Tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009

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Elaboro,
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Reviso,
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Tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno
Sorbent Assay)

Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza
Laboratorio de Inmunologa L-121, Campus I

Prez Prez Jos Manuel
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Prez Sevilla Alma Beatriz
2
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Equipo 3, Grupo 2802
Introduccin:

La tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno
Sorbent Assay) es un procedimiento de ensayo
inmunoenzimtico. Se basa en la deteccin antgeno
(Ag) o anticuerpo (Ac), inmovilizado sobre una fase
slida y mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reaccin, la prueba
recurre al empleo de inmungenos, haptenos
anticuerpos marcados con una enzima cuyo producto
colorido, puede ser medido espectrofotomtricamente.
Este principio tiene las propiedades de un
inmunoensayo ideal: es verstil, robusto, simple en su
realizacin, emplea reactivos econmicos y consigue,
mediante el uso de la fase slida, de una separacin
fcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre. Las
enzimas utilizadas se muestran en el cuadro 1.

Cuadro 1 Cromogenos utilizados para las enzimas fosfatasa
alcalina y Peroxidasa y el color que se obtiene
Enzima Cromogeno Color
Fosfatasa
Alcalina
p-nitrofenil fosfato (pNPP) amarillo
5-bromo-4-cloro-3indolil fosfato/nitro
azul de tetrazolium (BCIP/NBT)
Purpura
Naftol AS-TR fosfato/fast red RC Rojo
Peroxidasa 2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6
acido sulfonico
verde
o-fenilamino (OPD) Naranja
3,35,5-tetrametilbencidina base o
dihidrocloruro (TMB)
Azul
3,3-deaminobencidina (DAB) Marrn
3-amino-9-etilcabazole (AEC) Rojo
4-cloro-1-naftol (4C1N) Azul



Fases de realizacin de una ELISA
Sensibilizacin de la placa.
Bloqueo de espacios vacos.
El Ag o el Ac se fija a una superficie.
Aplicacin del espcimen de prueba.
Controles positivo y negativo
Deteccin y caracterizacin por Ac. 2
marcado.
Incubacin con la muestra.
Incubacin con el sistema de deteccin.
Adicin del sustrato.

Los diferentes tipos de ELISA son los que se
enumeran a continuacin:

Anticuerpos Marcados
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA Sandwich
o Doble (DAS)
o Heterologo (HADAS)
Antgenos Marcados
ELISA Competitivo

ELISA Directo.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos
especficos. Lavado para eliminar los antgenos
fijados deficientemente o no fijados. Adicin de
anticuerpos marcados (conjugados) con una
enzima; si los anticuerpos reaccionan con los
antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado
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para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea
capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar
la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica
del producto final coloreado.

ELISA Indirecto.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de antgenos
especficos para los anticuerpos objeto de estudio.
Lavado para eliminar los antgenos fijados
deficientemente o no fijados. Adicin del suero
problema, de tal forma que sus anticuerpos
reaccionarn especficamente con los antgenos
fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una
enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos
especficos aadidos en el paso anterior y que se
encuentran fijados a los antgenos. Lavado para
eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea
capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar
la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica
del producto final coloreado.

ELISA Sndwich DAS (Double Antibody
Sandwich).

Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos
especficos del agente patgeno a detectar. Lavado
para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra
problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,
etc.), de tal forma que si est presente el agente
patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar
especficamente con los anticuerpos fijados al soporte.
Lavado para eliminar los antgenos que no hayan
reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a
detectar (deben tener un eptopo diferente de los
anticuerpos con los que se han tapizado el soporte)
conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con
los antgenos aadidos con la muestra problema y que
se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para
eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea
capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar
la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica
del producto final coloreado.

ELISA Sndwich HADAS.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos
especficos del agente patgeno a detectar. Lavado
para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra
problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,
etc.), de tal forma que si est presente el agente
patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar
especficamente con los anticuerpos fijados al soporte.
Lavado para eliminar los antgenos que no hayan
reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a
detectar (deben tener un eptopo diferente de los
anticuerpos con los que se han tapizado el soporte),
los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con
la muestra problema y que se encuentran fijados a los
anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que
no hayan reaccionado. Adicin de anticuerpos
conjugados con una enzima anti-anticuerpos
empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar
los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea
capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar
la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica
del producto final coloreado.

ELISA Competitivo.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos
especficos del agente patgeno a detectar. Lavado
para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados. Adicin en
concentracin conocida de una mezcla de antgenos
del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados
con una enzima y antgenos desconocidos objeto de
estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos
del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados
con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que
no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre
el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o
colorimtrica del producto final coloreado de ambas
pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de
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ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio
no tienen nada que ver con los anticuerpos
empleados para tapizar el soporte. Si hay
diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el
antgeno objeto de estudio, est relacionado
serolgicamente con el anticuerpo empleado para
tapizar el soporte y la diferencia de densidad ptica,
es proporcional a la concentracin del antgeno
problema en la muestra.
Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden
resumir en dos grandes grupos:
ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich.
ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs
indirectos.

La fase slida debe ser de un tipo que permita un fcil
manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la
reproducibilidad de la unin de antgenos o
anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96
pocillos y un volumen de 350L son especialmente
ventajosas para procesar un elevado nmero de
muestras y un vez tapizadas, el material inmovilizado
permanece reactivo mucho tiempo siempre que se
mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se
utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano
que pueden adquirirse estriles y con o sin tapa. Las
tcnicas de ELISA se realizan mediante la adicin
secuencial de todos los reactivos necesarios separados
por etapas de lavado. Cada una de las operaciones
puede realizarse manualmente con micropipetas o con
equipamiento para la automatizacin de todas y cada
una de las etapas. Esta completa automatizacin se
justifica por la necesidad de procesar y analizar
un gran nmero de muestras y necesitar una
elevada repetibilidad de resultados.

La enzima escogida como marcador debe unirse
fcilmente a antgenos y anticuerpos, encontrarse en
estado puro a un precio razonable y tener un substrato
cromognico o fluorognico conveniente y de fcil
preparacin. Las enzimas ms utilizadas son fosfatas
alcalina, peroxidasa de rbano y -galactosidasa; a
continuacin se muestra una tabla con las ventajas y
desventajas de cada una as como los substratos que
se emplean con cada una de ellas.

La bsqueda de la concentracin ptima de uso
depende ligeramente del tipo de ELISA empleado;
para cualquier ELISA que utilice anti-anticuerpos
conjugados, se suele probar diferentes diluciones
del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a
sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas
con antgeno a concentracin idne a. Aquella
dilucin del conjugado que produzca menor reaccin
inespecfica (menor color de fondo o background)
con muestras negativas e implique una clara
distincin de las muestras positivas, ser la ptima. La
eleccin de una concentracin de conjugado ptima
va completamente ligada a planteamientos
econmicos en los que se ha de procurar el mayor aho
rro del conjugado an a costa de aumentar el tapizado.
La eleccin del substrato es de gran importancia para
la estandarizacin del mtodo ELISA y hay que tener
varios factores en cuenta, como son sensibilidad,
especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura y
complejidad de preparacin, as como estabilidad
despus de la parada de la reaccin.
Hoy en da existen muchas variaciones en cuanto a los
substratos y, por lo tanto, el mtodo de deteccin de
los complejos antgeno-anticuerpo como los sistemas
de deteccin colorimtricos, fluorescentes y
luminiscentes. Este mtodo ha tenido una enorme
aplicacin en todos aquellos campos en los que se
precisaba la cuantificacin de productos mediante
anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin viral,
clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de
anticuerpos monoclonales, etc.

Objetivo:
Cuantificar el contenido de antgeno
(gammaglobulina humana) y la dilucin del
conjugado del Anticuerpo (anti-
gammaglobulina) para sta tcnica.

Conocer el fundamento y las fases en la
realizacin de la tcnica de ELISA, y cules
son las variantes de este mtodo.

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Diagrama de Flujo:























































Resultados:

Para la tabla de resultados referirse al anexo 1,
pgina 5, y la grafica en el anexo 2, pgina 6.

La lectura de la placa de ELISA fue llevado acabo a
490 nm.

En la tcnica de ELISA que se realizo fue
estandarizada para la cantidad de 16g/mL de
antgeno (gammaglobulina humana) en una dilucin
del anticuerpo conjugado a 1:20000, debido a que al
interpolar en la grafica 1, anexo 2, pgina 6, se obtuvo
un valor de 4.3 obteniendo por anti-logaritmo el valor
de 19952, debido a las complicaciones para llevar
acabo una dilucin precisa y por su cercana se
redondea el valor a 20000.

Anlisis de Resultados:
Con base en los resultados obtenidos la cantidad de
antgeno requerido en el ensayo por medio de ELISA
es de 16g/mL de gammaglobulina con una dilucin
de anticuerpo (anti-gammaglobulina) a 1:20000 para
obtener una lectura adecuada ya que fue la ms alta.
Aunque se observa en la tabla 1 y grafico 1 del anexo
1 y 2 respectivamente valores por encima, al obtener
la pendiente el pocillo con la letra D con una
concentracin de 16g/mL fue la que se obtuvo mejor
lectura, evitando as otros valores que se pueden deber
a la prozona y postzona.
Son los factores que afectan la medida de la actividad
enzimtica (temperatura, pH, fuerza inica,
composicin del tampn, reduccin del substrato,
desnaturalizacin de la enzima y algunos casos,
exposicin a la luz), tambin el desarrollo de las
diluciones que son los que ms afectan al ensayo
adems de la experiencia del analista, hoy en da, son
el tiempo de reaccin, la temperatura y la exposicin a
la luz, los cuales al realizar de manera manual se eleva
el error.
Cabe sealar que ste tipo de estudios se realizan para
estandarizar un mtodo de ELISA para un antgeno
deseado. En sta prctica se realizo de manera
demostrativa como se realiza la tcnica de ELISA
Rotular tubos del 1 al 7 del A al G

Colocar en 6 tubos solucin de IgG acepto el A

Colocar un testigo negativo en la lgG terminando
en la A

Colocarlos en una cmara hmeda 18hr 4C

Eliminar el sobrenadante durante 30m

Lavar con PBS Tween 4 veces y reposar 1 min
Etiquetar 11 tubos y colocarle el conjugado

Colocar regresivamente un testigo conjugado e
inc a 37c 1hr

Lavar con PBS tween.


Leer a 490 nm en lector de ELISA.

Adicionar sustrato con el cromgeno
Incubar 15 min a 37C


Diluir la solucin de gammaglobulinas

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desde el pegado de antgeno a la placa, las diluciones
del mismo, as como la dilucin del anticuerpo anti-
gammaglobulina. Una vez estandarizo el mtodo se
realizan los estudios de corte para saber que paciente
presentan alguna enfermedad con base en un estudio
estadstico al 95% de confianza, y obtener de los
lmites de referencia establecidos en el estudio para
pacientes que presentan enfermedad a partir del
resultado obtenido y que pacientes se descartan, con
esto tener la normatividad del laboratorio.
Conclusin:

Con base en el anlisis de resultados a se cuantifico la
cantidad de antgeno de gammaglobulina humana
obteniendo 16g/mL para la deteccin por ELISA en
sta tcnica con una dilucin de anticuerpo de
1:20000.

En sta prctica se conoci los fundamentos y la
realizacin de la tcnica de ELISA, as mismo los
factores que afectaron durante el experimento, en ste
caso las diluciones, tiempo de incubacin.

Referencias:
Hudson L. C. Hay F. Inmunologa prctica. Espaa: Ed.
Jims, 1979:
Roitt I, et al. Inmunologa. 5 edicin. Espaa: Harcourt,
2000:
Anbal Margni R. Inmunologa e inmunoqumica
fundamentos. Argentina: Ed. Panamericana, 1996:
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ANEXO 1: Tabla 1, Absorbancia y dilucin de la placa de ELISA

WL= 450 nm log 2.70 3.00 3.30 3.60 3.90 4.20 4.51 4.81 5.11 5.41 5.71 Control

Dilucin 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 1:128000 1:250000 1:512000 Negativo
Antigeno (g/mL) pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
128 1A 3.333 2.623 2.861 1.967 1.131 0.684 0.448 0.212 0.157 0.041 0.02 0.045
64 1B 3.333 3.333 3.239 2.147 1.267 0.713 0.574 0.443 0.327 0.249 0.181 0.001
32 1C 3.333 3.333 3.333 1.913 1.525 0.729 0.521 0.388 0.191 0.073 0.19 0.039
16 1D 3.333 3.333 1.538 2.33 1.514 0.99 0.765 0.485 0.422 0.278 0.316 0.01
8 1E 3.332 3.332 3.332 1.943 1.124 0.762 0.49 0.312 0.214 0.078 0.133 0.056
4 1F 3.332 3.332 2.845 1.791 1.188 0.782 0.561 0.556 0.353 0.328 0.267 0.001
2 1G 3.332 3.332 2.757 1.882 1.102 0.735 0.456 0.277 0.212 0.036 0.019 0.027
1 1H 1.585 1.003 1.069 0.619 0.205 0.468 0.37 0.177 0.2 0.155 0.164 0.049















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ANEXO 2: Grafico 1

0.01
0.26
0.51
0.76
1.01
1.26
1.51
1.76
2.01
2.26
2.51
2.76
3.01
3.26
3.51
3.76
2.60 2.75 2.90 3.05 3.20 3.35 3.50 3.65 3.80 3.95 4.10 4.25 4.40 4.55 4.70 4.85 5.00 5.15 5.30 5.45 5.60 5.75 5.90 6.05 6.20
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Log de dilucin
Grafico 1. Curva de calibracin de absorbancia contra logaritmo de la dilucin para la
concentracin optima del antigeno y dilucin detectable para ELISA
A
B
C
D
E
F
G
H
Lineal (D)
Lineal (E)
Pocillo de la
placa de