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Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Rompimiento celular

Sergio Huerta Ochoa


UAM-Iztapalapa
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Productos Extracelulares Productos Intracelulares


-Antibióticos -Mayoría de proteínas modificadas
-Enzimas extracelulares genéticamente
-Muchos polisacáridos -Lípidos
-Mayoría de aminoácidos -Algunos antibióticos

Esteroides
(Se extraen sin romper) Biomasa
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)
Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Tomado de
“Advances in product
release strategies and
impact on bioprocess
design” (2009)
Bangaru
Balasundaram, Sue
Harrison and Daniel
G. Bracewell
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Departamento de Biotecnología

Tomado de
“Advances in product
release strategies and
impact on bioprocess
design” (2009)
Bangaru
Balasundaram, Sue
Harrison and Daniel
G. Bracewell
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Fermentación

Centrifugación, filtración con vacío,


Cosecha de células filtración con membranas

Homogenización, molienda, lisis


Rompimiento Celular (enzimática o química)
Etapas primarias
de recuperación
Centrifugación, filtración con vacío,
Remoción de restos celulares filtración con membranas

Concentración y/o Precipitación, extracción, filtración con


fraccionamiento membranas, evaporación

Operaciones de alta Cromatografía, cristalización


resolución

Operaciones finales

Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989


Producto Studies on cell disruption and cell debris
removal in downstream processing
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Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae

Después de 2 pasos a 1000 bar dando un


Antes de la ruptura celular
rompimiento celular de 95%
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Equipo de ruptura

Industria Alimentaria
(Homogenización de la leche)

Aplicación en … Industria Biotecnológica


Industria de la Pintura
(Reducción de Pigmentos)
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Método Técnica Principio Estrés Costo Ejemplo
sobre el
producto
Químico Choque osmótico Ruptura osmótica de la membrana Suave Barato Ruptura de células de sangre

Digestión Rompimiento por digestión de la Suave Caro Micrococcus lysodeikticus tratado con lisozima
enzimática pared celular de huevo

Solubilización Detergentes solubilizan la Suave Moderado- Sales biliares actuando sobre E.coli
membrana celular caro
Disolución de Solventes orgánicos se disuelven en Moderado Barato Ruptura de levadura con tolueno
lípidos la pared celular y la desestabilizan

Tratamiento La saponificación de lípidos Fuerte Barato


alcalino solubiliza la membrana

Mecánico Homogenización Células cortadas en una licuadora Moderado Moderado Tejido animal y células
(tipo navaja)
Molido Ruptura celular por molido con Moderado Barato
abrasivos

Ultrasonicación Células rotas con cavitación Fuerte Caro Suspensión de células a pequeña escala
ultrasónica

Homogenización Se hace pasar células por un Fuerte Moderado Tratamiento a gran escala de suspensión de
(tipo orificio) pequeño orificio y se rompen por células excepto bacterias
estrés

Rompimiento en Se aplastan las células entre el Fuerte Barato Tratamiento a gran escala de suspensión de
molino de perlas vidrio y perlas de acero células y células de plantas
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Esquema de la pared celular de células procariotas

Procariotes Gram –
(E. coli produce la mayoría de las proteínas recombinantes)

Membrana externa
(Proteínas y lipopolisacáridos)
Fuerza mecánica
8 nm
Polipéptidoglucanos
8 nm Espacio Periplasmático
(Proteínas)

Membrana de plasma Permeabilidad

Procariotes Gram +

Polipéptidoglucanos
Espacio Periplasmático
(Proteínas)

Membrana de plasma
(Fosfolípidos, proteínas dispersas, iones metálicos)
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Dificultad de la ruptura

Esporas
Cocos
gram -
Levaduras

Células vegetales

Bacilos gram +

Bacilos gram - y cocos

Micelios

Células animales
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Elección del método de ruptura

Naturaleza de la fuente de la enzima


Escala de la operación
Velocidad del método de extracción
Estabilidad del enzima
Pureza requerida
Costo del proceso
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Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento

Factor inactivante Fuente de Frecuencia Modo de


enzima contrarrestarlo
Calor Cualquiera Universal Enfriamiento

Frío Cualquiera Raro Calentamiento

Proteasa Mayoría Común Inhibidores de proteasas o frío

Productos oxidación de Plantas y hongos Bastante común Agentes reductores


fenoles
Oxidación Cualquiera Común Agentes reductores

Dilución proteína Cualquiera Bastante común Concentración rápida

Pérdida de estabilidad Cualquiera Bastante común Restauración de ese factor

Inhibidores específicos Plantas y bacterias Raro Separación del inhibidor

Metales pesados Cualquiera Raro Agentes quelantes

Cambio de fase Cualquiera Común Mínima agitación


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Choque osmótico

1. Suspensión de células en solución tamponada hipertónica (sacarosa 20%)


2. Equilibrio osmótico
3. Centrifugación: concentración de las células
4. Resuspensión en agua (4ºC)
5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior celular

• Mayor sensibilidad en GRAM – (GRAM + alta presión osmótica interna)


• Ventajas:
Extracción de enzimas del espacio periplasmático, simplificación de
los procesos de purificación
• NO a gran escala:
Grandes volúmenes de medio (400 L/10 kg pasta celular)
Elevado número de pasos de centrifugación
Necesidad de refrigeración
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Tratamiento con lisozima + EDTA

•Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4)


glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina
(NAG) del mucopéptido

•Mayor susceptibilidad GRAM +


•Combinación con EDTA: quelante del Ca2+
•Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina,
antiobióticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationes
Hongos/levaduras: quitinasa/glucanasas
•Necesidad de choque osmótico
•No empleo a gran escala:
Alto precio de la lisozima
Eliminación de lisozima tras extracción
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Tratamiento con detergentes

Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana,


debido a apertura de poros

Tipos:
1. Iónicos: provoca desnaturalización proteica
Aniónicos: Lauril sulfato sódico, colato sódico, SDS
Catiónicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonio

2. No iónicos: preservan estructura nativa e interacciones de la enzima


Tween, Spam, Triton

Inconvenientes:
Precipitación de proteínas
Necesidad de eliminación (cromatografía, ultrafiltración)
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Tratamiento con álcalis

Tratamiento de las células con soluciones alcalinas


(KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)
 Hidrólisis de la pared celular
 Ventajas:
 Simpleza, barato
 Fácil aplicación a gran escala
 Desventajas:
 Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilización
(Saponificación de lípidos que se convierten a detergentes)
 No selectivo
 Aplicación SÓLO si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino
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Disolventes orgánicos

Método tradicional de ataque ( tolueno).

No se usan a gran escala.

Inconvenientes:
Precio
Toxicidad
Desnaturalización de proteínas
Inflamabilidad
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Homogeneización con abrasivos

•Mortero + abrasivo (cristal, albúmina, kieselgurh)


•Dispositivos de funcionamiento continuo:
Agitador Mickle (agitador vibratorio)
Dyno-mill (agitador de discos giratorios)

•Efectividad depende de:


 Tipo y concentración de abrasivo
 Tipo, concentración y edad de las células: levaduras >bacterias
 Velocidad de agitación
 Cantidad y flujo a través de la cámara
 Temperatura
 Dispositivo de discos
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Sonicación
•Aplicación de frecuencia superiores a 20kHz
•Aparición de áreas de compresión/enrarecimiento/cavidades →colapso de
cavidades →ondas de choque →daño celular
•Aplicación continua o discontinua
•Eficacia dependiente de:
Tipo de microorganismo: diversidad
Gram ->Gram +
Bacilos > Cocos
pH
Temperatura
Fuerza iónica del medio
Tiempo de exposición
Densidad de la célula
•Uso a pequeña escal, NO a gran escala:
Elevados requerimientos de energía
Dificultad de transmisión de la energía
Problemas de disipación del calor producido
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Congelación/Descongelación

•Formación y fusión de cristales de hielo  liberación de proteínas

•Combinación con otros métodos: congelación de sedimentos bacterianos

•Ventajas:
Simplicidad
Bajas temperaturas de trabajo

•NO a gran escala:


Elevado tiempo de tratamiento
Resistencia de algunos microorganismos
Sensibilidad de las enzimas a congelación/descongelación
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Cizalla líquida

•Paso de la suspensión de células a elevada presión (>55MPa) a través de un


orificio estrecho
•Homogeneizador de Manto-Gaulin
•Mecanismo:
Ruptura celular por caída brusca de presión y choque

•Modos de uso:
Paso único, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminación de
sustancia
•Efectividad depende de:
Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM +
Historia de la materia de partida:
Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial)
Congelación/descongelación
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Cizalla sólida

•Paso de células congeladas (-20ºC) a través de orificio

•Mecanismo:
Agitación en presencia de abrasivo (cristales de hielo) +
ruptura por cizalla líquida
Fuerzas de cizalla: paso a través de orificio + desgarro por
cristales de hielo

•No produce la desnaturalización de las enzimas

•NO a gran escala:


Manejo complicado y costoso
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Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)
Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Choque osmótico: El cálculo del gradiente de presión se basa en el equilibrio químico

Pe − Pi = −R ⋅T ⋅ c1

Molino de Perlas (operación intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas


a altas velocidades sigue una cinética de primer orden. El balance de masa de proteína
liberada puede ser expresado mediante la ecuación:

dR
VM = k (Rm − R )VM
dt
Rm
ln
Integrando y re-arreglando Rm − R
Ejemplo 5.2
Rm k
ln = kt
Rm − R
t
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Eficiencia de los Molinos de Perlas (operación continua): El número de etapas de un


molino de perlas obtenido mediante experimentos de pulsos, puede ser empleado para
calcular la eficiencia del rompimiento esperada. El balance de masa de proteína liberada
(células rotas) considerando que el molino consta de N etapas tipo tanque perfectamente
agitado en serie y que el rompimiento sigue una cinética de primer orden puede ser
expresado mediante la ecuación:
Vm dR1 V
= − FR1 + k (Rm − R1 ) m
dt
Expresando la ecuación en función de un tiempo adimensional e integrando obtenemos
 kVm 
R1  F 
=  Eficiencia de la etapa !!!
Rm  1 + kVm 
 
 F 
Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos:

Rm  kV 
= 1 + m  Ejemplo 5.3
Rm − R  F 
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Homogeneizador de alta presión: La desintegración celular en un homogeneizador de


alta presión a una presión fija puede ser descrita mediante una cinética de primer orden
respecto al número de pasos, de tal manera que:

dR
= k ' (Rm − R )
d

Integrando obtenemos la ecuación:


Rm
ln = k'
Rm − R
Se ha determinado experimentalmente que la constante k’ tiene una dependencia con la
presión de la siguiente forma:

k ' = k" P a
Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:
Rm
ln = k " P a
Rm − R
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Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cinética de rompimiento presenta una


cierta dependencia no lineal con el número de pasos expresada mediante la ecuación:

Rm
ln = k" b P a Ejemplo 5.4
Rm − R
Donde b es un exponente que varía con el tipo de célula y toma valores entre 0.28 y 1
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Chang and Su, 2006


Kinetic model for simultaneous cell
disruption and aqueous two-phase
extraction

A = Am[1 − exp(−kt)]
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La Ruptura celular, cuando se están procesando cientos o miles de


litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a
nivel laboratorio
Factores claves son: Eficiencia y reproducibilidad

A nivel Industrial sólo se emplean los molinos de perlas agitados y


los homogeneizadores a alta presión. El diseño de los molinos
está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto.

GEA Liquid Processing cell rupture


skid for biologic cell lysing. The
homogenizer feature the high
efficiency sharp profile rupture valve
type R which enable cell disruption at
lower pressures