Modelo Informe

MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICO. NORMAS ISO, UNE...
Sara Cano Ruera. Consultora Analiza Calidad. Mircoles 5 de abril 2006.
NDICE:
1. INTRODUCCIN 2. CULTIVO DE BACTERIAS a. Medios de cultivo b. Toma del inculo c. Transferencia d. Aislamiento 3. PRINCIPALES MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS a. Microorganismos aerobios mesfilos b. Mohos y levaduras c. Enterobacterias d. Coliformes totales e. Escherichia coli f. Staphylococcus aureus g. Salmonella
1. INTRODUCCIN
Ante la diversidad de mtodos y procedimientos analticos que dificulta la comparacin y armonizacin de los resultados obtenidos se hace necesario establecer unas normas que permitan dicha comparacin entre los resultados que se obtienen en los distintos laboratorios. La implantacin de las Buenas Prcticas de Laboratorio (BPL) y el Aseguramiento de la Calidad obliga a normalizar todas las operaciones que se realizan en el laboratorio. Por ello se han redactado una serie de procedimientos e instrucciones de trabajo con el fin de dar uniformidad y consistencia a los anlisis de alimentos que se realizan en los laboratorios de microbiologa y reducir los riesgos de error por parte de las personas que realizan el ensayo. Dado que la finalidad de trabajar con BPL es la obtencin de resultados analticos de calidad y conseguir la aceptacin mutua de estos resultados entre los diferentes pases, hay que seguirlas escrupulosamente. La elaboracin de estos documentos viene dada por la necesidad de tener un sistema unificado de funcionamiento y gestin de los laboratorios, ya que hace falta asegurar la calidad e integridad de los resultados y datos obtenidos en los anlisis, y establecer esquemas de funcionamiento equivalentes entre laboratorios. As, se ha realizado una homogenizacin de los mtodos de anlisis de alimentos, unificando sus caractersticas en base a las normas internacionales correspondientes (ISO: Internacional Standard Organisation; EN: European Norme; NF: Norme Franaise; AFNOR: Association Franaise de Normalisation). Junto con ellos se han redactado los procedimientos de preparacin de medios cultivo y reactivos necesarios para realizar los ensayos, de manera que hay una explicacin de cada uno de los aspectos de los procedimientos de anlisis. Los mtodos ISO (2 placas por dilucin, confirmacin de 5 colonias) suelen utilizarse como mtodos de referencia; y los mtodos NF (1 placa por dilucin, confirmacin de 3 colonias) se suelen emplear como mtodos de rutina, siendo los dos mtodos normalizados. Con el objetivo de uniformizar todos los procedimientos del laboratorio, se han redactado unos Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) que dan las instrucciones para la realizacin de todos estos documentos, tanto de mtodos de anlisis de alimentos como los de preparacin y control de calidad de los medios de cultivo y reactivos necesarios para ellos. Los Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) son un conjunto de instrucciones escritas de obligado y riguroso cumplimiento que describen cmo deben realizarse determinados mtodos de ensayo, como deben manejarse los equipos de anlisis o cmo se debe proceder ante cualquier otra actividad del laboratorio. Las normas ISO, EN, NF, AENOR (Asociacin Espaola de Normalizacin) se van elaborando y revisando de forma continua. Como este proceso suele ser bastante largo, es aconsejable consultar las siguiente pginas web: ISO: www.iso.ch EN: www.cenorm.be AFNOR: www.afnor.fr
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AENOR: www.aenor.es
Los esquemas que se presentan son un reflejo de los medios de cultivo y de todas las reacciones bioqumicas que en ellos se producen, al reflejar las caractersticas del medio y de las colonias que crecen en l. As, se puede saber rpidamente si el medio que se ha de utilizar se necesita en frascos, en tubos (con o sin campana) o en placas, conocer su color original y observar los cambios que sufre en el proceso.
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2. CULTIVO DE BACTERIAS
A) MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. a) Constituyentes habituales de un medio de cultivo: AGAR utilizado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. EXTRACTOS son concentrados en polvo, deshidratado, de parte de rganos o tejidos animales o vegetales para confeccionar el medio adecuado. PEPTONAS se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales. Son muy ricas en pptidos y aminocidos. FLUIDOS CORPORALES (sangre o plasma) Se aaden a los medios de cultivo porque contienen factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos microorganismos exigentes. SISTEMAS AMORTIGUADORES (fosfatos bisdicos y bipotsicos) se utilizan para mantener el pH del medio en un determinado valor. INDICADORES DE pH son indicadores cido-base con el objeto de detectar variaciones de pH. AGENTES REDUCTORES se aaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerfilos. AGENTES SELECTIVOS son sustancias que se adicionan para convertir al medio de cultivo en selectivo. b) Tipos de medios de cultivo: 1. Medios generales permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. 2. Medios de enriquecimiento favorecen el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. 3. Medios selectivos permiten el crecimiento de un tipo de microorganismo determinado, inhibiendo el desarrollo del resto. 4. Medios diferenciales ponen de relieve propiedades (normalmente bioqumicas) que un determinado microorganismos posee y de esa forma se puede distinguir ese microorganismo de otros que tambin pueden crecer en ese medio. 5. Medios de transporte y mantenimiento se utilizan en la recogida, transporte y conservacin de muestras microbiolgicas. Son medios no nutrientes (los microorganismos se mantienen pero no se multiplican), semislidos, que inhiben las reacciones enzimticas autodestructivas dentro de las clulas y evitan los efectos laterales de la oxidacin. c) Preparacin de medios de cultivo: En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente como productos liofilizados que es necesario hidratar. En general la preparacin de un medio de cultivo consiste en pesar la cantidad necesaria del polvo liofilizado, disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante y esterilizar la disolucin, previa comprobacin y correccin del pH si es necesario. Antes de ser esterilizados en autoclave, los medios lquidos se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces) y se tapan; en ningn caso la altura del lquido en
el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de ste. Si se trata de un medio que contenga agar (slido o semislido) suele ser preciso calentarlo (al bao Mara o al microondas) para fundir el agar antes de esterilizarlo en el autoclave. Una vez fundido se reparte, en caliente, en matraces o tubos (nunca en placas de Petri), se tapa y se esteriliza. Finalizada la esterilizacin en el autoclave: - los medios lquidos se dejan enfriar a temperatura ambiente. - los medios slidos contenidos en tubo deben inclinarse para que al solidifarse, adopten la forma de agar inclinado (slant), si tal es su finalidad. - la preparacin de los medios slidos en placa de Petri se realiza rellenando las placas con el medio estril fundido y atemperado a unos 50C en ambiente estril. El ambiente estril se consigue en la proximidad de un mechero Bunsen o en una campana de siembra adecuada. B) DILUCIONES DECIMALES Primero se prepara el MACERADO INICIAL. El procedimiento ms frecuentemente empleado para este fin consiste en la utilizacin de un homogenizador de paletas tipo "stomacher" en el cual se homogenizan diluyente y muestra y, de esta forma se prepara una suspensin ms o menos homognea de alimento y microorganismos que permite la preparacin posterior de las oportunas diluciones que posteriormente sern utilizadas en los diversos mtodos de recuento. Para ello se pesan aspticamente 10 g del alimento. La pesada suele realizarse en bolsa de plstico para stomacher. Se aaden a la bolsa 90 mL de diluyente estril y se homogeniza el alimento con el diluyente en Stomacher durante 2 minutos. As conseguimos el macerado inicial que es la dilucin 1:10. Si es posible es mejor pesar 25 g de alimento. Aadir 225 mL de diluyente estril y proceder como en el caso anterior homogenizando en Stomacher durante 2 minutos. Para preparar las DILUCIONES DECIMALES, aadir 1 mL de macerado inicial (tambin llamado dilucin madre o dilucin 1:10) a un tubo con 9 mL de diluyente, homogenizar usando un agitador excntrico de tubos de ensayo durante 20 segundos o agitando manualmente. De esta forma hemos preparado la dilucin 1:100 10 2. Repetir la operacin anterior transfiriendo 9 mL de la dilucin 1:100 a un tubo con 9 mL de diluyente para preparar la dilucin 1:1000 10 3. Repetir la operacin anterior tantas veces como sea necesario hasta conseguir el nmero de diluciones deseado. El nmero de diluciones que se necesita depende de lo contaminado que este el alimento. De un alimento del que se sospecha un nmero alto de microorganismos/g hay que hacer ms diluciones que de uno poco contaminado. Para los mtodos de ausencia / presencia no es necesario preparar las diluciones decimales, stas se utilizan para los mtodos de contaje. C) MTODOS DE SIEMBRA Siembra en masa Se caracteriza porque durante la incubacin las colonias crecen en el interior de la masa del agar. 1. Se deposita 1 mL de la muestra (si es lquida) o de cada dilucin en placas estriles, vacas. 2. Se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y mantenido a unos 47C.
3. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimientos circulares y de vaivn (siempre sin levantar la placa de la mesa). Con esto se consigue mezclar el inculo con el agar. 4. Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente (esperar al menos media hora) y se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubacin elegidos vara segn el tipo de microorganismos). 5. Pasado el tiempo de incubacin las colonias habrn crecido dentro del agar (en la masa del agar). Elegir de entre todas las placas las dos correspondientes a aquella dilucin que presenten un nmero de entre 30 y 300 colonias /placa (esto proporciona una precisin estadstica suficiente y no es engorroso de hacer). Para realizar el contaje, se utiliza un cuenta-colonias; se pone la placa de Petri con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando mediante un lpiz graso a lo largo de los dimetros. El nmero de unidades formadoras de colonia o UFC/g (o mL en muestras lquidas) de la muestra original ser: Nmero de UFC/g = Nmero de colonias x factor de dilucin 6. Siembra en superficie Se caracteriza porque durante la incubacin las colonias crecen en la superficie del agar. 1. Se utilizan placas previamente preparadas que contienen el medio de cultivo solidificado (unos 15 mL/placa). 2. Se deposita en la superficie del agar 0,1 mL de la muestra o de cada dilucin. 3. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas, usando un asa de Drigalski estril. 4. Esperar 2 3 minutos a que se seque el inculo. 5. Se llevan las placas a incubar y se procede de la misma manera que en el caso anterior. D) TOMA DEL INCULO Una vez que las colonias han crecido, puede ser necesario su confirmacin. Si la muestra proviene de un medio lquido, el inculo se toma agitando el suavemente el asa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensin superficial en el extremo del filamento del asa de siembra. Si el medio es slido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa Petri), tome una pequea porcin de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequea porcin de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colquelo en el soporte necesario.
E) TRANSFERENCIA La tcnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de recipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos: Siembra de medio lquido a medio lquido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos. Siembra de medio slido a medio lquido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos. Siembra de medio slido a medio slido: El procedimiento se puede realizar con asa o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en placa Petri, en superficie. Siembra de medio lquido a medio slido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en placa Petri, ya sea en superficie o por homogeinizacin.
1. Tcnica de transferencia en tubos de ensayo. Tcnica para medio lquido Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los microorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a la misma altura. Se sostienen con los dedos ndice, medio y anular apoyndolos en el dedo meique, y se los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualizacin de toda la superficie del cultivo. Con los dedos pulgar e ndice (como un lpiz) de la otra mano, se toma la pipeta estril o el mango de Koll con su aguja o asa en anillo y se esteriliza. Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el asa, de la siguiente manera: el tapn del tubo ms alejado del operador (que es el que contiene la muestra) entre el dedo meique y la palma de la mano; el tapn del tubo ms cercano al operador (que contiene el medio de cultivo estril) entre el meique y el anular. Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inculo; se siembra; se flamean nuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias de los tapones y se quema el asa. Como el inculo procede de un medio lquido, antes de realizar la transferencia se debe agitar el tubo para poner en suspensin a los microorganismos que pudieran estar depositados. Si la siembra se realiza en medio lquido, se agita el tubo sembrado para distribuir homogneamente el inculo. Para realizar la agitacin se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos ndice y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo ndice de la otra mano con una amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer rotar los tubos entre las palmas de las manos.
Tcnicas para medio slido. Cuando el medio de cultivo a sembrar es slido, se puede sembrar en superficie, en profundidad o en profundidad y superficie. 1) En superficie: a) Por estra: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inculo en el agua de condensacin que se acumula en esa parte, luego mover el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio. b) Por trazo: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar una lnea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior, sin ejercer presin para que no se rompa el medio. 2) En profundidad: a) Por puncin: El medio de cultivo que se emplea est solidificado en tubo en forma vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inculo rpidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La puncin se realiza en el centro del medio o excntricamente. 3) En profundidad y superficie: Por puncin y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estra en el pico de flauta. Tcnica de transferencia en placa Petri. La siembra en placa Petri, puede hacerse: 1) En superficie: a. Por estra central: Se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la introduccin del asa con la carga de microorganismos, inicindose la estra en el borde del medio ms alejado del operador y se la extiende hasta llegar al centro de la placa, luego se gira sta 180 y se contina realizando otra estra de la misma manera. Esta divisin evita el obstculo del borde de la placa
b. Por estra en cuadrantes: Se divide la placa en cuatro sectores y se siembra en estra cada uno de ellos, partiendo del borde de la placa hacia el centro. El cuadrante a sembrar debe ser el ms alejado del operador y el inculo en cada caso
puede ser el mismo (la misma especie) o distinto (diferente especie) para cada cuadrante.
c. Por diseminacin con esptula de Drigalsky: Se deposita sobre el medio slido contenido en la placa, una asada o una gota con pipeta del material a sembrar, que luego se extender por toda la superficie del medio con una esptula de DRIGALSKY. *La esptula se introduce inmediatamente despus de su uso en un recipiente para su esterilizacin en autoclave o en formaldehdo al 5 %.
d. Por diseminacin con hisopo: Se sumerge en el caldo de cultivo, se escurre el exceso de lquido sobre la pared interior del tubo y se estran ambas mitades de la placa de Petri, partiendo de los bordes hacia el centro, luego se gira 90 y se estran nuevamente ambas mitades, finalmente se gira 45 y se estran ambas mitades.
2) Por homogeneizacin: a. Tcnica de la siembra en tubo para volcar en placa: El inculo se introduce con el asa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo fundido y enfriado a 45 C en cantidad suficiente para cubrir la placa de Petri. Se homogeneiza por rotacin y se vuelca en la placa previo flameado de la boca del tubo. b. Tcnica del agar volcado: Se deposita el inculo con pipeta en el centro de la placa Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo fundido y enfriado a 45C. Se homogeneiza por rotacin para lo cual se le imprime a la placa movimientos circulares, en sentido horario y en sentido antihorario y movimientos rectilneos, horizontales y verticales. Se debe tener en cuenta que de las placas Petri preparadas con medio de cultivo para sembrar, debe eliminarse el agua de sinresis (condensacin) antes de efectuar dicha operacin. Para tal fin es aconsejable preparar las placas con 24 hs. De anticipacin y dejarlas invertidas a temperatura ambiente.
F) AISLAMIENTO El objeto es obtener cultivos en estado puro, operacin imprescindible y previa al estudio e identificacin de una especie bacteriana. Se pueden realizar aislamientos por mtodos generales y por mtodos especiales. 1) Mtodos generales de aislamiento. Estos mtodos utilizan medios de cultivos slidos en placa Petri: a. Por diluciones sucesivas: En general, para preparar diluciones seriadas, se parte de una solucin concentrada y se preparan series de diluciones al dcimo (1:10) o al medio (1:2). De esta manera se obtiene una serie de soluciones relacionadas por ejemplo por un factor de dilucin 10 es decir 1/10; 1/100; 1/1000 y as sucesivamente. O la otra serie es 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 etc. Por ejemplo: si partimos de sustancia (Solucin A): - Dilucin 1/10: 1ml agua= una solucin - Dilucin 1/2: 5 ml agua= una solucin una solucin de 50mg/ml de una de de de de la solucin A + 9 ml de 5 mg/ml (dilucin 1:10). la solucin A + 5 ml de 25 mg /ml (dilucin 1:2).
Se homogeneiza la muestra y se carga el asa por nica vez. Luego se pasa el asa de un tubo a otro. Estos tubos contienen agar a 45 C. De esta manera el primer tubo contendr mayor concentracin de microorganismos que el ltimo. Luego se pasa el contenido de los tubos a las placas Petri y de all a los tubos con agar en pico de flauta (slant o tubo inclinado). b. Por agotamiento en superficie en una placa: Es el mtodo ms utilizado. Se prepara una placa Petri con el medio de cultivo a la que se le elimina el exceso de humedad segn se indic anteriormente. Primero, se marca la parte exterior de la contratapa de acuerdo al esquema. Se carga el asa con la muestra, se deposita en un punto de la superficie del sector (I) cercano al borde, y se extiende en el mismo con estras prximas y paralelas. A continuacin se quema el asa y se deja enfriar. Se gira la placa 90 , se pasa el asa una vez sobre la ltima estra de la regin ya inoculada y se arrastra al sector (II)
efectuando sobre l la siembra sin superponer las estras con las realizadas antes.
Se quema nuevamente el asa y de la misma manera se estra el sector (III). Luego de quemar el asa, en el sector (IV) se realizan estras con el material que se arrastra de (III), ms amplias y que terminan en el centro de la placa. Cualquiera sea el mtodo empleado, si se realiza correctamente, podrn obtenerse colonias aislada. Estas pueden pertenecer a distintas especies bacterianas, las que generalmente se diferencian macroscpicamente. En general cada colonia se considera formada a partir de una clula bacteriana, aunque esto no es del todo cierto pues puede darse el caso de que dos o ms clulas den origen a una colonia. Si todas pertenecen a una misma especie, la colonia resultante ser pura. Caso contrario, la finalidad del trabajo no se habr cumplido, no logrndose el aislamiento. Para comprobar la pureza de la colonia aislada se puede realizar una coloracin de Gram. Para ello se pica la colonia y se la identifica con una marca en el fondo de la placa con un nmero identificatorio. Se hace el extendido con una porcin de la colonia y si todas las clulas observadas coinciden morfolgicamente, se repica el resto de la colonia en un tubo con agar en estra para obtener un cultivo puro. A veces la igualdad morfolgica en la coloracin de Gram resulta engaosa por existir bacterias de diferentes especies (pero iguales morfolgicamente) presentes dentro de la colonia seleccionada pero en muy bajo nmero debido a su imposibilidad de desarrollar. Por consiguiente es necesario realizar siempre aislamiento para observar la uniformidad de las colonias.
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2) Mtodos especiales de aislamiento. Mtodos derivados de las propiedades de las bacterias: Consisten en hacer desarrollar la mezcla bacteriana, en un medio de cultivo especial, donde una especie puede dar lugar a colonias de un color que la identifiquen (ya sea por cambios de pH o por precipitacin de elementos del medio). Un ejemplo, es el aislamiento en el llamado agar- lactosa- verde-brillante- bilis, donde las bacterias coliformes dan colonias color rojo intenso en el centro con un halo rosado que destacan del fondo azul del medio. a. Mtodos biofsicos: Se basan en el empleo de condiciones fsicas determinadas que afectan a ciertos microorganismos y no a otros. Empleo de temperaturas disgensicas: La mayora de las bacterias desarrollan bien a 37C. Sin embargo hay especies que lo hacen hasta 40C -42C y an ms, otras por debajo de 35 C. Estas caractersticas se pueden usar para la separacin de especies. Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Los esporos de las bacterias son formas de resistencia que toleran temperaturas que resultan letales para las formas vegetativas. Este comportamiento se aprovecha para la separacin de las especies que tienen la capacidad de esporular. Movilidad del microorganismo: Las bacterias mviles desarrollan en gran parte de la superficie del medio, mientras que las inmviles lo hacen solo en el punto de siembra. b. Mtodos biolgicos: Estos mtodos utilizan la propiedad que tienen ciertos animales de laboratorio de ser receptivos a algunos microorganismos.
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3. PRINCIPALES MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS
A. MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS El anlisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y nmero de microorganismos es bsico para la microbiologa de alimentos. Sin embargo ninguno de los mtodos utilizados habitualmente permite determinar el nmero exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los mtodos bsicos utilizados para investigar el nmero total de microorganismos: 1.- Recuento en placa (SPC) para la determinacin del nmero de clulas viables 2.- Mtodo del nmero ms probable (NMP) de grmenes como clculo estadstico del nmero de clulas viables 3.- Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de clulas viables con capacidad reductora 4.- Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como para las no viables El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin del nmero de clulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en funcin de uno de los siguientes factores: - mtodo de muestreo utilizado - distribucin de los microorganismos en la muestra - naturaleza de la microflora del alimento - naturaleza del alimento - antecedentes del alimento - adecuacin nutricional del medio de cultivo - temperatura y medio de incubacin - pH, aw, potencial de oxidacin reduccin del medio - tipo de diluyente utilizado - nmero relativo de microorganismos en la muestra Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmsfera, la composicin del medio y el tiempo de incubacin. El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de 34 C a > 90 C. En funcin de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos: a) los que crecen bien a 7 C o por debajo de esta temperatura cuya temperatura: psicrtofos
b) los que crecen entre 20 30 C, con una temperatura ptima de crecimiento est entre 30 40 C: mesfilos c) los que crecen por encima de los 45 C: termfilos Recuento de aerobios mesfilos En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin, las condiciones higinicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patgena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentacin, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: - Excesiva contaminacin de la materia prima - Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin - La posibilidad de que existan patgenos, pues estos son mesfilos - La inmediata alteracin del producto El recuento de mesfilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos. Mtodos normalizados ISO 4833 Directiva general para el recuento de microorganismos. Mtodo por recuento de colonias a 30 C Este mtodo se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, vertido en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es lquido, o con una cantidad determinada de suspensin madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensin madre. Incubacin a 30 C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir del nmero de colonias obtenidas en las placas de Petri, calcular el nmero de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra. AF V 08-01 Mtodo de rutina para el recuento de microorganismos. Mtodo de recuento de las colonias a 30 C Este mtodo se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, vertido en una placa de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es lquido, o con una cantidad determinada de suspensin madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensin madre. El recuento podr ser realizado utilizando un sembrador espiral (NF V08-100) Incubacin a 30 C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir del nmero de colonias obtenidas en las placas de Petri escogidas, calcular el nmero de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra.
ESQUEMA:
A EROBI OS M ESFI LOS

ISO4833 AF V 08-051
10 g muestra + 90 ml agua peptona
10-1
Diluciones decimales
1ml 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4
Agar PCA Incubacin 30C / 72 h
Recuento de colonias
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B. MOHOS Y LEVADURAS Los hongos son organismos eucariticos, cuya pared celular contiene quitina y glucanos. Son unicelulares o filamentosos, de reproduccin sexual o asexual, saprfitos mutualistas o parsitos. En funcin de la temperatura de crecimiento se dividen en: - termfilos: 20 50 C (40 50 C) - termolatentes: mximo 50 C, mnimo por debajo de 20 C - mesfilos: 10 40 C (20 35 C) - psicrfilos: por debajo de 10 C (por debajo de 20 C) Los hongos engloban los mohos y las levaduras. Los mohos son multicelulares filamentosos cuyo crecimiento en un alimento se reconoce por su aspecto aterciopelado. Las levaduras crecen en agregados de clulas independientes, cuando crecen en los alimentos forman colonias caractersticas. Mohos habitualmente transmitidos por los alimentos: Divisin: Zygomyceta Clase: Zygomycetes Orden: Mucorales Familia: Mucoraceae Gnero: Mucor, Rhizopus, Thamnidium Divisin: Ascomyceta Clase: Pleitomycetes Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae Gnero: Byssochlamys, Eupnicillium, Emericella, Eurotium Divisin: Deuteromyceta Clase: Coelomycetes Familia: Coelomycetaceae Gnero: Colletotrichum Clase:Hypomycetes Orden: Hypomycetales Familia: Moniliaceae Gnero: Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Penicillium,..... Levaduras habitualmente transmitidos por los alimentos: Divisin: Ascomycotina Familia: Saccharomycetaceae SubFamilia: Nadsonioideae Gnero: Hanseniaspora SubFamilia: Saccharomycotoideae Gnero: Debaryomyces, Issatchenkia, Kluyveromyces, Saccharomyces, ................
SubFamilia: Schizosaccharomycotoideae Gnero: Schizosaccharomyces Divisin: Deuteromycotina Familia: Crypteococcaceae Gnero: Brettanomyces, Candida, Crytococcus............... El significado de la contaminacin fngica de los alimentos viene determinado por su capacidad para deteriorar los alimentos, produciendo defectos en el aspecto modificaciones qumicas, alterando el valor nutricional, variando sus caractersticas organolpticas y dificultando su conservacin. Algunos mohos pueden producir infecciones en el hombre e incluso reacciones alrgicas. Adems, muchos mohos producen gran nmero de toxinas a las que el hombre es susceptible. Las micotoxinas son un grupo de metabolitos txicos, producidos por ciertas cepas de mohos cuando crecen en unas condiciones determinadas, en una amplia variedad de alimentos. El estudio de los mohos productores de micotoxinas ha sido bastante completo debido a: - la ubicuidad de sus esporas - que pueden estar presentes en alimentos organolepticamente aceptables - que los alimentos constituyen un sustrato orgnico adecuado para su crecimiento. Estos mohos producen micotoxinas que al ser ingeridas por los animales originan metabolitos txicos secundarios, que pasan a la leche, carne o huevos y son absorbidos indirectamente por el hombre - al riesgo cancergeno, sobre todo de las aflatoxinas Toxicolgicamente nos interesan ms las micotoxinas y los factores que puedan afectar la capacidad de su produccin, que los mohos productores. En la mayora de los casos las intoxicaciones son producto de la accin combinada de varias micotoxinas. Rara vez un alimento es contaminado por una sola especie y cada especie suele producir varias micotoxinas. Los alimentos que ms fcilmente son contaminados por micotoxinas y las micotoxinas ms frecuentes son: 1.- Semillas oleaginosas y alimentos derivados 2.- Aceites vegetales no refinados 3.- Cereales y alimentos derivados 4.- Frutos secos 5.- Zumos de frutas 6.- Legumbres 7.- Bebidas alcohlicas 8.- Leche y productos lcteos 9.- Carne y productos crnicos Para la prevencin y control sanitario de las intoxicaciones por micotoxians es necesario: - conocer los factores que afectan al crecimientos de los mohos y a la produccin de las micotoxinas - conocer el periodo entre la germinacin y la produccin de micotoxinas, para estimar el potencial txico del alimento - evitar la contaminacin - evitar, durante la manipulacin, las posibles lesiones de los granos y las frutas
mantener unas condiciones de almacenamiento que eviten en lo posible el crecimiento de los mohos
El recuento de mohos y levaduras es un ndice de las condiciones higinicas de una materia prima y de las condiciones de manipulacin. Su significado es similar al de los aerobios mesfilos. Mtodos normalizados ISO 7954 Directiva general para el recuento de levaduras y mohos. Tcnica de enumeracin de las colonias a 25 C Este mtodo se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo selectivo determinado, en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es lquido, o con una cantidad determinada de suspensin madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensin madre. Incubacin de las placas en aerobiosis a 25 C, durante 3, 4 5 das. Clculo del nmero de levaduras y mohos por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de colonias obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilucin que dan un resultado significativo. NF V 08-059 Mtodo de rutina para el recuento de levaduras y mohos. Tcnica de enumeracin de las colonias a 25 C Este mtodo se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo definido, repartido en placas de Petri, con una cantidad definida de muestra por ensayo si el producto a examinar es lquido, o con una cantidad determinada de suspensin madre en el caso de otros productos. El recuento puede ser igualmente realizado en profundidad. Incubacin de las placas en aerobiosis a 25 C, durante 3, 4 5 das. En el caso de recuento de especies de mohos supuestos conocidos la temperatura de incubacin puede ser diferente de 25 C, buscando despus el acuerdo entre las dos partes (20 C 22 C) e indicndolo en el informe del ensayo. A partir del nmero de colonias obtenidas en las placas de Petri retenidas, calcular el nmero de levaduras y mohos por mililitro o por gramo de muestra.
17
ESQUEMA:
M OHOS Y LEVA DURA S

ISO7954 AF V 08-059
10-1
1ml 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4
Incubacin 25C / 5 das
Agar Saboureaud
Recuento de mohos y levaduras
18
C. ENTEROBACTERIAS Cada vez es ms frecuente recurrir a la determinacin de microorganismos indicadores para determinar la inocuidad de un alimento. Estos indicadores deben cumplir una serie de requisitos: - fcil y rpido de detectar - fcilmente diferenciable de otros representantes de la flora de un alimento - tener antecedentes de asociacin con el patgeno del que es indicador - ser un microorganismos con cifras, que en teora coincidan con las del patgeno a indicar - tener condiciones y velocidad de crecimiento semejantes a las del patgeno - tener una tasa de muerte paralela a del patgeno y que persista algn tiempo ms que este - no existir en alimentos exentos del patgeno, salvo en cantidades mnimas Actualmente se reconocen 29 gneros de enterobacterias, que incluyen ms de 100 especies diferentes. El 99% de los aislamientos clnicos pertenecen nicamente a 23 especies. Atendiendo a su poder patgeno se dividen en dos grupos: - Enterobacterias patgenas: EScherichia coli enteropatgeno, Shigella, Salmonella, Yersinia - Enterobacterias oportunistas: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Hafnia, Edwardsiella, Providencia, Morganella El recuento total de enterobacterias se utiliza como indicador de contaminacin fecal, y como uno de los indicadores de Buenas Prcticas de Fabricacin. Se utiliza como indicador de la calidad microbiolgica de alimentos procesados, y recuentos elevados sealan una elaboracin inadecuada o una contaminacin posterior, o ambas cosas a la vez; siempre implica un riesgo higinico-sanitario. Mtodos normalizados ISO 7402 Directiva general para el recuento, sin revivificacin, de las Enterobacteriaceae. Tcnica del NMP y mtodo por recuento de colonias Esta directiva expone dos mtodos para el recuento de enterobacterias. El primero de ellos se recomienda utilizar en muestras que se sospecha que presentan contaminacin baja (1 100 por mililitro o gramo de muestra). Para ello se siembran en tres tubos de medio de doble concentracin, una cantidad determinada de la muestra problema si la muestra es lquida o una cantidad determinada de la suspensin madre en el caso de los otros productos. Despus y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con medio de concentracin simple con la primera dilucin decimal obtenida a partir de la muestra problema o de la suspensin madre. Los tubos se incuban a 35 C 37 C (segn acuerdo) durante 24 horas. A partir del nmero de tubos positivos confirmados se calcula el nmero ms probable de Enterobacteriaceae por mililitro o por gramo de muestra de ensayo mediante la tabla NMP. El segundo mtodo se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta glucosa, en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a examiANALIZA CALIDAD Departamento de Formacin 19
nar, si el producto es lquido o una cantidad determinada de la suspensin madre en el caso de los otros productos. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensin madre. Incubacin de las placas a 35 C 37 C durante 24 horas +/- 2 horas. Clculo del nmero de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del nmero de colonias caractersticas confirmadas obtenidas en las placas de Petri NF V 08-054 Mtodo de rutina para la enumeracin de Enterobacteriaceae mediante el recuento de colonias Este mtodo se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta glucosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a examinar, si el producto es lquido o una cantidad determinada de la suspensin madre en el caso de los otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensin madre. Incubacin de las placas a 30 C durante 24 horas +/- 2 horas. Clculo del nmero de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del nmero de colonias caractersticas confirmadas obtenidas en las placas de Petri.
20
ESQUEMA:
enteroba cteri as
ISO7402 AF V 08-054
10-1
1ml 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4
Incubacin 30C / 24 horas
Agar VRBG + 2 capa
Recuento. Colonias Rosas
21
D. COLIFORMES TOTALES En conjunto los coliformes estn representados por cuatro gneros de la familia Enterobacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, y Klebsiella. Todos ellos son fermentadores de la lactosa en 48 horas. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, y tambin en el suelo, las plantas, etc. No son muy buenos como indicadores, pero se utilizan como indicadores de contaminacin fecal y son buenos indicadores de un proceso o de un estado sanitario poco satisfactorio. En un recuento de coliformes es conveniente determinar la incidencia de E. coli dado que es la especie ms indicativa de una contaminacin fecal. Hay que destacar que el recuento de coliformes tiene sus limitaciones como indicador en ciertos alimentos: - Productos lcteos: reflejan el estado higinico del establo y de la planta industrial, no es indicador de contaminacin fecal - Hortalizas congeladas blanqueadas: la presencia de E. coli puede ser indicativo de que en el proceso existe algn problema. Los coliformes estn habitualmente asociados con la vegetacin - Derivados de aves de corral: los coliformes no son indicadores higinicos apropiados, las aves pueden tener salmonella antes del sacrificio A pesar de todo lo anterior, los coliformes tienen un valor acreditado como indicadorres de inocuidad. Su principal aplicacin como integrantes de un programa para la determinacin de la inocuidad de los alimentos la tienen dentro del sistema APPCC. Pueden crecer en presencia de sales biliares, que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram negativas. Son capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas, siendo esta caracterstica suficiente para hacer determinaciones presuntivas. Su facilidad de cultivo y de diferenciacin los hace casi ideales como indicadores. Mtodos normalizados I SO 4831 Directiva general para el recuento de coliformes Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de doble concentracin con una cantidad determinada de la muestra si es lquida, o una cantidad determinada de la suspensin madre en el caso de otros productos. A continuacin, se siembran tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de concentracin simple con una cantidad determinada de la muestra si es lquida, o una cantidad determinada de la suspensin madre en el caso de otros productos. Despus y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concentracin simple con una cantidad determinada de la primera dilucin decimal obtenida a partir de la muestra problema o de la suspensin madre. Los tubos se incuban a 30, 35 37 C durante 24 horas para los de doble concentracin, y 24 48 horas los de concentracin simple. A partir de cada tubo incubado que presenta desprendimiento de gas en la campana se inocula con asa un tubo con medio de confirmacin (BGBL). La reaccin es positiva cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Duirham,
como consecuencia de la fermentacin de la lactosa en presencia de sales biliares. Se realizan las lecturas a las 24 48 horas. A partir del nmero de tubos positivos confirmados se calcula el nmero ms probable de coliformes por mililitro o por gramo de muestra de ensayo. NF V 08-050 Mtodo de rutina para la enumeracin de coliformes mediante el recuento de colonias a 30 C. Se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta lactosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra si es lquida, o una cantidad determinada de la suspensin madre en el caso de otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra o de la suspensin madre. Incubacin de las placas a 30 C 24 horas. Clculo del nmero de coliformes por mililitro o por gramo de muestra, a partir del nmero de colonias caractersticas obtenidas en las placas de Petri.
23
ESQUEMA:
Coli form es tota les
ISO4831
10 ml 10 ml 1 ml
10-1 10-2
Caldo lactosado (con campana Durham) 37C / 48 horas Gas = +
Confirmacin
24
Coli form es tota les

Confirmacin
Tubos positivos Asa de siembra Tubos con Caldo Verde brillante con campana Durham 45C / 24 horas Gas = +
ISO4831
COLI FORM ES TOTA LES
NF V 08-050
10-1
1ml 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4
Agar VRBA Incubacin 30C / 24 horas
25
E. ESCHERICHIA COLI Escherichia coli es un coliforme fecal. Los coliformes fecales son un grupo de microorganismos seleccionados por incubacin de los inculos procedentes de un caldo de enriquecimiento de coliformes a temperaturas superiores a las normales (44 +/-0,5 C) y son muy indicativos de una posible contaminacin de origen fecal del alimento. Se definen por la produccin de cido y de gas en caldo EC a 44 46 C (44,5 45,5 C). Las cepas enterohemorrgicas de E. coli no crecen a 44,5 C en la formulacin convencional de EC, pero lo hacen cuando el porcentaje de sales biliares se reduce del 0,15 al 0,112%. Slo unas pocas cepas son patgenos verdaderos, enteropatgenos; o patgenos oportunistas. Es muy resistente en suelo y agua. Muere a 60 C en 15 minutos, y con 0,5 p.p.m. de cloro. Vive en el tracto intestinal del hombre y animales, por eso su presencia en un alimento indica contaminacin directa o indirecta de origen fecal. Es indicador de posibles patgenos entricos en el agua, moluscos, productos lcteos,..... Mtodos normalizados ISO 7251 del NMP Directiva general para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Tcnica
Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de enriquecimiento selectivo de doble concentracin con una cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o una cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. A continuacin se siembran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentracin simple con una cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o una cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. Despus y en las mismas condiciones se siembran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentracin simple con la primera dilucin decimal obtenida de la muestra problema o de la suspensin madre. Los tubos se incuban a 35 37 C segn acuerdo durante 24 48 horas, y se realiza el examen en busca de tubos con gas. A partir de cada tubo que muestra desprendimiento de gas se inocula un tubo con medio selectivo lquido EC. La reaccin es positiva cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Durham, como consecuencia de la fermentacin de la lactosa en presencia de sales biliares a 45 C. Se hacen las lecturas a las 24 y 48 horas. A partir del nmero de tubos positivos en medio selectivo EC se siembra una nueva serie de tubos con agua de triptona. Incubacin a 45 C, 24 48 horas y se examina la produccin de indol. A partir de los tubos positivos a la produccin de gas en medio selectivo y a la produccin de indol en agua de triptona, se calcula el nmero ms probable de E. coli por mililitro o gramo de muestra de ensayo. NF V 08-053 Mtodo de rutina para el recuento de Escherichia coli -glucuronidasa positivos Este mtodo se basa en la siembra en profundidad con el medio agar PTX o PTG, en una placa de Petri con una cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o una cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. En las mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensin madre. Incubacin de las placas a 44 C durante 18 24 horas. Clculo del nmero de Escherichia coli por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de colonias caractersticas obtenidas en las placas de Petri.
ESQUEMAS:
Escheri chi a coli
ISO7251
10 ml 10 ml 1 ml
10-1 10-2
Lauril triptosa (con campana Durham) 37C / 48 horas Gas = +
Confirmacin
27
Escheri chi a coli

Confirmacin
Tubos positivos Asa de siembra Tubos con Caldo EC con campana 45C / 24 horas Gas = +
ISO7251
Tubos positivos Asa de siembra Agua de triptona 37C / 24 horas 0,5 ml reactivo Kovacs Amarillo -
Prueba del indol
Rojo +
28
Escheri chi a coli
NF V 08-053
10-1
1ml 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4
Agar CROMOGNICO
Colonias Violceas
29
F. STAPHYLOCOCCUS AUREUS Staphylococcus aureus es un microorganismo de distribucin en el medio ambiente muy amplia, se encuentra de forma natural en el hombre, los animales de granja, el polvo y diversos alimentos y otros productos en los que la contaminacin se debe principalmente a los manipuladores. El principal problema a nivel de la microbiologa de los alimentos es que S. aureus puede producir una enterotoxina termoestable, y otras toxinas. Estas toxinas actan sobre receptores intestinales cuyo estmulos alcanzan el centro del vmito del cerebro, por lo que deberan considerarse como neurotoxinas. El mayor inconveniente de estas toxinas es su elevada resistencia a los tratamientos trmicos habituales, soportando tratamientos de pateurizacin a 72 C / 13 segundos, e incluso 100 C / 30 minutos. Se inactivan a temperaturas de esterilizacin de 115 C, resisten la irradiacin y las enzimas proteolticas. Para la produccin de toxinas en un alimento tienen que concurrir los siguientes requisitos: - contaminacin del alimento por Staphylococccus aureus: en origen, por los manipuladores o por falta de higiene en locales o utensilios - la multiplicacin de una cepa enterotoxignica del microorganismo en el alimento alcanzando al menos 106 clulas por gramo. Staphylococcus auerus se multiplica en alimentos proteicos, soporta concentraciones normales de azcar e incluso elevadas de sal y el tratamiento con nitritos. Mtodos normalizados ISO 6888 Directiva general para el recuento de Staphylococcus aureus. Mtodo mediante enumeracin de colonias Este mtodo se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo slido, preparando dos series de placas, con una cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o una cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. En las mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensin madre. Incubacin de las placas a 35 C durante 24 48 horas. Clculo del nmero de Staphylococcus aureus por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de colonias caractersticas obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilucin que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa. NF V 08-057-1 Mtodo de rutina para la enumeracin de estafilococos cuagulasa positivos mediante recuento de colonias a 37C. Tcnica de confirmacin de las colonias. Este mtodo se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo slido selectivo, repartido en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o una cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. Incubacin de las placas a 37 C durante 24 48 horas. Clculo del nmero de estefilococoscogulasa positivos por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de colonias caractersticas y/o no caractersticas obtenidas en las placas escogidas a los rdenes de dilucin que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa.
MTODOS:
Staphylococcus aureus
ISO6888 AF V 08-057 - 1
10-1
1ml 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4
Asa de Dirglasky Placas de Baird - Parker
Colonias Negras o Grises con zona parcialmente opaca
Confirmacin
31
Staphylococcus aureus
Confirmacin
Asa de siembra Caldo Cerebro Corazn 37C / 24 horas Caldo RM -VP

Prueba de la acetona
Prueba de la coagulasa
1 ml caldo + 0,3 ml A + 0,1 ml B 15 min 0,5 ml caldo + 0,5 ml plasma conejo Rojo fresa = +
37C / 24 horas Coagulacin = + 37C / 24 horas
32
G. SALMONELLA El gnero Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias y constituye un grupo muy complejo de microorganismos patgenos para el hombre, pudiendo afectar a diversos animales. Comprende dos especies: Salmonella enterica dividida en seis subespecies Salmonella bongori
Todas ellas se pueden identificar por caractersticas fenotpicas fciles de ver. Mtodos normalizados ISO 6579 Directiva general concerniente a los mtodos de investigacin de Salmonella. Este mtodo se basa en las investigacin de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: . Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agau de peptona tamponada e incubacin a 37 C (35 C) durante 16 20 horas . Enriquecimiento en medios selectivos lquidos: Con el cultivo del preenriquecimiento siembre en verde malaquita con cloruro de m,agnesio e incubacin a 42 C 24 horas, y en caldo selenito cistina e incubacin a 37 C 24 horas y 24 horas suplementarias. . Aislamiento e identificacin: A partir de los cultivos anteriores se siembran dos medios slidos, agar rojo fenol verde brillante y otro medio selectivo a eleccin. Ambos se incuban a 37 C 24 horas y si es necesario 48 horas. . Confirmacin: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirmacin en los medios de ensayos bioqumicos y serolgicos apropiados. V 08-052 Mtodo de rutina para la investigacin de Salmonella
Este mtodo se basa en las investigacin de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: . Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agua de peptona tamponada e incubacin a 37 C durante 16 20 horas . Enriquecimiento en medios selectivos lquidos: Con el cultivo del preenriquecimiento siembra en caldo verde malaquita con cloruro de magnesio e incubacin a 42 C 24 horas, y en caldo selenito cistina e incubacin a 37 C 18 24 horas. . Aislamiento e identificacin: A partir de los cultivos anteriores se siembra en un medio slido selectivo a eleccin. Se incuba a 37 C 24 horas y si es necesario 48 horas y se examinan las caractersticas de las colonias. . Confirmacin: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirmacin en los medios de ensayos bioqumicos y serolgicos apropiados.
33
ESQUEMAS:
sa lm onella
ISO6579 AF V 08-052
25 g muestra + 225 ml agua peptona 37C / 20 horas 0,1ml Caldo Rappaport 42C / 24 horas
XLD Hektoen XLD Hektoen
2 ml Caldo Selenito - Cistina 37C / 24 horas
Colonias Negras
34
sa lm onella
Colonias Negras
Confirmacin
Asa de siembra: siembra en estra por agotamiento Agar nutritivo 37C / 24 horas
Tira API
37C / 20 horas
35

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10 g muestra + 90 ml agua peptona

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