TCNICAS HISTOLGICAS

FIJADORES
Existen multitud de fijadores en los manuales de tcnicas
histolgicas. Aqu slo trataremos aquellos que
consideramos de uso ms comn para la observacin de
tejidos al microscopio, es decir, aquellos que mejor
preserven la estructura celular. Los fijadores qumicos son los
ms frecuentemente empleados, bien compuestos por un
solo tipo de sustancia fijadora o con mezclas de varias de
ellas.
 Los fijadores se pueden clasificar en dos grandes
grupos segn su accin sobre el tejido: los
coagulantes y los que establecen enlaces
cruzados. Los primeros, al extraer agua de los
tejidos producen coagulacin y desnaturalizacin
de las protenas, sobre todo las de la matriz
extracelular, mientras que los segundos
establecen enlaces qumicos entre molculas del
tejido.
Los fijadores que tienen como base al alcohol son
desnaturalizantes, tales como el Bouin o el
Carnoy, mientras que el formaldehdo o el
glutaraldehdo establecen enlaces. Tambin se
preparan soluciones mixtas de ambos tipos de
fijadores.
 Otra clasificacin de los fijadores es la de que sean aditivos o
no aditivos. Los primeros tienen molculas o iones que se
combinan con las molculas del tejido y formarn parte de l
en los pasos sucesivos del procesamiento.
Estos son sobre todo los que establecen enlaces y algunos
coaguladores. Los no aditivos son aquellos que tras llevar a
cabo su funcin son eliminados en pasos posteriores, como es
el caso del alcohol o el cido actico
La mayora de las sustancias fijadoras son txicas por
inhalacin o por contacto, algunas de ellas cancergenas. Hay
que seguir las indicaciones de seguridad para su manejo y
utilizacin
Fijadores simples

Etanol, metanol, acetona. Fijan por deshidratacin y coagulacin de

las protenas, sobre todo las citoslicas. Extraen los lpidos de los tejidos,
pero no afectan a los carbohidratos. El metanol es mejor fijador que el
etanol puesto que no causa tanto endurecimiento del tejido y aporta
una mejor preservacin.
En general, son buenos fijadores de muestras de pequeo tamao, y
para preservar protenas, como enzimas, glucgeno, y pigmentos. Se
usan frecuentemente para para fijar las extensiones citolgicas o
secciones de criostato obtenidas de tejido no fijado. Debido a que
deshidratan, a la vez que fijan, se pueden usar tambin como un
conservante de las muestras.
Tienen algunos inconvenientes como producir endurecimiento y la
retraccin de los tejidos, muy evidentes en bloques de tejido muy
grandes. Carecen de efecto mordiente.
cido actico. No fija directamente a las
protenas sino que su proceso de fijacin
consiste en cambiar el estado coloidal de
las protenas. Se utiliza a una
concentracin que vara entre el 1 y el 5 %.
Es el fijador ideal para cidos nucleicos y
nucleoprotenas.
Como inconvenientes cabe destacar la
destruccin de las mitocondrias y mala
fijacin de membranas y citoplasma. Se
suele usar en combinacin con otros
fijadores.
 Cloruro o sulfato de zinc. El cloruro de zinc se
utiliz inicialmente como fijador pero ms tarde
pas a ser un componente de mezclas fijadoras.
Se emplea normalmente en combinacin con el
para formaldehdo.
El cloruro de zinc ayuda a la fijacin y preserva la
antigenicidad si se necesita el tejido para pruebas
inmunocitoqumicas, ya que contrarresta el
enmascaramiento de antgenos que se atribuye al
paraformaldehdo.
Las sales de zinc han sustituido progresivamente
a las sales de mercurio usadas tradicionalmente
en las mezclas fijadoras. Es importante sealar
que el fijador no se prepara en sales de fostato,
como es habitual, y tras la fijacin ha de
eliminarse el zinc mediante lavados en agua
destilada.
 cido pcrico. La fijacin la produce gracias a que las
sales del tipo picrato coagulan las protenas de los
tejidos.
Se suele usar del 2 al 15 % de una solucin saturada de
cido pcrico. Preserva bien la estructura celular, no
produce retracciones cuando el tiempo de fijacin es
ptimo, preserva bien glucgeno y lpidos.
Es un buen fijador para tinciones generales puesto que
tiene efecto mordiente y favorece la unin de los
colorantes.
Hay que eliminarlo completamente antes de proceder a
la inclusin en ceras como la parafina puesto que
dificulta la penetracin de la parafina. Se suele usar
combinado con otros fijadores.
 Formaldehdo. Es un fijador ampliamente usado por la buena
preservacin del tejido, acta como conservante, produce poca
retraccin tisular, es compatible con la mayora de las tcnicas y
tinciones histolgicas, incluidas las de inmunocitoqumica e
hibridacin de cidos ribonucleicos.
El formaldehdo se une a grupos funcionales de las protenas
formando grupos hemiacetales. Esta unin hace que muchos enzimas
queden inactivas, lo que ayuda a evitar la degradacin del tejido por
las enzimas hidrolticas. Los grupos a los que se une son amino,
sulfidrilos, guanidilos, grupos hidroxilos alifticos, etctera. La unin
a uno de estos grupos produce un grupo hidroximetileno.
Es el hidroximetileno el que reacciona con grupos de otra, o de la
misma, protena para la formacin de puentes. El formaldehdo
preserva bien los lpidos, sobre todo si se aade a la solucin fijadora
iones de calcio (reducen la solubilidad de los fosfolpidos), y no
 La fijacin normalmente es de 24 a 50 h, aunque puede ser
de 1 a 2 semanas. Si el tejido va destinado a
inmunohistoqumica es suficiente con 12-24 h a 4C.
Fijaciones muy prolongadas endurecen el tejido y pueden
provocar inestabilidad de los cidos nucleicos. Parte del
fijador del tejido se puede eliminar mediante lavados
prolongados.
Normalmente se usa en solucin tamponada e isotnica. Se
utiliza a concentraciones prximas al 4 %.
Actualmente se prepara a partir de paraformaldehdo,
sustancia slida. Ejemplos: formaldehdo tamponados
 Glutaraldehdo. Es uno de los fijadores
ms usados. En solucin polimeriza
formando dmeros y trmeros.
Los grupos aldehdos que quedan dentro
en la molcula polimerizada reaccionan
con los grupos aminos de los
aminocidos de las protenas, formando
puentes entre las molculas de los
tejidos.
Los grupos aldehdos de los extremos,
sin embargo, quedan libres, y es
importante anularlos para evitar falsos
positivos (por ejemplo, evitando que se
unan los anticuerpos durante la
inmunocitoqumica o que se unan los
aldhedos del reactivo de Schiff).
 Tetrxido de osmio. Es uno de los fijadores ms antiguos, se usa desde al
menos 1865. En solucin penetra poco en los bloques de tejido, y se
recomiendan tamaos no mayores de 0.5 o 1 mm.
Se puede usar tanto en solucin como en vapor. No produce artefactos pero
hace a las muestras de tejido frgiles. Forma puentes entre los enlaces
insaturados de las cadenas de cidos grasos de los lpidos de las membranas
celulares. Las hace insolubles, oscuras y opaca a los electrones. Por eso se
emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio electrnico,
ya que preserva y oscurece las membranas celulares.
Pero tambin en microscopa ptico se usa para estudiar las grasas
insaturadas, para observar los tractos de mielina, y es necesario para las
impregnaciones argnticas como el mtodo de Golgi.
Por su fuerte carcter oxidante no se usa para tinciones convencionales puesto
que impide la unin al tejido de los colorantes aninicos. Actualmente se usa
mucho tras la fijacin de las muestras con formaldehdo o glutaraldehdo, y
antes de deshidratar dichas muestras para su observacin al microscopio
 Mezclas fijadoras
La mayor parte de los procesos de fijacin usan varias sustancias
fijadoras, bien mezcladas en la solucin acuosa inicial o utilizadas
sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de
cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas.
Hay multitud de formas de usar los diferentes fijadores, tanto en sus
componentes como en las proporciones de stos, dependiendo de las
necesidades posteriores, es decir, qu tipo de tejido queremos fijar y
qu queremos ver de dicho tejido.
Junto con las sustancias fijadoras tambin se aaden a las mezclas
otros componentes que afectan a otros parmetros como la
osmolaridad o el pH de la solucin. Por ejemplo, en la mayora de los
casos las sustancias fijadoras se disuelven en soluciones tamponadas
para controlar osmolaridad y pH, de manera que no se afecte a la
estructura del tejido. Pero tambin con otros propsitos, como por
ejemplo el etiln glicol que se aade a los fijadores para obtener
secciones por congelacin y adems evita la difusin de las enzimas
 Lquido de Bouin. Est formado por cido pcrico, formaldehdo y
cido actico glacial. Es una solucin muy utilizada para el
procesamiento de tejidos que se incluirn en parafina (ver captulo de
inclusin) y a cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro
de tinciones.
Es muy til para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el ncleo y
el glucgeno. Hay que tener cuidado con el tiempo de fijacin, que no
debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersin.
Tras la fijacin las muestras de tejido se pueden conservar en alcohol de
70. No est recomendado para el rin ni para el estudio de
mitocondrias.
Antes de la inclusin en parafina es conveniente eliminar el cido pcrico
mediante lavados en alcohol de 70 porque impide una buena inclusin
y que las tinciones no sean ptimas
Solucin de Clarke. Est formada por etanol y cido actico
glacial (3:1). Es uno de los primeros fijadores usados, bueno
para muestras que se incluirn en parafina.

Carnoy. Es un buen fijador para el glucgeno, para los

hidratos de carbono simples y para las protenas fibrosas. Es
bueno para visualizar los cidos nucleicos, aunque no la
morfologa nuclear, y para los grumos de Nissl del sistema
nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Est formado
por etanol absoluto, cloroformo y cido actico glacial
 Mezclas con formaldehdo. El formaldehdo es quiz el fijador ms
usado hoy en da, tanto para tcnicas histolgicas comunes como para
otras como la inmunocitoqumica o la hibridacin de cidos nucleicos.
Lo ms frecuente es utilizarlo en solucin al 4 % junto con otros
fijadores. Se suele disolver en soluciones tamponadas que tienen una
osmolaridad similar a la del tejido que se pretende fijar.
Para fijaciones de tejidos destinados a microscopa electrnica se
suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehdo y
glutaraldehdo.
La funcin del formaldehdo es iniciar una fijacin rpida, por su mayor
capacidad de penetracin, mientras que el glutaraldehdo realizar una
fijacin ms poderosa, pero ms lenta que no afectar a la estructura
tisular puesto que el formaldehdo ya ha realizado una fijacin previa.
 Glutaraldehdo-tetrxido de osmio. Los fijadores en combinacin
no tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo.
Es habitual que los tejidos destinados a microscopa electrnica
sean inicialmente fijados en glutaraldehdo (1 al 3 %) y
paraformaldehdo (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados
en tetrxido de osmio al 1 % en solucin tamponada.
Este ltimo es un buen preservador de la ultraestructura celular,
sobre todo membranas, en cooperacin con los aldhedos.
Esto es importante porque el proceso para microscopa
electrnica supone incubar el tejido en solventes orgnicos y
polimerizacin de resinas a 60 C, durante las cuales el tejido
debe ser preservado