno: azul o verde

COLORACION DE WRIGHT

TEJIDO CONECTIVO LQUIDO:


SANGRE

NEGRO SUDN
Los colorantes Sudn tien fuertemente los
TRIGLICRIDOS, como por ejemplo:
Rojo de sudn o sudn III, en la coloracin
de clulas adiposas.
El negro de sudn o sudn IV, se emplea en
la coloracin de las vainas mielnicas de las
fibras nerviosas compuestas por
lipoprotenas.

TINCION ARGNTICA

TCNICA HISTOLGICA:
INMUNICITOQUMICA

INMUNICITOQUMIC
A DIRECTA

INMUNICITOQUMI
CA INDIRECTA

AUTORRADIOGRAFI
A

CRIOFRACTURA

CRIOFRACTURA

TCNICA HISTOLGICA
VII. OBSERVACIN(DIAGNSTICO)

TCNICA HISTOLGICA
VII. OBSERVACIN(DIAGNSTICO)

TCNICA HISTOLGICA:
PROTOCOLO GENERAL
VII. OBSERVACIN (DIAGNSTICO)

MICROSCOPIO