TECNICAS DE PURIFICACION DE PLASMIDOS Los plsmidos son molculas circulares de DNA extracromosmico que se replican de forma autnoma, a partir

de su propio origen de replicacin. Hay distintos procedimientos para la purificacin de DNA plasmdico, aunque todos incluyen los tres pasos siguientes: (i) (ii) (iii) Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas que llevan el plsmido. (ii) Lisis de las bacterias para la liberacin del plsmido. (iii) Purificacin del DNA plasmdico.

Mtodo para la separacin de plsmidos del ADN genmico en extractos celulares bacterianos por lisis alcalina. Esta tcnica se basa en la fragmentacin lineal que ocurre durante la lisis celular del ADN genmico. Al incrementar su pH acerca de 12 pueden eliminarse los puentes de hidrogeno y separarse cada una de las cadenas del ADN. Los plsmidos (especialmente aquellos de bajo PM empleados para clonacin gnica) son resistentes y no se alteran por lisis celular, permaneciendo como ADN bacteriano circular superenrrollando. Cuando el pH es reducido, las uniones entre las cadenas en el plsmido se remueven y entran en un estado ms relajado(1) . Sin embargo, los fragmentos lineales de ADN genmico no tienden a re-naturalizarse, por lo que pueden agregarse en una malla insoluble que se remueve por centrifugacin, mientras que los plsmidos permanecen en solucin(2) . Otros componentes celulares que incluyen restos de pared celular y protenas, se remueven por este procedimiento, as que la extraccin por fenol no es necesaria. La preparacin del plsmido obtenido con esta metodologa es puro por lo que es til aun en casos de digestin con enzimas de restriccin(3,4).

Figura 1 : Proceso de desnaturalizacin alcalina para la purificacin de plsmidos

Procedimiento: Se proceder a purificar el plasmidio pUC19 a partir de clulas de E.coli XL1blue transformadas con este plasmidio en la prctica anterior. Se utilizar el mtodo de purificacin por lisis alcalina seguida de la extraccin con fenol: cloroformo. 1. Se toma un cultivo bacteriano (5mL en LB) y se centrifuga a 5000 rpm por 5 min para colectar las clulas. Esto se hace en tubos de microcentrfuga de 1.5mL. 2. Se resuspende el pellet bacteriano en 100L de Solucin I y se agita vigorosamente con Vortex o con la ayuda de una pipeta. 3. Se aaden 200L de Solucin II, recin preparada. Se cierra el tubo y se agita suavemente por inversin. Se deja reposar por 5min. ( La muestra debe volverse viscosa). 4. Se aaden 150L de Solucin III, se agita para mezclar todo y se deja reposar por 10min. (Se observa la formacin de un precipitado blanquecino). 5. Se centrifuga a 10 000 rpm por 5min y se transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo. Se desecha el precipitado. 6. Se adiciona igual volumen (400L) de una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol-isoamlico (25:24:1). Se mezcla por Vortex y se

centrifuga a 10 000 rpm por 2min. Despus de este paso se forman dos fases en el tubo, tomamos la fase superior acuosa con mucho cuidado. 7. Se precipita el ADN con 2 volmenes de Etanol absoluto fro. Dejar reposar por 2min y centrifugar a 10 000 rpm por 10min. 8. Lavar el pellet de ADN con Etanol 70% fro. Volver a centrifugar como en el paso anterior, eliminar el sobrenadante y dejar que se seque el pellet. 9. Redisolver el pellet de ADN en 30L de Agua doble destilada y estril. 10. Aplicar 2L de esta muestra en una electroforsis de agarosa 0.8% previamente preparada. Visualizar el gel bajo la luz ultravioleta y discutir el resultado. Soluciones y Medios Solucin I Glucosa 50mM Tris-Cl 25mM EDTA 10mM pH 8.0 RNAasa 10g/mL Solucin II NaOH 0.2 M SDS 1% Solucin III KAc 3M % pH 5.5 (ajustado con HAc) Medio Luria-Bertani (LB) Triptona 10g Extracto de levadura 5g NaCl 10g Disolver en 1L de agua Esterilizar 20min 1200C 1atm Medio LBA slido Medio LB 1L Agar 15g Esterilizar 20min 1200C 1atm Ampicillina 50mg Dispensar en placas de vidrio

BIBLIOGRAFIA: (1) Dole JW, Schantz M. From genes to genomes. Concepts and applications of AND technology. John Willey & Sons, Ltd., 2002. (2) Primrose Sb, Twyman R, OldRW. Principles of genes manipulation. &th Edition. Blackwell Science, Oxford, UK., 2001. (3) Voet D, Voet JG, Pratt CW. Fundamentals of Biochemistry. John Wiley & sons, Inc. New York, 1998. (4) Stryer L. Biochemistry %th Edition. WH Freeman. New York, 2001 Lizcano Losada Fernando. Fundamentos moleculares en medicina. Edit. Manual Moderno. Pp: 44