ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL

Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la Producción

Ingeniería en Alimentos

Laboratorio de Alimentos 101

Reporte #8

SIMULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA α -AMILASA

Integrantes:

- Nicole Del Pino

- Pamela Mejía
- Alisson Murillo
- María José Rodríguez (líder)
- Ginger Vargas

Profesor: Karín Coello O., M.Sc.

RESUMEN

En esta práctica se tuvo como objetivo evaluar la digestión del almidón por efecto de la
enzima α-amilasa. Donde se utilizó el reactivo de Benedict y de yodo (Lugol), se hizo uso
de 16 tubos de ensayos, 8 para el test de Benedict y los restantes para el test de yodo,
en este test se obtuvo como resultado que las muestras 1, 5, 7 y 8 dieron positivo por la
presencia del color violeta intenso indicando la formación de cadenas poli yoduro y en el
test de Benedict, era positivo si la solución se tornaba anaranjada indicando presencia de
azúcares simples y si se mantenía celeste el test era negativo, entonces las muestras
2,3, 6, 7, 8 fueron positivas y las restantes negativas. La enzima α-amilasa tiene un pH y
una temperatura óptima de 6 y 37°C respectivamente, siendo el pH el factor determinante
en la eficiencia de la enzima.

INTRODUCCIÓN

La saliva humana es un fluido corporal sustancial para la salud. La α-amilasa salival

humana es la proteína de la saliva que está en mayor concentración y tiene actividad
enzimática, debido a que cataliza los enlaces α-1,4-glucosídicos de los almidones y
carbohidratos.

El almidón es un glúcido formado por la unión de un sin número de moléculas de glucosa.

La amilasa salival es aquella enzima capaz de hidrolizar al almidón de modo que rompe
sus enlaces y libera glucosa y maltosa (Aragón, 2018).

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Además, el almidón está formado por 2 polisacáridos: la amilosa y la amilopectina. Los
dos tienen la posibilidad de ser digeridos por nuestro organismo debido a las enzimas
amilasa y glucosidasa presentes en la saliva y en el jugo pancreático (Lamby et al., 2013)

Para reconocer la presencia de almidón se utiliza el reactivo de Lugol y el reactivo de

Benedict. El reactivo de Lugol es una solución de yodo metálico y yoduro de potasio, al
agregar una sustancia que contiene almidón a la solución de yodo, se tiñen de un color
violeta intenso, debido a que los átomos de yodo se introducen en las espirales, amilosa,
y le da esa coloración violeta (Ferrier, 2017).

En el caso del reactivo de Benedict se utiliza debido a que contiene cobre y este se
reduce en presencia de azucares reductores, al agregar el reactivo a una solución de
azúcar reductor y esta se calienta, se tornará un precipitado de color anaranjado
evidenciando la presencia del azúcar reductor (Ferrier, 2017).

OBJETIVOS

Objetivo General

Evaluar la digestión del almidón por efecto de la enzima α-amilasa.

Objetivos Específicos

 Analizar la influencia de la prueba de reactivo de Benedict para la identificación de

la degradación del almidón.
 Identificar la relación entre el yodo y el almidón en la digestión de este
carbohidrato.
 Relacionar la influencia del pH y temperatura en la acción enzimática de la α-
amilasa en la digestión del almidón.

MATERIALES

Tabla 1: Materiales, reactivos y equipos

Materiales Reactivos Equipos Sustrato Enzima Producto Otros

16 tubos Benedict Buffers a
de pH de 2.0,
ensayos Incubadora Almidón Amilasa 7.0 y 9.0 Maltosa
Gradillas Ioduro de Agua
Gabinete potasio desionizada
de ensayo

PROCEDIMIENTO

Analizar el efecto de la actividad enzimática por medio de ensayos a partir de los test de
KI y Benedict

1. Emplear 8 tubos de ensayos.

2. En el primer tubo añadir 5 gotas de la enzima amilasa, así mismo 5 gotas del
sustrato almidón, también agregar 5 gotas de Buffer a un pH de 7.0, luego
proceder a hervir.

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 3. Para el segundo tubo colocar 5 gotas de: amilasa, almidón, buffer a pH 7.0 y
luego someter a congelación.
4. En el tercer tubo de ensayo incorporar 5 gotas de: amilasa, almidón, buffer a pH
7.0 y dejar a una temperatura de 37°C, este mismo valor será utilizado para los
siguientes tubos (4,5,6,7,8y9).
5. En el cuarto tubo añadir 5 gotas de: amilasa, agua desionizada y pH 7.0.
6. En el quinto tubo colocar 5 gotas de: agua desionizada, pH 7.0 y almidón.
7. En el sexto tubo agregar 5 gotas de: agua desionizada, maltosa y pH 7.0.
8. En séptimo tubo adicionar 5 gotas de: amilasa, almidón y buffer a pH 2.0.
9. Por último, en el octavo tubo añadir 5 gotas de: amilasa, almidón y pH 9.0.
10. Posteriormente, utilizar 8 tubos vacíos.
11. Requerir del primer tubo donde se agregaron las gotas de cada sustancia y añadir
una parte de la solución al tubo 1 vacío.
12. Realizar este mismo proceso del punto 11 para los demás tubos.
13. Luego de colocar la cantidad de solución en los recipientes, se usan los 8 tubos
de ensayos para realizar el test de yodo.
14. Para cada tubo se añade una gota del reactivo ioduro de potasio, después
observar y anotar los cambios en la tabla 2 de resultados.
15. Los siguientes 8 tubos se emplean para el test de Benedict, su relación es 1:1, lo
cual se agrega 1 gota cada tubo.
16. Mirar los cambios y anotar los resultados en la tabla 3.

RESULTADOS

Tabla 2: Datos del test de yodo a diferentes condiciones de °T y pH.

# Sustrato Enzima Buffer Azúcar Agua °T Color Test

Tubo desioni- (C) final (+ o -)
zada
1 Almidón Amilasa pH 7 - - 100 Purpura +
2 Almidón Amilasa pH 7 - - 0 Amarillo -
3 Almidón Amilasa pH 7 - - 37 Amarillo -
4 - Amilasa pH 7 - Si 37 Amarillo -
5 Almidón - pH 7 - Si 37 Purpura +
6 - - pH 7 Maltos Si 37 Amarillo -
a
7 Almidón Amilasa pH 2 - - 37 Purpura +
8 Almidón Amilasa pH 9 - - 37 Purpura +
Tabla 3: Datos del test de Benedict a diferentes condiciones de °T y pH.

# Sustrato Enzima Buffer Azúcar Agua °T Color Test

Tubo desioni- (C) final (+ o
zada -)
1 Almidón Amilasa pH 7 - - 100 Celeste -
2 Almidón Amilasa pH 7 - - 0 Anaranjado +
3 Almidón Amilasa pH 7 - - 37 Anaranjado +
4 - Amilasa pH 7 - Si 37 Celeste -

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 5 Almidón - pH 7 - Si 37 Celeste -
6 - - pH 7 Maltosa Si 37 Anaranjado +
7 Almidón Amilasa pH 2 - - 37 Anaranjado +
claro
8 Almidón Amilasa pH 9 - - 37 Anaranjado +
claro

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

La alfa-amilasa con nomenclatura EC 3.2.1.1 son enzimas dependientes de calcio,

completamente afuncionales en ausencia de iones de calcio. Estas enzimas hidrolizan los
enlaces éter de las cadenas de los polisacáridos de las sustancias amiláceas,
degradándolas a oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos, que son más solubles en
medios acuosos. De esa manera se consigue eliminar el almidón de forma sencilla. (Ver
anexo A). Las amilasas pueden hidrolizar las uniones glucosídicas de los polisacáridos
(endo-amilasas) y las que se encuentran en las extremidades de las cadenas (exo-
amilasas). Siendo las terminales más fáciles de degradar para las amilasas que las
anteriores (Figueroa et al., 2020).

Según la Tabla 2 para la muestra 1, 5, 7 y 8 dieron positivo para la prueba de Iodo

indicando la formación de cadenas poli yoduro a partir de la reacción entre el almidón y el
yodo, donde la amilosa y la amilopectina, componentes del almidón, forman estructuras
con las moléculas de yodo. La amilosa que es de estructura lineal, con enlaces (1,4), que
forma hélices en donde se juntan las moléculas de yodo formando un color azul oscuro;
mientras que la amilopectina es de estructura modificada, con enlaces (1,4) (1,6), que
forma hélices mucho más cortas y las moléculas de yodo son incapaces de juntarse
presentando un color intermedio entre anaranjado o amarillo. Por ello, el color final es las
muestras fueron positivo purpura y negativo amarillo. Sin embargo, el pH y la temperatura
influye en la absorción del yodo, donde a pH 7-8 el cual se encuentra en la boca y en el
duodeno será mucho mayor la concentración por la actividad de la amilasa. Se puede
observar en la muestra 1 que la temperatura a la que hirvió la muestra fue de 100 grados
Celsius, a pH 7 dando positivo puesto que no hubo la actividad enzimática, debido a que,
a mayor temperatura la enzima se desnaturaliza y a temperaturas mucho menores la
actividad enzimática es nula como es el caso de la muestra 2 que mantiene sus
propiedades enzimáticas, por ello, la temperatura donde la actividad enzimática es óptima
es en 30-39 grados Celsius. Se observa que en la muestra 7 y 8 con pH 2 y 9 dieron
positivo ya que uno es un pH acido asumiendo que es el pH del estómago donde la
actividad enzimática es ligeramente estable ya que va disminuyendo la actividad
enzimática degradando el almidón parcialmente y el otro pH es alcalino donde también
actúa bien y puede degradar el almidón. Sin embargo, en la muestra 4 al no haber
sustrato la enzima amilasa no puede actuar por ello la prueba salió negativa, al igual que
la muestra 6 al no haber ni sustrato ni enzima solo encontrándose el producto. No
obstante, en la muestra 5 no se encontró la acción de la enzima, pero aun así el reactivo
yodo yoduro potásico actuó eficazmente sobre el sustrato por la composición de este,
también, por tener las condiciones óptimas.

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Una investigación sobre la determinación los parámetros de la temperatura, pH y
concentración para la alfa-amilasa Mg indican que la actividad enzimática tiene un mayor
intervalo de absorbancia de 0,3 a 0,9 a valores de pH ácidos entre 2 y 6 a diferencia de
los resultados en el intervalo de actividad entre 0,5 y 0,8 en el que se reducen a valores
de pH básico entre 7 y 10 infiriendo que la relación entre estos dos parámetros es
inversamente proporcional. Determinando que a pH 5 la temperatura optima de reacción
es de 50 grados Celsius para una concentración de 5,6 U/mL. (Ver Anexo B) (Yañiquez
et al., 2019). Otra investigación demuestra el efecto del pH sobre la actividad y la
estabilidad de la enzima donde la máxima actividad se obtuvo con pH 6, indicando que el
pH optimo varía entre 2-12, donde las amilasas microbianas tienen su pH optimo en el
rango ligeramente acido a neutro (Espinel & López, 2009). Sin embargo, para la
temperatura a la cual alcanza la máxima actividad y, por tanto, corresponde a la
temperatura optima de reacción, es 70 grados Celsius. Cuando se sobrepasa este valor,
la actividad disminuye rápidamente porque la enzima se va desnaturalizando (Espinel &
López, 2009). Esta enzima fue incubada durante una hora en buffer fosfato 100 mM, pH 6
en un rango de temperatura entre 40 y 92 grados Celsius, la actividad decreció
rápidamente a partir de 50 grados Celsius, no obstante, destacan que la enzima conserva
35% de su actividad después de ser calentada una hora a 92 grados Celsius (Espinel &
López, 2009).

Otro factor que se puede observar en este análisis es la absorbancia de la actividad

enzimática de la amilasa donde a pH 6 sin importar la temperatura la actividad enzimática
es máxima y pH menos es dispersa, pero la mejor actividad se desarrolla a pH 5 a
temperatura promedio de 50 grados Celsius. Además, la concentración del sustrato
también tiene efecto sobre la actividad enzimática, la velocidad de catalización de la
enzima es proporcional a la concentración de sustrato, a mayor concentración de sustrato
mayor velocidad de reacción (Plomp, 2006).

El test de Benedict se encarga de las recciones con azúcares simples, en otras palabras,
si almidón fue o no degradado. Si el color producido es anaranjado indica que hay
presencia de azúcares simples, en el caso del que el color sea anaranjado menos intenso
es porque hay una producción parcial es decir no hubo una menor concentración de
azúcares simples, y si el color del tubo se mantiene celeste el test es negativo. El en caso
del primer tubo el test es negativo debido a que este tuvo se sometió a una temperatura
de 100°C que ocasionó un cambio de conformación en la enzima perdiendo así su
actividad enzimática, de tal manera no actuará sobre el almidón y no se producirá el
azúcar simple. El segundo tubo fue sometido a una temperatura bajo 0, lo cual ayuda a la
conservación permitiendo que la enzima mantenga su actividad enzimática. Entonces al
ser incubado el tubo se produce la degradación del almidón dando el test positivo. En el
tercer tubo se tiene amilasa, almidón, pH 7 y se incubó a 37°C al no haber una condición
externa que afecte la actividad de la enzima, se degradó el almidón por lo que el test es
positivo. En el tubo 4 al no haber el sustrato almidón, la enzima presente en este no tiene
sobre que actuar por lo que el test es negativo. El tubo 5 presenta almidón, pero no la
enzima amilasa, por consiguiente, no habrá manera de degradar el almidón a azúcar
simple, dando un test negativo. El tubo 6 contiene los productos directos de lo que sería
la actividad de la amilasa sobre el almidón, al tener presente la maltosa el test será
positivo. En los tubos 7 y 8 se produce el color anaranjado claro, indicando que se
produjeron azucares simples en menor concentración ya que, el pH que se colocó en

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estos fue de 2 y 9 respectivamente cuando el pH óptimo para la actividad enzimática de
la amilasa debe ser ligeramente alcalino (pH 7) ya que sino esta disminuye.

A partir tales resultados se puede evidenciar que las temperaturas más altas alteran la
forma del sitio activo, lo que reducirá su actividad o evitará que funcione. La enzima
habrá sido desnaturalizada. Cada enzima está compuesta por proteínas hechas de estos
aminoácidos que se retuercen y pliegan y, por lo tanto, la enzima tiene una forma única.
Esta estructura se mantiene unida por fuerzas débiles entre las moléculas de
aminoácidos de la cadena. Las altas temperaturas romperán estas fuerzas. La enzima,
incluido su sitio activo, cambiará de forma y el sustrato dejará de encajar. La velocidad de
la reacción se verá afectada o la reacción se detendrá. Por tanto, las enzimas funcionan
mejor a una temperatura determinada (Hassan, 2020).

Otro factor adicional es el de la concentración de sustrato. Las enzimas funcionarán

mejor si hay una gran cantidad de sustrato disponible. A medida que aumenta la
concentración del sustrato, también lo hace la actividad enzimática. Esto significa que las
enzimas pueden descomponer más sustrato si hay más sustrato disponible. Sin embargo,
esto no significa que la actividad enzimática no aumente sin cesar. Esto se debe a que la
enzima no puede funcionar más rápido a pesar de que hay mucho sustrato disponible.
Entonces, cuando la cantidad de sustrato disponible excede la cantidad de enzimas, no
se puede descomponer más sustrato. La concentración de enzima es el factor limitante
que ralentiza la reacción (Hassan, 2020).

Preguntas

1. Describe el efecto de la ebullición sobre la actividad de la amilasa ¿Por qué

la ebullición tiene este efecto y en qué se diferencian los efectos de
congelación y de la ebullición?

La ebullición desnaturaliza las proteínas, en este caso la amilasa por lo que pierde
su actividad. A diferencia de la congelación que produce una conservación de las
propiedades enzimáticas por lo que al volver a una temperatura óptima esta tiene
la misma efectividad.

2. ¿Cuál es el propósito de incluir el tubo 3 y que puedes concluir del resultado

obtenido?

El propósito del tubo 3 es para observar como la enzima actúa normalmente, a

este tubo se lo llama tubo de control y así realizar una comparación con los
otros tubos, ya que el tubo 3 cuenta con los mismos reactivos que el tubo 1 y 2
con la única diferencia que no está sometido a ninguna condición externa, solo
la de la incubación a 37°C.

3. Describe como averiguarías el pH óptimo para la actividad de la amilasa.

Para verificar el pH óptimo de dicha enzima, se realizaría un set de tubos

empleando la amilasa, el almidón y buffers a distintos pH, además requiriendo el
reactivo de Benedict para la identificación de coloración. El tubo que contenga una

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 prueba negativa para yoduro de potasio y positiva para Benedict donde el color
rojo ladrillo intenso será identificado, lo cual se analiza que ha degradado la
enzima por completo al almidón para formar los azures simples correspondientes y
así poder distinguir el pH óptimo para la enzima.

CONCLUSIONES

 La prueba de reactivo de Benedict permite identificar si el almidón ha sido o no

degradado mediante reacciones de azucares simples (glucosa y maltosa), dando
como resultado tonalidades naranja fuerte como prueba positiva indicando que el
cobre fue reducido por lo que existe la presencia de azucares reductores, una
tonalidad más baja de naranja indica una menor presencia de estos y en caso de ser
una prueba negativa tendrá una coloración celeste.
 La prueba de yodo permite identificar la presencia de almidón, ya que los
componentes (amilopectina, amilosa) de este reaccionan con el yodo formando
cadenas de poliyoduro dando como resultado al final de la hidrolisis una coloración
azul-violeta, lo que es tomado como un resultado positivo.
 La enzima α-amilasa tiene un pH óptimo de 6 y es estable en pH entre 5 y 7, y una
temperatura optima de 37°C, siendo el pH el factor determinante en la eficiencia de la
enzima, el cual se puede determinar por la absorbancia del complejo formado en la
prueba de yodo, un menor valor de absorbancia indica una mayor actividad
enzimática, lo que se relaciona directamente con la cantidad de almidón sin hidrolizar.

BIBLIOGRAFÍA

Aragón, L. (2018). Prácticas de Laboratorio. Referencia online incluida en Rodin:

https://rodin.uca.es/xmlui/bitstream/handle/10498/20933/PR%C3%81CTICAS%20DE
%20LABORATORIO.pdf?sequence=1&isAllowed=y. Fecha de acceso: 18/07/2021.

Espinel, E. & López, E. (2009). Purification and characterization of α-amylase from

Penicillium commune produced by solid state fermentation. (Prueba) Revista
Colombiana de Química (Prueba), 38, 191-208.

Ferrier, D. (2017). Bioquímica. Séptima edición. España, Madrid: Wolters Kluwer.

Figueroa, R., Bran, M. del C., Morales, O. & Álvarez, G.A. (2020). Potencial de los hongos
anamorfos de Guatemala para la producción de α-amilasas utilizando como sustrato
cascarilla de arroz. Rev. cient. Guatemala, 1, 41-123.

Hassan, E.F. (2020). Factors Affecting Enzyme Activity. Cairo.

Lamby, C., Gómez, O. & Jaramillo, L. (2013). La a-amilasa salival: relación con la caries
dental y la salud en general. Investigación clínica y epidemiológica, 32(69), 93-101.

Plomp, P.J.A.M. (2006). Levadura de panadería. Universitario de Rabanales, 1, 1-8.

Yañiquez, F., Huanca, S., Tejeda, K., Aliaga, E., Peñarrieta, M. & Mollinedo, A. (2019).
Determinación de los parámetros temperatura, pH y concentración para la nueva
enzima α-amilasa Mg. Revista Boliviana de Química, 1, 51-59.

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ANEXOS

Anexo A

Figura 1. Hidrólisis del almidón con la amilasa

Anexo B

Figura 2. Absorbancia vs pH a temperatura de 30, 40, 50 y 60°C a diferentes

concentraciones de enzima modificada α-amilasa Mg, donde se observa el cambio en la
actividad a valores de pH ácido.

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