Ensayo

ELISA
de

Equipo 2

Docente: 

Fonseca Esbeidy

Mendoza Pérez Felipe

Jalpa Frida
 

Méndez Alan
 Grupo: 

Santiago Andrea 
 BJ01Q

Vazquez Andrea

Introducción
 Ensayo de Inmunoadsorción Ligado a Una enzima se une químicamente a
un anticuerpo en las dos versiones de
Enzimas la prueba (indirecta y directa)

Fueron desarrollados originalmente Se han adaptado para detectar con éxito muestras
para la medición de anticuerpos que contienen antígenos

El ELISA tradicional requiere dos anticuerpos. Un anticuerpo, llamado primario, reconoce el antígeno de interés.

1. El anticuerpo secundario
reconoce el anticuerpo
primario:
2. El anticuerpo secundario está
unido covalentemente a una
enzima llamada peroxidasa
de rábano picante (HRP) que
nos permite detectar la
presencia del complejo
anticuerpoantígeno .
 Anticuerpos:
● Origen monoclonal o policlonal
Componentes ● Se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de
inmunoglobulina purificada
● Pueden ser solubles o estar inmóviles en un soporte sólido
❏ Fase sólida
Antígenos:
❏ Antígeno o anticuerpo
❏ Conjugado: enzima ● inmóviles o solubles, dependiendo del protocolo de análisis
❏ Sustrato
● La enzima debe tener una reactividad específica
● Debe ser fácilmente acopladas a ligandos y el anticuerpo
conjugado debe ser estable
● La reactividad debería ser retenida después del ligado de la enzima
al antígeno/anticuerpo
● Las enzimas escogidas no deben estar presentes en las muestras
de paciente

● Solubles en agua ● No tóxicos

● Fácil de manipular ● Bajo costo
 Tipos de ELISA
ELISA no competitivo:
Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva
se formará el complejo AgAc, y al agregar el conjugado reacciona con el respectivo sustrato
desarrollando color.
1. Directo: Detecta Antígeno
2. Indirecto: Detecta Anticuerpos
3. ELISA Sandwich
ELISA competitivo:
El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del Ag.
Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima
por que el conjugado ha sido desplazado por el Ac



Sensibilidad Reproducible Reactivos mínimos Gran campo de aplicación

 Procedimiento...
1. Las muestras experimentales se agregan a los pocillos y se
permite que los antígenos se adsorban a los pocillos durante una
breve incubación.
2. Después de la incubación, los pocillos se lavan brevemente, para
eliminar cualquier muestra no unida, y el anticuerpo primario se
agrega a cada pocillo.
3. A continuación, se agrega un anticuerpo secundario y solo se
adherirá cuando el anticuerpo primario ya se haya unido.
4. Finalmente, se agrega un sustrato a cada pocillo; si el anticuerpo
secundario está presente, la enzima HRP catalizará una reacción
colorimétrica.

Periodo de incubación de No incluir el antígeno o Pueden detectarse

37ºC después de la el anticuerpo primario en ácidos nucleicos
adición del substrato la reacción de ELISA mediante el ELISA
 01.

ELISA
Directa
 DESVENTAJAS


VENTAJAS

● Inflexible y caro: el
anticuerpo primario debe
marcarse individualmente y
no puede utilizarse para
múltiples experimentos

● Más rápido porque sólo
utiliza un anticuerpo
 ● La señal está menos
amplificada

● Elimina la reactividad
cruzada entre anticuerpos


Se suele utilizar para: Analizar la respuesta inmunitaria a un

antígeno.

 02.

ELISA
Indirecta
Es el más usado, por
eso también lo
Detecta ANTICUERPOS
llaman ELISA
tradicional.

● Se fija el Ag a la fase sólida.

● Lavado
● Se añade la solución muestra con el Ac a detectar
● Lavado
● Se adiciona una antigamaglobulina específica contra
el primer AC, es decir un Ac secundario que está
conjugado a enzima.
● Lavado
● Se adiciona el sustrato-cromógeno que propiciará el
cambio de color.
 El nivel de la señal Determinar la
resultante de la concentración de un
anticuerpo específico en
actividad enzimática se la muestra de suero.
correlaciona con la
cantidad de
anticuerpo.

Recubrimiento de buffer.
La fijación a la
● Carbonato-bicarbo
placa se da por
nato
adsorción pasiva:
● Tris-buffered saline
interacciones
(TBS)
hidrofóbicas
● Phosphate-buffered
dependientes de
saline (PBS)
pH y temperatura
Pasos
1. Fijar el antígeno.
2. Incubar a 37°C
3. Eliminar sobrenadante y lavar para eliminar los antígenos que pudieran quedar
libres.
4. Bloqueo de la placa /pocillos. Evitar unión inespecífica al recipiente. Se usa 5%
de albúmina sérica bovina BSA disuelta en PBS ya que esta no interfiere en la
reacción Ag-Ac. Se vuelve a incubar.
5. Lavar. PBST→ Tween 20. Surfactante que sirve para minimizar las reacciones
hidrofóbicas entre la proteína de bloqueo y el antígeno.
6. Se añade el suero muestra que puede contener al Ac primario (es lo que
buscamos) y se hace la dilución en serie, previa adición de estándar para hacer
la curva de concentraciones. Se vuelve a incubar.
7. Se retira el sobrenadante y se lleva a lavar.
8. Añadir el Ac secundario ya conjugado con la enzima peroxidasa de rábano HRP.
Debe ser específico para un epítopo de la cadena constante del anticuerpo
primario. Tener en cuenta la especie y el isotipo del Ac primario. IgG. Tiempo de
incubación.
9. Lavar
10. Añadir el sustrato con el cual va a reaccionar la enzima para producir la
coloración. Se pueden usar OMP o el TMB
Cualitativa Cuantitativa
Semicuantitativa

Obtención del título de

anticuerpos.
Espectofotómetro
Marcadores
enzimáticos
usados en
ELISA
 DESVENTAJAS

VENTAJAS


● Puede producirse una

reacción cruzada con el
● Alta sensibilidad: el anticuerpo
primario tiene varios epítopos que
anticuerpo secundario

pueden ser unidos por múltiples ● Requiere pasos de incubación
anticuerpos secundarios marcados, adicionales

que amplifican la señal

● Flexible: se pueden utilizar
diferentes anticuerpos primarios de
detección con un único anticuerpo
secundario marcado

● Existen numerosas variaciones de
anticuerpos secundarios marcados
disponibles en el mercado


Se suele utilizar para: Determinar la concentración total de

anticuerpos en las muestras

 03.

ELISA
Sandwich
 01
Anticuerpo de
captura
02
Patogeno

De gran tamaño con

mínimo dos epítopos 


03
Ligado a enzima

D

Anticuerpo de
detección I
 Ligado a un Ac secundario
ligado a enzima

Proceso
 DESVENTAJAS

VENTAJAS

● Se requiere un par
emparejado: la optimización de
la combinación de anticuerpos
● Muy alta sensibilidad: se utilizan puede ser complicada. Cada
dos anticuerpos para captar y anticuerpo tiene que reaccionar
detectar específicamente el con un epítopo específico de la
antígeno. El antígeno no necesita proteína diana y no puede tener
ser purificado antes de la una reacción cruzada con su
medición
 anticuerpo asociado

● Flexibilidad: Se puede utilizar
tanto la detección indirecta como
la directa


Se suele utilizar para: Analizar muestras complejas.


 04.

ELISA
Competitiva
 Variante más compleja de la técnica ELISA, también conocido como
ANTIGENOS ELISA de inhibición debido al uso de un antígeno de referencia que
competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo
SOLUBLES primario.


ANTIC UERPOS Se utiliza generalmente para detectar y/o cuantificar antígenos

Detecta 
 presentes en muy bajas cantidades.


1. Capa de pozos con antígeno


2. Incubar y lavar

3. Muestra de prueba de
pre-incubación con anticuerpos
primarios conjugados enzimáticos

4. Agregue la mezcla al pozo

5. Incubar y lavar cualquier
anticuerpo primario conjugado en
enzimas sin ataduras

6. Añadir sustrato

 DESVENTAJAS


VENTAJAS


● Falsos positivos: baja

● Alta sensibilidad: Puede especificidad

detectar específicamente
antígenos en una cantidad
relativamente pequeña

● No requiere el procesamiento de
la muestra

● Mayor precisión, exactitud y
reproducibilidad


Se suele utilizar para: Detectar antígenos pequeños que no pueden ser unidos por dos
anticuerpos diferentes. Este método ELISA se utiliza habitualmente cuando sólo se dispone de
un anticuerpo para el antígeno 

Problemas
 Alto fondo
Se refiere a la lectura de una excesiva
devoltura de color o de una alta
densidad óptica


Posibles causas
* Lavado deficiente


* La temperatura del laboratorio es demasiado alta

o demasiado baja

* Compruebe la calidad del agua. Utilice el mayor número de lavados
* Los reactivos se han mezclado, contaminado o
recomendado.

preparado incorrectamente.

* Mantener la temperatura ambiente dentro de los 18-25°C

* El sustrato se ha deteriorado

* Asegúrese de que se utilizan los reactivos correctos y que no se han
Solución explotado


* Asegúrese de que el sustrato es incoloro


 Curva estandar deficiente
Se requiere un estándar para
determinar las concentraciones
desconocidas.

Posibles causas
* No se añade la solución estándar


* El blanco tiene una OD más alta que el

estándar


* Error en la dilución en serie


Solución
* Añadir la solución patrón


* Minimizar el efecto de borde cubriendo la placa

de pocillos con la microplaca. Evitar trabajar
cerca de fuentes de calor


* Prestar atención a los volúmenes de la solución

estándar y de la solución tampón

 Lectura baja de OD Sin señal
significa que no hay desarrollo de color en el ensayo

La medición de la densidad óptica da lugar a señales bajas o
pobres que se muestran como un desarrollo insuficiente del color
en la placa

Posibles causas
Posibles causas
* Los reactivos se utilizaron en un orden incorrecto o caducaron


* Se utilizaron demasiados ciclos de lavado
 * Se ha añadido un anticuerpo de detección incorrecto,

caducado o no se ha añadido

* Los períodos de incubación fueron demasiado cortos

* Las muestras no se añaden al diluyente

* No hay suficientes anticuerpos

* No se añade la solución de sustrato

* Los reactivos estaban caducados o mezclados


Solución
Solución
* Compruebe el paquete de reactivos

* Intente utilizar el menor número de lavados recomendado

* Añadir el anticuerpo de detección adecuado

* Siga el protocolo de tiempo de incubación

* Comprobar que las muestras se han añadido al diluyente

* Aumentar la concentración de anticuerpos

* Añadir la solución de sustrato

* Verificar las fechas de caducidad de los reactivos

Gracias por su
atención!