RECUENTO DE BACTERIAS MESOFILAS AEROBIAS PNT-AL-002 Basado en el Bacterial Analytical Manual, 2003. Chapter 3, la norma ISO 4833 y NTC4075.

1. Definicin: Las bacterias mesfilas aerobias se definen como un grupo heterogneo de bacterias capaces de crecer entre 15 y 45oC, con un rango ptimo de 35oC, en la industria de alimentos es considerado como el grupo indicador ms grande que existe. Este grupo es utilizado como indicador de vida til en productos procesados. Para este recuento se utilizan medios de cultivo sin inhibidores que permiten el crecimiento de los microorganismos. Este recuento no se hace en productos enlatados ni productos fermentados ya que por la naturaleza de estos alimentos, el recuento no sera representativo, tampoco es til para recuperar microorganismos patgenos que sufre daos subletales. Un recuento alto en alimentos estables indica materias primas contaminadas o tratamientos no satisfactorios; en productos perecederos pueden indicar condiciones inadecuadas de tiempo/temperatura durante su almacenamiento. En alimentos deshidratados y en los congelados, siempre se obtienen recuentos de bacterias viables ms bajos. As, un recuento en placa no puede reflejar la calidad bacteriolgica de la materia prima antes de los procesos o tratamientos correspondientes, y por ello, es necesario llevar un examen microscpico directo para comprobar si, efectivamente, en un principio existan o no abundantes microorganismos Los recuentos de bacterias mesfilas son de escaso valor a la hora de predecir la vida til de un alimento conservado en refrigeracin, ya que muchos microorganismos mesfilos no crecen a temperaturas por debajo de los 5oC. Para esta finalidad se utiliza el recuento de Bacterias Psicrtrofas. 2. Materiales: 6 cajas de petri estriles 3 pipetas de 1 mL estriles o una pipeta automtica (100-1000 uL) 1 Frasco de dilucin con 90 ml o 99 mL de agua peptonada bufferada 2 tubos de 16 por 150 mm tapa rosca con 9 mL de agua peptonada bufferada Marcador de vidrio Solucin de 2,3,5 cloruro trifenil tretrazolio (TTC) al 0.5% 3. Medios de cultivo 120 mL de agar Plate Count o Standard Methods 30 mL de Agar Blanco (agar-agar) 4. Equipos Pipeteador Incubadora a 35o +/- 2oC Contador de colonias Balanza con sensibilidad de 0.1 g 5. Siembra * Hacer diluciones en base 10 del alimento de acuerdo al tipo de producto (s es un alimento crudo deben realizarse diluciones altas y en productos procesados diluciones bajas) (Ver instructivo PNT-AL 01) * Sembrar en profundidad por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones seleccionadas, siempre trabaje tres diluciones sucesivas. * Adicionar de 15-20 mL de agar Plate Count (el cual debe estar a una temperatura de aproximadamente 45oC), el tiempo transcurrido entre la adicin de la muestra a las cajas de Petri y la adicin de agar no debe sobrepasar los 20 minutos (preferiblemente, 10 min) NOTA 1: algunos alimentos en el momento de la dilucin resultan en la produccin de gran cantidad de partculas (por ejemplo la avena en hojuelas) en la caja de petri, que 11

RECUENTO DE BACTERIAS MESOFILAS AEROBIAS PNT-AL-002 Basado en el Bacterial Analytical Manual, 2003. Chapter 3, la norma ISO 4833 y NTC4075. hacen difcil distinguir entre las colonias y estas partculas, este problema puede ser resuelto adicionando 1 mL de TTC al 0.5% por 100 mL de medio, (el TTC no se esteriliza en autoclave, se adiciona al medio antes de servirlo, nunca cuando esta caliente por ser un agente de oxido-reduccin) Las colonias tomar un color morado que permite diferenciarla de restos de alimentos * Mezclar inmediatamente las cajas con el medio de acuerdo a los siguientes movimientos (cada uno de estos movimientos se debe hacer mnimo 5 veces)

* Dejar solidificar, si se sospecha la presencia de colonias invasivas sobre la superficie del medio, adicionar una capa sellante de agar blanco de aproximadamente 5 ml sobre la caja, dejar solidificar nuevamente. * Incubar a 35 +/- 2oC durante 48 horas 6. Recuento Contar las colonias de aquellas cajas que contengan un mximo de 300, con la ayuda del contador de colonias (si no tiene un contador puede utilizar una superficie oscura para mejorar la visibilidad de las colonias). 7. Expresin de resultados: 7.1 Criterio de seleccin: cuando se va ha realizar el recuento se debe seleccionar una de las diluciones para bacterias mesfilas aerobias el rango que se utiliza es de 30-300 colonias. (A.P.H.A) * Una vez obtenido el recuento de cada caja se saca el promedio y se multiplica por el inverso de la dilucin. Ejemplo Se hizo un recuento de ponqu tajado y la dilucin seleccionada fue 10-5, en la caja 1 se contaron 59 colonias y en la caja 2 se contaron 57 colonias el resultado obtenido es: 59 + 57 = 116 se saca el promedio. 116/2 = 58, este se multiplica por el inverso de la dilucin es decir 105, para el resultado siempre se informan dos nmeros enteros y el resto en exponente: en este caso ser 58 x 105 UFC (Unidades formadoras de colonias)/g de alimento analizado. El ICONTEC basndose en el comit de microbiologa de ISO (Organizacin internacional para la estandarizacin, ha establecido la norma tcnica NTC 4075, para la industria de alimentos, esta sugiere trabajar con un solo digito y el resto en exponente, en el ejemplo anterior se informara 5,8 x 106 m.o./g, adicionalmente no se expresan UFC, sino microorganismos. Es frecuente que al realizar las diluciones se den condiciones diferentes y no se caiga dentro del rango o por el contrario se den mas de dos diluciones dentro de este rango, en este caso existen diferentes reglas las cuales se presentan en la tabla 1. Tenga en cuenta que estos son casos particulares que se aplican en la industria de alimentos. Existen casos en los cuales puede aparecer un colonia que se difunde sobre la superficie de la caja cubriendo la mitad de esta, en este caso se cuenta la otra mitad (siempre que el inculo este bien homogenizado) y se multiplica por 2 se saca el promedio de las cajas y se multiplica por el inverso de la dilucin si cubre mas de la mitad de caja , realice cuadrculas, de un cm2, si hay menos de 10 colonias por cm2, cuente al menos 13 cuadrados y multiplique por 5, (el rea de una caja de petri Standard es de 65 cm2), informe el resultado como conteo estimado (C.E.).

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RECUENTO DE BACTERIAS MESOFILAS AEROBIAS PNT-AL-002 Basado en el Bacterial Analytical Manual, 2003. Chapter 3, la norma ISO 4833 y NTC4075. Si todas las placas contienen menos de 30 colonias: retenga la caja con la dilucin ms concentrada, cuente y promedie los resultados, multiplique por el inverso de la dilucin y reporte como conteo estimado (C.E.). Tabla 1. Variantes en el recuento de bacterias mesfilas aerobias.
Variante Qu hacer? Cuando caen dos Se colocan los ceros a diluciones en el mismo cada una de las rango. diluciones y se procede a dividir el numerador ser la dilucin mas diluida y el denominador la mas concentrada, si da mayor de dos se coloca la mas concentrada y si es menor de dos el promedio de estas Ejemplo Se hizo el recuento de una torta los resultados obtenidos fueron: 10-1 : 236 Y 238 10-2: 36 Y 38 10-3: 2 Y 3 2360 + 2380= 4740/2= 2370 3600 + 3800= 7400/2= 3700 3700/2370 = 1.56 por se menor de dos se saca el promedio de las dos diluciones. 3700+2370 = 3035, que en exponente es igual a 30 X 102 UFC/g de alimento analizado. Se hizo el recuento en una merengada de chocolate los resultados obtenidos fueron: 10-1 : 246 Y 242 10-2: 88 Y 96 10-3: 5 Y 3 2460 + 2420 = 4880/2 = 2440 8800 + 9600 = 18400/2 = 9200 9200/2440 = 3,77 por ser mayor a 2, se informa la dilucin mas concentrada: 24 x 102 UFC/mL Ejemplo 1. Se hizo un recuento en un tamal tolimense y los datos obtenidos son los siguientes: 10-1: Mayor de 1.600 10-3 Mayor de 1.600 10-4 Mayor de 1.600 En este caso se toma la ltima dilucin y se informa de la siguiente manera: 16 x 106 U.F.C/ g de producto analizado C.E: (conteo estimado). NOTA. TENGA EN CUENTA QUE CUANDO SUCEDE ESTO, EXISTIO UNA FALLA AL ESCOGER LAS DILUCIONES QUE SEMBRO, LOS MAS IMPORTANTE ES QUE NO DEBEN EXISTIR LOS INCONTABLES, SIEMPRE DEBE DAR UNA DATO NUMERICO, RECUERDE EN MICROBIOLOGIA LOS INCONTABLES NO EXISTEN. Ejemplo 2. Se hizo el recuento de un jugo de pia, donde se obtuvieron los siguientes recuentos: 10-1: Mayor de 1.600 10-2: Mayor de 1.600 10-3 Caja 1: 1/8 135 y en la caja 2: 1/8 147 Se toma y se multiplica por ocho ya que este fue el resultado en cada octavo. 135 x 8 = 1080 y 147 x 8 = 1176, se saca el promedio. 1080 + 1176 = 2256/2 = 1128, se informa de la siguiente manera: 11 x 10 5 UFC/ ml de alimento analizado. C.E: (Conteo estimado) Si en la dilucin ms Se informa como menor Ejemplo 1. Se hizo el recuento de una pasta de tomate donde los resultados concentrada no aparecen de 1 y se multiplica por obtenidos fueron: microorganismos el inverso de la dilucin. 10-1: Cero 10-2: Cero 10-3 Cero Se informa como menor de 10 UFC/g de alimento analizado

Cuando la ltima dilucin En este caso el recuento se sale del rango en toda la caja es difcil por lo que se puede dividir, el mximo permitido es en octavos, si en un octavo se encuentran mas de doscientas UFC se para el recuento y se informa como recuento estimado, se multiplica por el nmero de divisiones de la caja y se promedia con la otra caja y finalmente se multiplica por el inverso de la dilucin

Informe: Escoja la dilucin indicada de acuerdo a los criterios anteriormente descritos, haga los clculos e informe el resultado

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RECUENTO DE BACTERIAS MESOFILAS AEROBIAS PNT-AL-002 Basado en el Bacterial Analytical Manual, 2003. Chapter 3, la norma ISO 4833 y NTC4075. 7.2 Mtodo de clculo, caso general. Para que un resultado sea vlido, es necesario que la caja donde se hace el recuento, contenga por lo menos 15 colonias. El ICONTEC, en su norma tcnica 4095 seala la necesidad de realizar un recuento cuyo dato sea el resultado de ms datos por lo que sugiere la siguiente ecuacin. Se calcula el nmero N de microorganismos presentes en la muestra de ensayo definido como el pasaje de dos diluciones sucesivas, usando la siguiente ecuacin: N = C V* (n1 + 0.1 n2) * d (1)

Donde: C = es la suma de las colonias contadas en todas las cajas de petri que contienen 2 diluciones sucesivas, donde por lo menos una de ellas contiene 15 colonias como mnimo. V= es el volumen del inculo aplicado en cada caja en mililitros N1 = el nmero de cajas retenidas en la primera dilucin N2 = el nmero de cajas retenidas en la segunda dilucin D = es el factor de dilucin correspondiente a la primera dilucin retenida Se redondea el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto, si la ltima cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica, si la ltima cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad. Se prosigue as hasta que se obtengan dos cifras significativas. Se toma como resultado, el nmero de microorganismos por mililitro (producto lquido), o por gramo (otros productos), expresados como un nmero entre 1 y 9,9 multiplicado por la potencia apropiada de 10. Ejemplo. Se sembr un chorizo, y los datos fueron en 10-1 168 y 215 y en la dilucin 10-2 fueron 14 y 25, aplique la frmula. N = 168+215+14+25 = 422 = 19.182 1 (2 + 0.1* 2) *10-2 0.022 Se redondean los resultados como se especific anteriormente y se obtiene como resultado 19.000 o 1,9 por 104 microorganismos/gramo de producto.

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