39.

Aislamiento y purificacin del DNA de un

plsmido recombinante

Aurora Galvn Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, Jos
Javier Higuera, Vicente Mariscal, Emilio Fernndez Reyes

Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba


RESUMEN

El DNA de un plsmido recombinante presente en una bacteria se asla
por un mtodo rpido y sencillo ( miniprep ) que consiste en lisis
bacteriana, precipitacin de protenas y DNA genmico, y finalmente
precipitacin del DNA plasmdico. El objetivo es obtener suficiente
cantidad del DNA para su anlisis posterior mediante electroforesis.

Palabras clave: DNA plasmdico, lisis alcalina, eficiencia de la purificacin

Abreviaturas empleadas. DNA: cido desoxirribonucleico; IPTG, isopropil--D-
tiogalactopiransido; LB: medio de Luria-Bertani; RNasa, Ribonucleasa.


1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico, circular y
generalmente de pequeo tamao que se encuentran en muchas especies
bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA
cromosmico. A diferencia de ste, los plsmidos no son necesarios para la
viabilidad general de la clula, pero pueden contener genes que contribuyen a
la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia
a antibiticos, a metales etc. Algunas clases de plsmidos poseen adems la
propiedad conocida como "replicacin relajada", esto es, estn presentes en
forma de muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su aislamiento
y purificacin.

Los plsmidos poseen un inters singular en Ingeniera Gentica por ser uno
de los sistemas vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un
sistema que permite introducir en una clula hospedadora un fragmento de
DNA que se pretende clonar; en esta clula hospedadora el vector se replica y
expresa, en su caso. La molcula que resulta de la unin de un DNA vector con
el DNA de inters (denominado entonces "inserto") se denomina molcula de
vector recombinante.

Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido ideal debe poseer
al menos tres caractersticas: 1) Debe tener su propio origen de replicacin y
por tanto la capacidad de replicacin autnoma independiente del genoma del
hospedador. 2) Debe tener sitios de clonacin mltiple que permitan la apertura
del DNA con enzimas de restriccin y hace posible la clonacin de insertos de
1
DNA en la forma y orientacin determinada. 3) Debe poseer marcadores
genticos seleccionables que permitan aislar las clulas hospedadores que
contengan el vector. La mayora de los plsmidos naturales no cumplen todas
estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniera Gentica ha
consistido en la construccin de plsmidos artificiales, combinando en una
misma molcula diversos rasgos tiles procedentes de los plsmidos naturales.

La presencia en el plsmido del gen de resistencia a ampicilina permite
seleccionar las bacterias que portan estos plsmidos, gracias a su capacidad
para crecer en presencia de dicho antibitico (el gen de resistencia codifica una
beta lactamasa, enzima que degrada la ampicilina).

La mayora de los plsmidos usados en Biologia Molecular contienen el sitio
de clonacin mltiple dentro el gen de la -galactosidasa lo que permite la
interrupcin e inactivacin de este gen cuando un DNA inserto se clona en esta
regin. En medios de cultivo que contengan el anlogo de la lactosa X-gal, esta
estrategia permite distinguir las colonias bacterias que contienen el vector
recombinante (con inserto) de aquellas que han recibido un vector no
recombinante (sin inserto). Las bacterias que reciben el vector recombinante no
pueden utilizar lactosa ni su anlogo y formar colonias blancas. Las bacterias
que reciben un vector no recombinante s pueden utilizar la lactosa o su
anlogo y formarn colonias azules.

El objetivo de esta prctica consiste en la purificacin del DNA del plsmido
recombinante contenido en una cepa de la bacteria E. coli, y familiarizarse con
las propiedades de DNA plasmdico.


2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

- Tubos Eppendorf, micropipetas, puntas estriles, pipetas Pasteur, agua
estril, microcentrfuga.
- Clulas E.coli transformadas: suspensin en medio LB/Amp
- Solucin de resuspensin
- Solucin de lisis
- Solucin 3M de acetato potsico


3. PROTOCOLO A REALIZAR

3.1. Cultivo de bacterias

Paso 1. Se preparan frascos de cultivo o tubos con medio LB estril, a los que
se aade en el momento de cultivar ampicilina a una concentracin final de 0,1
mg/ml (ya que estamos trabajando con plsmidos que poseen el gen de
resistencia a este antibitico).

Paso 2. Se toman colonias individuales de la placa de agar, pasndolas al
medio lquido, y se incuba una noche a 37C, con agitacin.

3.2. Extraccin del DNA plasmdico

2
Si bien existen kits comerciales para preparar DNA plasmdico, la realizacin
de este protocolo se considera formativo, sencillo y permite obtener de modo
rutinario DNA plasmdico con un grado de pureza aceptable. El material que
entre en contacto con el cultivo de bacterias deber desecharse en un
recipiente con leja.

1. Se toma 1 ml del cultivo de bacterias y se centrifuga en un tubo eppendorf
durante 2 min (14000 rpm). Se elimina el sobrenadante por inversin del
tubo o con ayuda de una pipeta, dejando el sedimento lo ms seco
posible.

2. Se resuspende el sedimento de bacterias en 250 l de tampn de
resuspensin empleando una pipeta (aspirar y expulsar el lquido varias
veces sobre el sedimento hasta que desaparezca ste). Se incuba 2 min
a temperatura ambiente.

3. Se aaden al tubo 250 l de la solucin de desnaturalizacin NaOH/SDS.
Se agita el tubo por inversin suave (observar el aspecto y viscosidad de
la disolucin). Posteriormente se incuba durante 5 min a temperatura
ambiente.

4. Se aaden a continuacin 300 l de acetato potsico 3 M y se mezcla el
contenido del tubo (observar el aspecto del tubo, aparecer una turbidez
blanca al precipitar las protenas y el DNA cromosmico). Se incuba 10
min en hielo.

5. Se centrifuga 10 min (14000 rpm).

6. Con ayuda de una pipeta se transfiere cuidadosamente la fase acuosa
sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo. Si la fase acuosa no est
suficientemente limpia, y contiene restos del precipitado blanco, volver a
centrifugar los tubos.

7. En este sobrenadante se encuentra RNA y el DNA plasmdico. Estos
cidos nucleicos se precipitan con 2 volmenes de etanol absoluto fro.
Mezclar bien por inversin y guardar a -20C durante al menos 20 min
(congelador).

8. Pasado este tiempo, se centrifuga durante 30 min a 14000 rpm.

9. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. El
precipitado se lava de nuevo con 0,5 ml de etanol 70% fro (20 min,
centrifugacin).

10. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. El
precipitado casi invisible, que contiene DNA plasmdico y RNA, se debe
secar completamente para eliminar los restos de etanol que pueden
interferir con procesos posteriores. El precipitado se disuelve en 25 l
agua estril.

11. Finalmente se aaden 0,5 l de una solucin de RNasa (1 g/ml) y se
incuba 20 min a temperatura ambiente. Este tratamiento con RNAasa
3
degrada el RNA quedando una preparacin purificada de DNA
plasmdico. Una alternativa a este paso es incluir la RNasa en el tampn
inicial de resuspensin o tampn de lisis


4. RESULTADOS ESPERADOS

El mtodo empleado para la obtencin del plsmido se denomina de "lisis
alcalina": se basa en la desnaturalizacin y precipitacin selectiva del DNA
cromosmico en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA
plasmdico permanece intacto debido principalmente a su pequeo tamao y
su naturaleza circular y superenrollada.

El tratamiento con alta concentracin de sal (acetato potsico) y SDS
produce la precipitacin de gran parte de las protenas.

El tratamiento con RNasa elimina la contaminacin de RNA que puede ser
importante.

La purificacin del DNA plsmidico se completa entonces por precipitacin
con etanol. Es posible obtener DNA plasmdico con diferente grado de
superenrrollamiento que se puede visualiza tras la separacin por electroforesis
y tincin con BrEt .


5. DISCUSIN Y COMENTARIOS


a) Describe el porqu de los tratamientos con: NaOH y SDS, acetato
potsico, etanol, y RNasa.

b) Realiza un esquema de la purificacin segn se utilice la RNasa en: 1) el
tampn de lisis 2) al final. Se podra prescindir de ella?

c) Por qu tienen carga negativa las molculas de DNA?

d) Cul es el papel de cada componente del tampn de carga?

e) Dibujar un esquema con el resultado obtenido en el gel y razona los
resultados.

f) En caso de tener las formas superenrollada y relajada del plsmido
indicar si:
Tienen el mismo peso molecular?
Y la misma longitud en pares de bases?
Cmo se podra convertir una forma en otra?. Cul en cual?


6. BIBLIOGRAFA COMENTADA

Old RW, Primrose SB (1989) Principles of Gene Manipulation. Blackwell Sci.
Pub. (Oxford, England), pp 11-13. Resumen comprensivo del procedimiento.
4

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, pp. 1.74-1.84. Excelente recetario con variaciones
tiles.


ANEXO 1: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO

Soluciones

- Solucin de resuspensin
- Solucin de lisis
- Solucin 3M de acetato potsico

-Medio de cultivo LB:
Extracto de levadura 5g/l
Triptona 10g/l
NaCl 5g/l
Esterilizar en autoclave. Almacenar en fro.

-Placas LB/ampicilina/IPTG/X-Gal:
Medio de cultivo LB
Agar 1,6%
Ampicilina 100 g/ml
IPTG 500 M
X-Gal 40g/ml

Material biolgico

- Clulas E.coli transformadas: suspensin en medio LB/Amp

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