TINCIONES CITOQUÍMICAS Lic.

TM MANUEL

APLICADAS EN HEMATOLOGÍA QUINTANILLA CÁRDENAS

 INTRODUCCION

El diagnóstico de un desorden hematológico a menudo requiere la

integración de varios accesos diagnósticos.

Estos incluyen la evaluación conjunta del frotis de sangre

periférica, frotis de Médula Ósea (MO), la morfología de las
improntas de la biopsia de hueso, juntos con los resultados de
otras investigaciones relevantes como Citoquímica, Immunofenotipo,
el análisis Genético y Técnicas Moleculares.
 MANIFESTACIONES
CLINICAS

ALGORITMOS
MORFOLOGÍA
CITOQUÍMICA DE INMUNOFENOTIPO

DIAGNÓSTICO

CITOGENETICA
& BIOLOGÍA
MOLECULAR
ESTIRPES HEMATOPOYETICAS
Sin embargo, cuando no encontramos con …
METODOS DE LABORATORIO EN EL DIAGNOSTICO HEMATOPATOLOGICO

MÉTODOS CITOQUIMICOS
 LA CITOQUÍMICA EN LA HEMATOLOGÍA

“Estudia la composición química de la célula hematopoyética,

permitiendo detectar y precisar la localización topográfica de
diversas sustancias (enzimas, metales pesados, sustancias orgánicas
moléculas de depósito y otras sustancias), por medio de métodos
tintoriales que permiten la formación de productos coloreados
visibles al microscopio óptico”
GENERALIDADES: METODOS CITOQUIMICOS

❑La mayoría, son técnicas que derivan de modificaciones de

técnicas histoquímicas.
❑Nexo entre morfología y bioquímica.
❑Conjuga forma y función.
❑Brinda resultados de índole cualitativo o semicuantitativo.
❑Apoyo para el diagnóstico de las distintas hemopatías.
 CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL
DIAGNOSTICO DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS

70 – 80 % 90 – 95 % 99 – 100 %
CITOMORFOLOGIA CITOQUIMICA INMUNOFENOTIPO
+ M. ELECTRONICA

CITOGENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

 Muestras de
Frotis de sangre Extensiones de Improntas de líquidos
periférica médula ósea tejidos biológicos
obtenidas por
citocentrifugación

MUESTRAS UTILIZADAS EN CITOQUIMICA


PASOS FUNDAMENTALES
✓Preservar las estructuras y
reactividad funcional
celulares.
✓ Ejm: metanol, etanol,
acetona, glutaraldehido,
formaldehido.
FIJACIÓN DE LA
EXTENSIÓN
CITOQUIMICA
INCUBACIÓN EN EL
MEDIO DE REACCIÓN ✓Para resaltar el producto de
reacción y permitir una
✓Dan lugar a un precipitado óptima visualización del
visible en el lugar de la
reacción.
núcleo y de citoplasma.
CONTRASTE
Las reacciones deben tener 3
características:
Sensibilidad
Especificidad
Reproductibilidad
 CITOQUIMICA CLASICA

Reconocimiento
por:

PRINCIPIOS NO PRINCIPIOS
ENZIMÁTICOS ENZIMÁTICOS

Hidratos de ENZIMAS
carbonos: MPO HIDROLITICAS ESTERASAS
P.A.S

Fe
hemosiderínico: FAlcalina Especifica: CAE
PERLS

Lípidos: Red Inespecífica:

Oíl/Sudan FAcida ANAE
Black
 TINCIÓN DE PAS (PERYODIC SCHIFF ACID)
Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la
acción del ácido peryódico, liberándose grupos aldehído que al combinarse con
el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo púrpura intenso.
INTERPRETACION:
(+) : Toda la serie linfoide con un patrón de distribución intracitoplasmático
de tipo granular fino, mediano o grueso.

(+) : Los neutrófilos y eosinófilos en todos sus estadios de desarrollo y con

mayor intensidad en el estadio maduro, de distribución homogénea difusa .

(+) : Serie monocitica con patrón de distribución homogéneo / mixto.

(+) : Megacariocitos y plaquetas patrón granular difuso
( - ) : Serie eritroide NORMAL
APLICACIONES
Ø ERITROLEUCEMIA: Eritroblastos y
eritrocitos anormales positivos.
Ø Trastornos madurativos de serie
eritroide presentan precursores
positivos.
Ø Células linfoides neoplásica de
leucemias linfáticas crónicas y linfomas Reacción de PAS muestra coloración
no Hodgkin pueden exhibir intensa citoplasmática en bloque
positividad de tipo GRANULAR.
IDENTIFICACIÓN DE ENZIMAS OXIDANTES
MIELOPEROXIDASA
La demostración de esta enzima localizada en los gránulos azurófilos
se basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato
(bencidina) en presencia de peróxido de hidrógeno, apareciendo un
precipitado pardo-oscuro en el lugar del citoplasma en donde se ha
producido la reacción.

BENCIDINA

H2O2
MPO
RESULTADOS
• GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : (+) patrón granular intenso en
toda la serie granulocítica mieloide y en menos del 3% de los
blastos en MO. Los blastos mieloides dan un patrón característico
polar, en casquete.
• EOSINÓFILO (+) en la membrana granular. Resistente al cianuro
de potasio.
• MONOCITOS: (+) patrón granular escaso o disperso
• LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS
• ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS
APLICACIÓN
✓Diferenciación de celularidad blástica
mieloíde (+) y linfoíde (-)
✓En las leucemias mieloides la mayoría de
los blastos (+/- 85%) y los promielocitos
son positivos.
✓Los cuerpos de Auer también son
positivos.
✓Los monoblastos y monocitos precursores
son débilmente positivos a negativos.
✓En eritroleucemias los precursores
eritroides son negativos.
MPO (-) MPO (+)
MPO (+++)
IDENTIFICACION DE ENZIMAS HIDROLITICAS
FOSFATASA ALCALINA LEUCOCITARIA (FAL)
FUNDAMENTO: Enzima que encuentra en los gránulos secundarios de los
neutrófilos.
Hidroliza monoésteres de ácido fosfórico, a pH alcalino (9,1-9,6) liberando
productos intermedios los cuales combinados con una sal diazoica originan un
precipitado coloreado en el citoplasma de la célula.
INTERPRETACIÓN
( + ) : Neutrófilos desde metamielocitos hasta la forma segmentada.
( - ) : Todas las demás células de sangre periférica y medula ósea.

Se realiza el conteo de 100 células polimorfonucleares maduras y en

banda.
Se asigna 5 grados de reacción:
0+ : No hay reacción
1+ : Escasa presencia de precipitado visible
2+ : Reacción moderada
3+ : Reacción fuerte
4+ : Reacción muy fuerte, precipitado cubre casi toda la
superficie celular.
1+ 2+

3+ 4+
OBTENCIÓN DEL SCORE LAPA
✓Multiplicando el número de células contadas por su grado de
intensidad.
✓Luego se suman los valores obtenidos.
✓Valor normal promedio varía de acuerdo a cada laboratorio y al
cromógeno usado:
❑Fast Red Violet = 20-146
❑Fast Blue BB = 25-180
APLICACIONES:
✓La determinación semicuantitativa de FAL permite el diagnóstico
diferencial de diversas hemopatías.
✓La mayor utilidad está en la diferenciación de leucemia mieloide
crónica, LES o HPN donde el score es bajo versus las reacciones
leucemoides en respuesta a una infección, cirrosis hepática y
Síndrome de Down presentan un score elevado, aunque no es 100%
específico.
FOSFATASA ACIDA
Substrato: naftol-AS-Bi-fosfato

FUNDAMENTO:
Es una enzima hidrolítica de
localización lisosómica, que provoca
la hidrolisis del sustrato a pH ácido,
liberando productos intermedios, que
al unirse con la sal diazoica dan un
precipitado rojo-naranja en el
citoplasma celular.
APLICACIONES: Diagnóstico de las Neoplasias linfoides precursores y
maduros
✓ Reacción ( + ) polar en los de fenotipo T La fosfatasa es
✓ Reacción ( + ) multifocal en los de fenotipo B tartrato sensible

✓ En las leucemias de células peludas (tricoleucemias) son fuertemente

positivas y son tartrato resistente.
IDENTIFICACION DE ENZIMAS HIDROLITICAS
ESTERASAS
FUNDAMENTO: Son enzimas de localización no lisosómica que hidrolizan los
ésteres de cadena corta de los ácidos grasos.
Actúan sobre un sustrato sintético liberando naftol, el cual se acopla a la sal
diazoica formando un precipitado citoplasmático altamente coloreado..
Son de 2 tipos: Específica e Inespecífica
ESTERASA ESPECIFICA
CLOROACETATO ESTERASA (CAE)
Su sustrato: Naftol-AS-D-cloroacetato
La reacción es rojo refringente.

INTERPRETACION:
(++) : Toda la serie granulocítica en sus diferentes estadios
de maduración, células cebadas .
(-) : Serie linfoide, Eosinófilos, monocitos maduros
(+) : Cuerpos de Aûer
ESTERASA ESPECIFICA
CLOROACETATO ESTERASA (CAE)

APLICACIÓN:
El CAE no es tan sensible como la
MPO para la detección de las etapas
tempranas de la diferenciación
granulocítica, por lo que los blastos
mieloides más inmaduros pueden ser
negativos, pero los blastos con
cuerpos de Aüer son fuertemente (+).
 ANAE (+)
ESTERASA INESPECIFICA
ALFA-NAFTIL-ACETATO ESTERASA
(ANAE)

✓ Alfa-naftil-acetato esterasa (ANAE)

✓ Alfa-naftil-butirato esterasa (ANBE)
✓ Naftol-AS-D-acetato esterasa (NASDA)
✓ Naftil-AS-acetato esterasa (NASA)

REACCIÓN POSITIVA: patrón citoplasmático granular o

difuso rojo parduzco en las células positivas y los
núcleos teñidos de color verde.
✓ Linfocitos T cooperadores (patrón granular o punto
focal)
✓ Monocitos (patrón difuso)
ANBE (+)
ALFA-NAFTIL-ACETATO ESTERASA (ANAE)
INTERPRETACIÓN
✓ Permite el reconocimiento del
componente monocítico, actividad
que es inhibida por la adición del
fluoruro de sodio (NaF)
✓ Serie linfoide y eritroide (-)
✓ Permite diferenciar los mieloblastos y
promielocitos de los monoblastos y
promonocitos.
INTERPRETACIÓN:
1. En las LMA, facilita el diagnostico
de la leucemia monocitica (LMA-
M5), cuyas células dan un fuerte
reacción + difusa sensible al NaF.
2. LMA-M6 & LMA-M7, los blastos
san reacción positiva con patrón de
punto focal y sensible al NaF.
3. En la LLA, junto a la fosfatasa
acida, ayuda identificar las LLA-T.
TINCIONES CLASICAS
RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO
ENZIMATICOS
 IDENTIFICACION DE LIPIDOS
TINCION DEL NEGRO SUDAN B
FUNDAMENTO: Se basa en la solubilidad del colorante.
Tiñe grasas neutras, fosfolípidos y esteroles.
También colorea componentes celulares no lipídicos: gránulos azurófilos
específicos y cuerpos de Auer.
INTERPRETACION
Es equivalente a la reacción de la Mieloperoxidasa.
APLICACIÓN
Distingue la celularidad blástica mieloide (+) de la linfoide (-)
IDENTIFICACION DE COMPONENTES INORGÁNICOS
REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS
FUNDAMENTO
✓El hierro de depósito se encuentra en el interior de las células en
forma de agregados de hemosiderina. Por esta reacción se
detecta el Fe hemosiderínico, que es insoluble, pero no el Fe
contenido en la ferritina que es hidrosoluble.
✓Se basa en la liberación de los iones férricos de su unión con las
proteínas por la acción del ácido clorhídrico; dichos iones férricos
al reaccionar con el ferrocianuro potásico dan un precipitado azul
verdoso de ferrocianuro férrico.
IDENTIFICACION DE COMPONENTES INORGÁNICOS
REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS
INTERPRETACION
✓En condiciones normales se
observan los gránulos
hemosiderínicos en los eritroblastos
(sideroblastos), algunos eritrocitos
(siderocitos) y macrófagos de la
médula ósea, hígado y bazo.
✓En condiciones normales se ve un
30-60% de sideroblastos con 1 a 4
gránulos en la superficie del
citoplasma.
IDENTIFICACION DE COMPONENTES INORGÁNICOS
REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS
INTERPRETACION
✓Los depósitos de hemosiderina
pueden informarse como (+) , (-) o
en porcentaje.
✓Sirve para diagnosticar anemias
carenciales y síndromes
mielodisplásicos.
GRACIAS POR SU ATENCIÓN!
Manuel Quintanilla Cárdenas
manuelqc8@gmail.com
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