TRABAJO PRCTICO N 7 M3- BIOLOGA CINTICA ENZIMTICA

TRABAJO PRCTICO N 6 ESTUDIO CINETICO DE LA ENZIMA ALFA-AMILASA. INTRODUCCION. La cintica enzimtica tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas as! como los "actores #ue en ella in"lu$en $ los mecanismos por los cuales transcurren. La velocidad de las reacciones enzimticas se puede medir% & por la cantidad de sustrato #ue desaparece en la unidad de tiempo & por la cantidad de producto #ue aparece en la unidad de tiempo 'n esta prctica de laboratorio se comprobar la in"luencia de la concentraci(n del sustrato )*+ $ de la enzima )'+ en la cintica del al"a&amilasa en su acci(n sobre los enlaces al"a ,&del almid(n. .ara ello nos basaremos en la desaparici(n del almid(n en la unidad de tiempo mediante el se/uimiento de la reacci(n de color #ue produce el mismo as! como sus productos de 0idr(lisis con el Iodo en disoluci(n de Ioduro de potasio )Reactivo de Lu/ol+. Dado #ue el almid(n est inte/rado por dos "racciones la amilosa $ la amilopectina debe tenerse en cuenta las reacciones #ue ambas producen )as! como sus respectivos productos de 0idr(lisis+ con el reactivo de Lu/ol% 12ILO*1 12ILO.'CTIN1 3 1milasa &&&&&&&&&&&&&& 12ILOD'4TRIN1* 3IODO 5 resultado Color azul violeta

21LTO*1 3 6LUCO*1 &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&3IODO No dan coloraci(n

7asndonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el e"ecto #ue provocan en la cintica enzimtica la variaci(n de los "actores #ue en ella in"lu$en% c)*+ c)'+ p8 $ T "undamentalmente. 'n 'sta prctica no estudiaremos el e"ecto del p8 $ la temperatura. La in"luencia de la c)'+ podremos estudiarla midiendo la velocidad de la reacci(n de la "orma $a descrita pero utilizando di"erentes c)'+ manteniendo constante los dems "actores. De "orma similar se procede con el estudio de la in"luencia de la c)*+. 9OR2UL' L1 .R'6UNT1 D' IN:'*TI61CI;N% &&&&&&&

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9OR2UL' UN1 8I.;T'*I*% &&&&&& 9OR2UL' UN 1.R'DICCI;N% &&&&&&&&&

ID'NTI9I<U' :1RI17L' IND'.'NDI'NT'%&&&& IND'NTI9I<U' :1RI17L' D'.'NDI'NT'%&&&&& ID'NTI9I<U' :1RI17L'* D' CONTROL%==. Debido a #ue utilizaremos amilasa comercial e>tra!da de 0on/os 1sper/illus sp debe considerar #ue la temperatura (ptima en este caso es de ?@A $ su p8 (ptimo es B. CCul es la temperatura $ p8 (ptimos de la al"a amilasa salival )ptialina+D Responda las si/uientes pre/untas )si es necesario consulte $ bus#ue en la biblio/ra"!a+% ,. CCules son las caracter!sticas estructurales del almid(nD E. C<u tipo de enzima es la al"a&1milasa salivalD F. CCules son los productos #ue ori/ina la acci(n de este enzima sobre el almid(nD -. CCul es el e"ecto del co&"actor ClNaD ?. C<u "unci(n cumple el cido clor0!drico en este e>perimentoD G. '>pli#ue c(mo in"lu$en en la velocidad de las reacciones enzimticas una variaci(n en la concentraci(n del enzima presente en la concentraci(n del sustrato el p8 $ la temperatura. 21T'RI1L'*

*oluci(n del enzima amilasa al ,H 2I: 3 ClNa H 2I: Disoluci(n de almid(n al @ E? H. Lu/ol Tubos de ensa$o. placa de porcelana vasos de precipitado baJo de a/ua termostatado a ?@A C cron(metro

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2ec0ero 6radilla Term(metro .I.'T1* 6otero de 8Cl puro )cido clor0!drico+

EXPERIMENTO 1: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA de la CONCENTRACI N DE LA ENZIMA PROCEDIMIENTO: ,. Tome - tubos de ensa$o $ aJada a cada uno E ml de disoluci(n de almid(n al @ E? H. E. 1/re/ue en cada tubo F ml de a/ua
3. 1Jada a cada tubo ,K EK F $ - ml de disoluci(n del enzima respectivamente

1Jada primero el a/ua $ lue/o la disoluci(n del enzima pues de lo contrario la reacci(n comenzar a veri"icarse $ usted no tendr en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente despus de adicionar la soluci(n del enzima en cada tubo pon/a en marc0a el cron(metro $ comience a medir el tiempo del e>perimento.

-. 'n cada intervalo de ? minuto ensa$e en la placa de cermica la reacci(n de la soluci(n e>perimental con el Lu/ol% para ello s(lo tiene #ue e>traer @.? ml del tubo con la enzima $ el almid(n colocarlo en la placa $ lue/o adicionar una /ota de 8Cl puro )cido clor0!drico+ $ dos /otas del reactivo de Lu/ol. Observe $ anote el color para cada tiempo $ cada tubo ensa$ados. ?. Determine por el procedimiento anterior el tiempo #ue tarda cada uno de los tubos en no dar reacci(n al/una con el reactivo de Lu/ol la mezcla de las dos /otas debe #uedarse del color ori/inal del Lu/ol. *i desea puede adicionar en una e>cavadura unas /otas de a/ua $ Lu/ol para tenerlo como soluci(n de control. Constru$a una tabla de datos brutos #ue contemple el nLmero de cada tubo el volumen de la enzima )mlM=.+ Tiempo total de reacci(n )min+ :elocidad de la reacci(n ),It+

G. Con estos datos constru$a un /r"ico de c)'+ en el eje ordenado contra velocidad de reacci(n )volIt+ en el eje de abscisas.

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EXPERIMENTO ! " ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACI N DEL SUSTRATO PROCEDIMIENTO: ,. Tome - tubos de ensa$o $ aJada a cada E ml de soluci(n de almid(n al @ ,H @ E@H @ E? $ @ F@H respectivamente. E. Complete el volumen de cada tubo con F ml de a/ua destilada. F. 1dicione a cada tubo - ml de disoluci(n del enzima 1l"a amilasa e incLbelos a ?@ /rados Celsius. -. 1 intervalos de , minuto ensa$e la presencia de almid(n mediante la reacci(n con Lu/ol de "orma similar a como se describe en el trabajo e>perimental N ,. ?. Con los datos obtenidos constru$a una de tabla de datos brutos. G. Con los datos de la tabla constru$a un /r"ico de velocidad de reacci(n ), I tiempo+ en el eje ordenado contra concentraci(n de sustrato en el eje de abscisas.

REPORTE DE LABORATORIO. '>perimento N ,% 'studio de la in"luencia de la concentraci(n del enzima. ,. Describa #u caracter!sticas estructurales del almid(n permiten su identi"icaci(n mediante las disoluciones de $odo $ el e"ecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almid(n )esto ser la Introducci(n de su in"orme+. Describa en este aparatado la pre/unta de investi/aci(n puesta a prueba la 0ip(tesis $ las predicciones seJale las variables involucrados as! como el mtodo #ue utiliz( para controlar al menos una de las variables control. E% 2ateriales $ 2todo% e>pli#ue con *U* .1L17R1 LO* 2OTODO* UTILIP1DO*. F. R'*ULT1DO*% 1ne>e la tabla $ el /r"ico de velocidad de reacci(n contra c)'+ tomando como concentraci(n del enzima el volumen de la soluci(n utilizado en cada tubo. C.or #u se puede tomar como velocidad de reacci(n el inverso del tiempoD. D'*CRI71 LO* R'*ULT1DO* F. CONCLU*ION'* Q ':1LU1CI;N% .lantee las conclusiones a #ue puede arribar de los resultados del e>perimento. '4.LI<U' LO* R'*ULT1DO* 'NCONTR1DO* -. Resuma las di"icultades encontradas en el ensa$o D'7IDO 1 LO* 'RROR'* D' DI*'RO '4.'RI2'NT1L

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'>perimento N E% 'studio de la in"luencia de la concentraci(n del sustrato. ,. Describa en este aparatado la pre/unta de investi/aci(n puesta a prueba la 0ip(tesis $ las predicciones seJale las variables involucradas as! como el mtodo #ue utiliz( para controlar al menos una de las variables control. E. E% 2ateriales $ 2todo% e>pli#ue con *U* .1L17R1 LO* 2OTODO* UTILIP1DO*.

F. R'*ULT1DO*% 1ne>e la tabla $ el /r"ico elaborados se/Ln las indicaciones del trabajo prctico tomando como valor de c)*+ la concentraci(n de sustrato en cada caso. C.or #u en este caso para calcular la velocidad de la reacci(n es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempoD D'*CRI71 LO* R'*ULT1DO* -. CONCLU*I;N Q ':1LU1CI;N% 1nalice el /r"ico $ plantee las conclusiones a #ue puede lle/aren este caso. '4.LI<U' LO* R'*ULT1DO* ?. Describa las di"icultades presentadas en este ensa$o .UNTU1LIP1NDO 'N LO* 'RROR'* D'L DI*'RO.