FACULTAD DE INGENIERÍA GEOLÓGICA,

MINERA, METALÚRGICA Y GEOGRÁFICA

Escuela profesional de Ingeniería Ambiental
INFORME DE LABORATORIO N°4: AISLAMIENTO
DE MICROORGANISMOS CELULOLÍTICOS Y
AMILOLÍTICOS

 CURSO:

Laboratorio de Microbiología
 PROFESOR:

Mgs. Sánchez Rojas Tito Libio

 INTEGRANTES:

-Barrionuevo Sequeiros, Liz Kenyifer 17160314

-Dávila Fernández, Lucero Mariana Paula 17160122
-Rojas Briceño, Shadith Leonida 17160116

 CICLO:

4to semestre académico

2018
“Año del Diálogo y Reconciliación Nacional”
 UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
CELULOLÍTICOS Y AMILOLÍTICOS

INTRODUCCIÓN
Una parte importante del ciclo del carbono, realizada por microorganismos, es la
degradación de los polímeros de las plantas. Es un proceso crítico ya que la principal
entrada de carbono orgánico de los suelos es a través de las plantas y los
microorganismos son los que transforman sus polímeros estructurales. Como
consecuencia de esta actividad microbiana se forman compuestos húmicos que se
convierten en compuestos orgánicos más sencillos y accesibles para otras poblaciones.
(Castillo,F.,2005). Las amilasas constituyen uno de los grupos más importantes de
enzimas industriales que presentan varias aplicaciones en la industria de los alimentos,
textil y en la fabricación de etanol (Machado de Castro et al, 1979). Actualmente se
utilizan dichas enzimas degradadoras de almidón en procesos industriales
biotecnológicos ya que son más productivas y ofrecen mayores beneficios a los
procesos. Por otro lado las celulasas […] además de la degradación de la celulosa en los
residuos sólidos orgánicos, las celulasas han sido utilizadas en la producción de
alimentos, ácidos orgánicos, azúcares fermentables, etanol, bebidas, textiles,
detergentes, papel, pulpa y tintas para papel (González–González & Nungaray, 2005;
Gupta et al. 2012).
En esta práctica de laboratorio presentaremos la metodología y resultados del
aislamiento y selección de microorganismos amilolíticos y celulolíticos, así como
resaltar su importancia y las ventajas de su utilización en los diversos procesos
industriales y ambientales.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO
Los microorganismos con características enzimáticas brindan una opción en la
obtención de metabolitos que puedan ser usados a nivel industrial, aprovechando
procesos de biodegradación de los polisacáridos como el almidón, celulosa y lignina,
que se encuentran de manera abundante en la naturaleza, específicamente en el material
vegetal (Dávila & Vázquez-Duhalt, Enzimas lignocelulolíticas fúngicas para fines
ambientales, 2006).
Los microorganismos amilolíticos son también llamados productores de amilasas.
2.1 AMILASA
Se denomina amilasa a una enzima que tiene la capacidad de dividir el almidón en sus
diversos componentes. Una enzima es una proteína que se encarga de catalizar de
manera específica las diferentes reacciones bioquímicas que desarrolla el metabolismo.
En el caso de la amilasa, cataliza una reacción de hidrólisis que, en la digestión del
almidón, da lugar a azúcares simples.

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2.2 ALMIDÓN
El almidón, por su parte, es un carbohidrato que actúa como reserva de energía en los
vegetales. Por lo tanto: cuando la enzima amilasa actúa sobre el carbohidrato almidón,
lo degrada convirtiéndolo en azúcares simples a través de una reacción metabólica.
El almidón se encuentra en casi todas las plantas, está compuesto por amilosa,
constituida por 1.000 a 5.000 moléculas de glucosa y amilopectina, formada por 6.000 a
20.000 unidades de glucosa (Allinge, Cava & De Jongh, 1976). Los microorganismos
amilolíticos utilizan enzimas reductoras para producir azúcares simples. Dentro de estos
se identifican bacterias como Bacillus sp., Pseudomonas sp., y Streptomyces sp.
(Sánchez y otros, 2005).
La amilasa, de este modo, es clave en la digestión. Cuando una persona come pan,
pastas u otros productos que disponen de harina, ingiere almidón. La amilasa producida
por el páncreas y las glándulas salivales descompone el almidón en sustancias más
simples para que el organismo pueda absorber los nutrientes.
El análisis de la cantidad de amilasa en sangre permite diagnosticar diversas
enfermedades. Cuando su nivel es excesivo, puede deberse a pancreatitis, paperas o un
problema renal.
Cabe destacar que la amilasa también está presente en la levadura que se utiliza para la
producción de pan. Esta amilasa rompe el almidón de la harina, permitiendo que la
levadura se “alimente” de los azúcares simples y haciendo que la masa crezca o se
eleve. El proceso también otorga un sabor característico al pan.
Los microorganismos celulolíticos son también llamados productores de celulasas, entre
ellos se encuentran los géneros Bacillus sp., Clostridium sp., Streptomyces y entre los
hongos se encuentran Arpergillus sp., Rhizopus sp., etc.
2.3 CELULASA
En general, para la hidrólisis y el metabolismo de la celulosa los microorganismos
producen celulasas extracelulares. Los componentes de estos sistemas celulósicos
pueden clasificarse según su acción catalítica y se pueden encontrar 3 tipos de
actividades enzimáticas:
a) Endoglucanasas o 1,4 β-D-glucán-4-glucanohidrolasas (EC 3.2.1.4), estas enzimas
actúan en las porciones amorfas de las cifras de celulosa y rompen los enlaces β-1,4
glucosídicos generando oligosacáridos de distintas longitudes.
b) Exoglucanasas que incluyen 1,4-β-D-glucán-4-glucanohidrolasas (celodextrinasas
EC 3.2.1.74) y 1,4-β-D-glucán-4-celobiohidrolasas (celobiohidrolasas EC 3.2.1.91),
estas enzimas actúan en los extremos reductores y no reductores de la celulosa liberando
glucosa (glucanohidrolasas) o celobiosa (celobiohidrolasa).
c) β-glucosidasas o β-glucosídico (EC 3.2.1.21), estas enzimas actúan hidrolizando las
unidades de celobiosa en monómeros de glucosa.

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En estos 3 sistemas actúan de forma cooperativa en la degradación de celulosa. Las

celulasas se distinguen de otras glucósido-hidrolasas por la acción de hidrólisis de las
uniones -1,4-glucosídicas.(Castillo,2005)
2.4 CELULOSA
La celulosa, como sustancia de sostén, es el componente principal de las paredes
celulares de las plantas y el hidrato de carbono más ampliamente extendido. […] A
diferencia del almidón, las moléculas de D-glucosa en la celulosa están unidas en la
forma β(1,4)-glucosídica, a lo que se deben las distintas propiedades físicas de estos dos
productos naturales. La celulosa forma largas cadenas debido a la fluctuante ordenación
espacial de los puentes de hidrógeno, que se unen en forma de haz (Beyer & Walter,
1987)
La celulosa fue el primer material polimérico que se modificó químicamente para
obtener nuevos polímeros de interés comercial.[…](Ege,S., 2000).

3. DESARROLLO EXPERIMENTAL
3.2 PROCEDIMIENTO:
3.2.1 AISLAMIENTO
-MUESTRA: ARVEJAS EN DESCOMPOSICIÓN.
 Pesar 1gr. de arvejas en la balanza electrónica la cual taramos adecuadamente antes
de proceder a pesar.
 Triturar la muestra que pesamos anteriormente.
 Colocar la muestra triturada en 9 ml de solución salina.(10-1).
 Utilizar una pipeta esterilizada, con la cual diluimos en serie de tubo a tubo para ello
contamos con 3 tubos de ensayo que tenían el diluyente (10-1,10-2,10-3).
 Con la misma pipeta, colocar 0.1 ml de las dos últimas diluciones en el centro de dos
placas Petri que contenían agar Almidón 1%.
 Diseminar la muestra con una espátula de Drigalsky estéril, por la superficie del
medio de cultivo.
 Tapar las placas y llevar a incubar a 28°C por 3 a 4 días.
3.2.2 SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS AMILOLÍTICOS
 Agregar una solución de lugol (I2/KI(0.026%I2 + 0.26%KI)) a las placas Petri.
 Observar los halos de degradación
 Realizar tinción Gram:
-Preparación del frotis
 Lavar el portaobjetos, para retirar el exceso de grasa en su superficie ya
que si no se limpia bien puede que el proceso de tinción no se realice de
forma óptima.
 Colocar una gota de agua sobre el portaobjetos ya seco.
 Luego se procede a extraer una pequeña cantidad de las colonias que se
encuentran en la placa Petri.

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 Colocar dicha cantidad sobre una gota de agua, y remover bien la

muestra.
 Luego se procede a fijar o secar la muestra con calor.
-Coloración del frotis
 Luego de ya tener el frotis preparado, colocar unas gotas de cristal
violeta y dejar actuar durante 2 minutos.
 Lavar con agua, cuidando que no se eche a perder la preparación.
 Cubrir la muestra con unas gotas de Lugol, esperar durante 2 minutos y
luego volver a lavar con agua.
 Colocar unas gotas de decolorante (alcohol o acetona).
 Luego de ese paso, lavar varias veces con agua.
 Por último, cubrir la muestra con Safranina, esperar durante 1 minuto y
luego lavar con agua.
 Secar y observar la muestra en el microscopio; primero usar el objetivo
10x para enfocar y luego con el de 40x observar las formas de la célula.
 Observar con el objetivo de 100x para una mejor apreciación, siempre y
cuando se le coloque una gota de aceite de inmersión a la muestra.
 Observar en el microscopio e identificar a los microorganismos amilolíticos.
3.2.2 SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS CELULÍTICOS
 Agregar una solución de Rojo de Congo.
 Observar los halos de degradación.
 Realizar tinción Gram:
 Cabe resaltar que los pasos utilizados en la tinción Gram se encuentran
en el ítem anterior.
 Observar en el microscopio e identificar a los microorganismos celulolíticos.

4. RESULTADOS
4.1 RESULTADOS DE LOS MICROORGANISMOS AMILOLÍTICOS
Después de realizar la Tinción Gram, observamos en el microscopio.

Fig.: Microorganismos en la muestra de

Fig.: Microorganismos amilolíticos.
ARVEJA PODRIDA.

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Fig. Muestra de microorganismos Fig. Muestra de microorganismos

amilolíticos con lugol: Podemos ver la poca amilolíticos: En esta figura se observa
actividad enzimática de los microorganismos bacterias Gram positivas (Color morado),
amilolíticos en esta muestra, ya que solo la cuya morfología es bacilo.
parte no coloreada es la parte degradada.

4.2 RESULTADOS DE LOS MICROORGANISMOS CELULOLÍTICOS

Después de dos semanas en la incubadora, revisamos los microorganismos en el agar
carboximeltilcelulosa (CMC) 1%. Agregamos rojo de Congo al 1% sobre la paca y
dejamos reposar por 15 minutos y observamos los resultados.

Fig. Muestra de microorganismos Fig. Muestra de microorganismos

celulolíticos en Agar CMC con el rojo de
Congo.
celulolíticos con rojo de congo: Podemos
ver la poca actividad enzimática de los
microorganismos celulolíticos en esta
muestra, no se puede apreciar con claridad
INFORME
los halos DE MICROBIOLOGÍA 6
de degradación.
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Fig. Muestra de microorganismos Fig. Resultados de la muestra de la placa

celulíticos con rojo de congo de la MESA contaminada, nos damos cuenta que,
N°01: En esta placa se puede observar efectivamente es un hongo.
bastante actividad de los microorganismos
celulolíticos, sin embargo también
podemos ver que es está contaminada, es
probable que sean hongos.

5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS DE LOS MICROORGANISMOS
AMILOLÍTICOS
Según Buitrago, S., Sánchez, E., Guerrero, H.:
Con los microorganismos aislados productores de celulasas, lignocelulasas y
amilasas se realizará la producción de enzimas que serán utilizadas en la
degradación de materiales vegetales para la obtención de etanol, extractos
vegetales y otros productos de interés dentro de los proyectos de formación
del Centro de Gestión Industrial.(Buitrago, 2014).
Concordamos con los autores acerca de la importancia de aislar microorganismos
amilolíticos y celulolíticos, ya que las enzimas que producen se pueden utilizar en
varios procesos industriales.

Según Canales, P.:

La aplicación más extendida de la amilasa es en la industria del almidón. Las
especies de Bacillus son de especial interés en procesos industriales
biotecnológicos a gran escala […].Las especies de Bacillus son de especial
interés en procesos industriales biotecnológicos a gran escala. A pesar de la
amplia distribución de esta enzima en diferentes seres vivos, la fuente que
actualmente se utiliza a nivel industrial es la microbiana debido a las ventajas
que presenta en la producción.
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Luego de investigar acerca de la importancia de los microorganismos amilolíticos,

rescatamos lo citado por la autora Canales, ya que se han encontrado diversas ventajas
al trabajar con dicha bacteria, como por ejemplo el tiempo y espacio utilizados en el
proceso, los costos, etc., además en la práctica de laboratorio observamos que las cepas
bacterianas eran gram positivas, muy probablemente Bacillus sp.

Según Sánchez, C. et al:

Se estimaron como cepas amilolíticas aquellas que presentaron la prueba de
lugol positiva. El principio de esta prueba se basa en la incapacidad que
presenta el lugol para pigmentar las zonas en las que el almidón ha sido
hidrolizado por acción enzimática. Por esta razón se utilizó la prueba de lugol
para la determinación de microorganismos que producen enzimas amilolíticas
exocelulares, ya que este test permite el reconocimiento de las mismas por la
formación de un halo no pigmentado y de diámetro variable alrededor de
aquellas colonias que sintetizan este tipo de enzimas. Este fenómeno se
observa cuando se expone el cultivo a la acción del lugol durante un periodo
aproximado de 1 a 3 min.

Concordamos con los autores del texto citado acerca de la utilización del lugol, ya que
al realizar dicho procedimiento en la placa Petri donde se encontraban las colonial,
observamos que el medio se oscureció y que los halos de degradación alrededor de las
colonias no se colorearon y por eso se hicieron notorios.

“…Dentro de las cepas obtenidas figuran microorganismos de tipo bacilos y

cocos Gram Positivos y Gram negativos. Las cepas amilolíticas seleccionadas
fueron identificadas bioquímicamente, encontrando que pertenecen a los
géneros Bacillus sp., Clostridium sp. y Kurthia sp., siendo el primero el más
predominante dentro de las cepas seleccionadas”

Según lo trabajado en el laboratorio, identificamos a las colonias obtenidas como gram

positivas y observando su forma y morfología, probablemente la mayoría sea del género
Bacillus sp.
5.1 RESULTADOS DE LOS MICROORGANISMOS CELULOLÍTICOS
Según Diana Gaitán:
La actividad enzimática de las celulasas puede ser medida de dos formas
básicas: Medición de la actividad individual de cada celulasa y la
medición de actividad total de as celulasas.
Por otro lado, la actividad puede ser fácilmente detectada en medios con
CMC o celulosa con la adición de varios colorantes como el rojo congo,
debido a que estos son absorbidos solo por largas cadenas de
polisacáridos. Este método es semi-cuantitativo y muy adecuado cuando
se requiere procesar un gran número de muestras. (Gaitan D. & Perez,
2007, p. 5)

INFORME DE MICROBIOLOGÍA 8
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Diferentes procedimientos utilizados en la identificación y enumeración de los

microorganismos capaces de utilizar la celulosa han sido descritos; siendo la base de
estos la hidrólisis de sustratos celulolíticos.

La utilización de medios líquidos que contienen celulosa permiten estimar

cualitativa y cuantitativamente los microrganismos degradadores, los
medios sólidos son generalmente más usados pero en estos las colonias de
microorganismos que utilizan con frecuencia difíciles de diferenciar de
otros microrganismos que no lo hacen. Teather y Wood observaron que el
rojo congo podría ser usado en los ensayos para evidenciar la hidrólisis de
polisacáridos debido a que el colorante forma complejos con las
moléculas aún no hidrolizadas, facilitado así la diferenciación entre
microorganismos celulolíticos y no celulolíticos por la formación de zonas
de aclaramiento alrededor de las colonias. (Hendricks, 1995)

En este caso, nosotros medimos la actividad enzimática agregando rojo de congo a

nuestra muestra y pudimos ver que hubo poca actividad enzimática de los
microrganismos, esto se puede explicar por diversos factores, uno de ellos podría ser el
tiempo de incubación.

6. CONCLUSIONES

 De esta práctica concluimos que las estrategias de cultivo, como la

diseminación, realizadas en esta práctica resaltan la importancia de la
optimización del medio de cultivo para garantizar la máxima eficiencia de
aislamiento de microorganismos celulolíticos y amilolíticos.
 Respecto a la parte de aislamiento de amilolíticos, podemos concluir que gran
parte de las colonias bacterianas que pudimos apreciar después de realizar la
tinción gram eran del tipo gram positivas y probablemente del género Bacillus
sp. coincidiendo así con la diversa bibliografía encontrada.
 Se concluye también que hubo muy poca actividad enzimática de parte de los
microorganismos celulíticos.

7. RECOMENDACIONES
 Mantener el área de trabajo limpio y ordenado.
 Trabajar cerca al mechero Bunsen.
 Lavar bien los portaobjetos, asegurarnos que estén libres de grasa.
 Diluir y homogenizar de manera adecuada.
 Expandir bastante la muestra en el agua destilada, para evitar muestras muy
concentradas en el microscopio.
 Limpiar el microscopio con papel lente.
 Usar suficiente fijador y colorante, además tener cuidado al momento de hacer el
lavado con agua.

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8. BIBLIOGRAFÍA

 Buitrago, S., Sánchez, E., Guerrero, H.,(2014), Aislamiento de microorganismos

amilolíticos, celulolíticos y lignolíticos a partir del suelo de humedales de
Bogotá, SENNOVA , 1(1), 148-155.
 Canales, P.(2013), Caracterización molecular de bacterias amilolíticas aisladas
de las salinas de San Blas – Junín(Tesis de pregrado), Universidad Nacional
Mayor de San Marcos, Perú.
 Sánchez, C., Mejía, C., Figueroa C., Esquivia M., Agudelo L., Zapata, N. &
Gómez M.,(2005), Estudio de cepas nativas amilolíticas, Facultad de Química
Farmacéutica, 12(2), 21-28.
 Dávila, G., & Vázquez-Duhalt, R.(2006), Enzimas lignocelulolíticas fúngica
para fines ambientales, Mensaje Bioquímico, pp. 29-55.
 Gaitan D. & Perez I. (2007), Trabajo de Grado: Microbiología industrial.
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá.
 Castillo, F. et al.(2005), Microbiología ambiental, Tébar, Madrid.
 Ege, S.,(2000), Química Orgánica, Estructura y Reactividad, Tomo 2, Reverté,
Barcelona.
 Beyer, H. & Walter, W.(1987), Manual de Química orgánica(versión española
de la 19° edición alemana), Reverté, Barcelona.
 González. Y. González. O. & Nungaray. J. (2005), Potencial del bagazo de
agave tequilero para la producción de biopolímeros y carbohidrasas por
bacterias celulolíticas para la obtención de compuestos fenólicos, e–Gnosis, 3
(14), 1–18.
 Gupta. P. Samant. K. & Sahu. A. (2012), Isolation of cellulose–degrading
bacteria and determination of their cellulolytic potential,  Int J Microbiol,
2012(6), 1–5. doi: 10.1155/2012/578925.

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