Agronomía

Química Orgánica y Biológica

TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO N°2: ENZIMAS

1.Objetivos
Caracterizar cualitativamente la actividad de tres enzimas.
Determinar la presencia de las enzimas catalasa y deshidrogenasa en una muestra de
papa.
Comprobar en forma experimental la acción de los factores que influyen sobre la
actividad enzimática.
Comprobar la visualización de la desnaturalización de una enzima mediante la acción
de la temperatura.
Comprobar la acción hidrolítica de la amilasa

2.Introducción
Como sucede con los catalizadores inorgánicos, las enzimas modifican la velocidad de
una reacción química sin afectar el equilibrio final, y solo se requieren pequeñas
cantidades para efectuar la transformación de un gran número de moléculas de
sustrato. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de catalizadores inorgánicos, las
enzimas son bastante específicas, ya que catalizan un número relativamente pequeño
de reacciones y en algunos casos tan solo una reacción. Así mismo, las enzimas
funcionarán solamente bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura,
concentración de sustrato, cofactores, etc. Estas características particulares están
condicionadas por la naturaleza proteica de estos catalizadores biológicos.

2.1.Labilidad térmica de las enzimas

La velocidad de una reacción catalizada por una enzima, al igual que la mayoría de las
reacciones químicas, aumenta con la temperatura. Esto se debe principalmente al
efecto sobre las constantes de velocidad de las diversas reacciones parciales que
componen la reacción total, y a la afinidad de la enzima por los cofactores,
activadores, etc. A elevadas temperaturas, la enzima se desnaturaliza dando como
resultado una pérdida de actividad. Esto significa que la velocidad inicial de la reacción
aumentará con la temperatura hasta que se haga prácticamente imposible de medir
debido a una inactivación casi inmediata. En la práctica, la mayoría de las enzimas son
completamente inactivadas por encima de los 70 °C. Al bajar la temperatura la enzima
disminuye su actividad también. Sin embargo, el enfriamiento no causa
desnaturalización de la enzima y por lo tanto su activación puede ser reversible.

2.2.Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas

Las enzimas son activas en un intervalo limitado de pH. El pH al cual se obtiene la
actividad máxima se conoce como pH óptimo y es característico de la enzima. Los
cambios de actividad con el pH se deben principalmente a cambios en el estado de
ionización los aminoácidos que componen la enzima. Estudios sugieren que de las
diferentes formas de ionización de la proteína solo una es activa. A valores de pH por
encima o por debajo del pH óptimo disminuye la cantidad de esta forma y por lo tanto
se produce una disminución en la actividad enzimática.

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2.3.Influencia de la concentración de enzima

Bajo las condiciones óptimas, la velocidad de la reacción enzimática depende de la
concentración de la enzima. De hecho, en tanto el sustrato se encuentre en gran
exceso, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de
enzima, tal como se aprecia en la siguiente figura:

2.4.Actividad de la catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y
vegetales. Durante el metabolismo celular se forman especies reactivas del oxígeno
(EROs) que son tóxicas para la célula. Una de ellas es el peróxido de hidrógeno (H2O2),
el cual se descompone en agua y oxígeno por acción de la enzima catalasa.

2.5.Actividad de la deshidrogenasa
Las deshidrogenasas son enzimas oxidorreductasas que participan en la respiración
celular. Transfieren pares de electrones de un sustrato orgánico a la nicotinamida
adenina dinucleótido (NAD+) o nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+) que

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forman NADH o NADPH, respectivamente (Smith y Mc Feters, 1997). Esta es una parte
vital del sistema de transporte de electrones de la célula (Crane y col., 1991).
El uso de sales de tetrazolio es un método ampliamente aceptado para medir
reacciones redox en las células (Smith y McFeters, 1997; Mosher y col., 2003). La sal
2,3,5-trifenil cloruro de tetrazolio es reducida por las enzimas deshidrogenasas
presentes en la cadena transportadora de electrones, que convierten la sal de
tetrazolio en formazán, un compuesto insoluble de color rosado-rojo.

2.6.Amilasa salival
La amilasa es la enzima responsable de la degradación del almidón y del glucógeno
presentes en los alimentos; esta enzima hidroliza los enlaces α- (1-4) que unen las
glucosas (enlaces glucosídicos). La amilasa se encuentra en la saliva (amilasa salival),
donde su acción es limitada por el tiempo tan corto que los alimentos pasan en la
boca; esta enzima también se sintetiza en el páncreas (α-amilasa pancreática), pero su
acción finalmente la tiene en el duodeno. La amilasa salival, también llamada ptialina,
requiere cloruro como cofactor inorgánico para que la catálisis ocurra de manera
óptima.
La acción de la amilasa salival sobre el almidón puede reconocerse observando la
reacción de los productos formados cuando se agrega el reactivo Lugol. El almidón
frente al Lugol da color azul y los productos iniciales de la hidrólisis (polisacáridos más
pequeños) dan colores violetas y rojizos a medida que es mayor la hidrólisis hasta no
dar coloración cuando la hidrólisis ha provocado la aparición de los productos finales
(maltosa libre y dextrinas). La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo
se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. Por lo tanto, no es una
verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que
modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul
violeta.

3. Parte experimental

3.1. Estudio de la actividad de la catalasa

A.Materiales
1/2 papa
Cuchillo o pelapa
Rallador
Vasos de precipitado
Tubos de ensayo
H2O2 10 vol.
Baños termostatizados

B.Metodología
-Pelar y rallar una papa.
-Tomar 2 tubos de ensayo y colocar 1 cucharada de papa rallada en c/u.
-Colocar uno de los tubos en baño termostatizado a 100 °C. Dejar enfriar.
-Agregar a los dos tubos de ensayo H2O2 10 vol. De manera que cubra completamente
el material vegetal.
- Observar

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3.2. Estudio de la actividad de la deshidrogenasa

A.Materiales
1/2 papa
Cuchillo o pelapa
Vasos de precipitado
Tubos de ensayo
Solución de 2,3,5-trifenil cloruro de tetrazolio (TTC) al 5%
Baños termostatizados
Papel de aluminio

B.Metodología
-Pelar la papa y cortar en trocitos pequeños, de tamaño homogéneo.
-Tomar 2 tubos de ensayo y colocar igual cantidad de papa en c/u (que cubra aprox. 1
cm del tubo).
-Colocar uno de los tubos en baño termostatizado a 100 °C. Dejar enfriar.
-Agregar a los dos tubos de ensayo solución de TTC 5% De manera que cubra
completamente el material vegetal.
-Envolver con papel de aluminio e incubar a 37 °C durante 20 min.
- Observar

3.3. Estudio de la amilasa salival

A.Materiales
Probetas
Tubos de ensayo
Pipetas
Baño termostatizado
Solución de almidón 1%
Buffer fosfato 0,2 M (pH= 7)
NaCl 0,1M
HCl 0,1M
NaOH 0,1M
Reactivo de lugol
Papel indicador de pH

B.Metodología

I.Preparación de la muestra de saliva diluida

Colocar 5 mL de saliva en una probeta y agregar 30 mL de agua destilada.

II.Labilidad térmica de las enzimas

-Tomar 4 tubos de ensayo y colocar en cada uno 1 mL de saliva diluida (amilasa); 0,5
mL de buffer y 0,5 mL de NaCl 0,1 M. Enumerar los tubos.
Tubo 1: se hierve en baño de agua a 100°C durante 1 ó 2 min.
Tubo 2: control
Tubo 3 y 4: se colocan en hielo a 0 °C durante 10 min.

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-Luego añadir 2 mL de solución de almidón 1% en todos los tubos de ensayo.

-Incubar los tubos de ensayo 1, 2 y 4 en baño termostatizado a 37ºC durante 10 min,
y el tubo 3 en hielo a 0 °C durante 10 min.
-Al transcurrir este tiempo, añadir una gota de lugol en todos los tubos de ensayo Los
resultados de la observación se anotan en la siguiente tabla:

Tabla 1. Labilidad térmica de las enzimas

Tubo de Enzima Condiciones del Sustrato Condiciones Coloración

ensayo experimento de incubación con lugol
1 Amilasa Enzima Almidón 10 min, 37°C
desnaturalizada
(100°C)
2 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 37°C

3 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 0°C

(0°C)
4 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 37°C
(0°C)

III.Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas

-Tomar 3 tubos de ensayo y colocar en c/u 1 mL de saliva diluida (amilasa); 0,5 mL de
buffer; 0,5 mL de NaCl 0,1 M y 2mL de solución de almidón 1%. Enumerar los tubos.
-En el tubo de ensayo 1 agregar 1 mL de NaOH 0,1 M; en el tubo de ensayo 2, 1 mL
de buffer fosfato pH 7 y en el tubo de ensayo 3 1 mL de HCl 0,1M.
-Medir el pH de la mezcla de todos los tubos con papel indicador.
-Mezclar e incubar durante 10 min en baño termostatizado a 37 °C.
-Luego de ese tiempo añadir a cada tubo 1 gota de reactivo de lugol.
-Los resultados de la observación se anotan en la tabla que indica la influencia del pH
sobre la actividad de la amilasa de la saliva.

Tabla 2. Influencia del pH sobre la actividad de la enzima

Tubo de Enzima pH del medio Sustrato Condiciones de Coloración

ensayo incubación con Lugol
1 Amilasa NaOH 0,1M (pH=…… ) Almidón 10 min, 37 °C
2 Amilasa Buffer fosfato pH=7 Almidón 10 min, 37 °C
3 Amilasa HCl 0,1M (pH=……… ) Almidón 10 min, 0 °C

IV.Influencia de la concentración de enzima

-Colocar en cuatro tubos de ensayo 2 mL de solución de almidón 1%; 0,5 mL de NaCl
0,1 M y 0,5 mL de buffer. Enumerar.
-En el tubo de ensayo 2 Añadir 0,5 mL de saliva diluida; en el tubo de ensayo 3, 2 mL
y en el tubo de ensayo 4, 4 mL.
-Agitar los tubos e incubar durante 10 min en baño termostatizado a 37 ºC.

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-Luego en cada tubo de ensayo añadir 1 gota de lugol. Anote las observaciones.
Tabla 3. Influencia de la concentración de enzima

Tubo de Cantidad de Sustrato Condiciones de Coloración con

ensayo Enzima incubación Lugol
1 - Almidón 10 min, 37 °C
2 0,5 mL Almidón 10 min, 37 °C
3 2 mL Almidón 10 min, 37 °C
4 4 mL Almidón 10 min, 37 °C

ACTIVIDADES ADICIONALES
1)Escriba la ecuación química que representa la actividad de la catalasa. ¿En qué
organela de las células vegetales se encuentran principalmente estas enzimas?

2)Escriba una ecuación química sencilla que represente la actividad de las

deshidrogenasas. ¿En qué tipos de células vegetales se encuentran y en qué
organelas?

3)Investigue en qué órganos vegetales se encuentran las amilasas y cuáles son sus
funciones en ellos.