LABORATORIO N2 MTODOS DE SEPARACIN: CROMATOGRAFA 1. Aspectos tericos de la cromatografa.

La cromatografa es una tcnica de separacin de solutos de una mezcla, que se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. A este disolvente se le llama fase mvil y el medio poroso puede ser la fase estacionaria, o bien servir de soporte a esta fase. Se habla de cromatografa en columna cuando la fase estacionaria o su soporte estn contenidos en una columna. La separacin cromatogrfica constituye un proceso dinmico que permite un intercambio continuo por desplazamiento de una fase con respecto a la otra. El diferente reparto de solutos entre las fases mvil y estacionaria es la causa de la separacin de los solutos. El soluto que tiene mayor afinidad por la fase estacionaria se mover con mayor lentitud. La fase mvil se llama eluyente. Cuando emerge por la salida de la columna se llama eluato. El proceso que consiste en hacer pasar un lquido o un gas a lo largo de la columna de cromatografa se llama elucin. El volumen de elucin (ve) es el volumen de fase mvil que se requiere para eluir un soluto dado de la columna cromatogrfica. Se puede clasificar las cromatografas en 5 grandes grupos: Cromatografa de Reparto. Cromatografa de Adsorcin. Cromatografa de Intercambio Inico. Cromatografa de Exclusin. Cromatografa de Afinidad.

Cromatografa de Reparto: Est basada en la separacin o reparto de una mezcla de solutos entre la fase mvil (disolvente) y la fase estacionaria soportada sobre un slido adecuado, de acuerdo a las distintas solubilidades de estos solutos en ambas fases. Si el disolvente es un lquido se denomina cromatografa lquida. Son cromatografa de reparto la cromatografa en papel y la cromatografa en capa fina (TLC). La cromatografa en papel se utiliza para la separacin de cantidades mnimas de soluto y tambin como un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs de una fase estacionaria que es el agua retenida sobre un soporte slido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente en movimiento. Una vez realizada la cromatografa, la posicin de los componentes se determina mediante una tcnica que permita visualizarlos. Es comn revelar el cromatograma mediante reacciones que originen productos coloreados. 8

Los componentes de una mezcla se pueden identificar por su migracin con respecto al solvente mvil en condiciones definidas en relacin con el comportamiento de patrones. El cromatograma no es alterado por la presencia de otros solutos. Se calcula la razn de migracin del soluto con respecto a la fase mvil ( Rf ) que se compara con la de los patrones (Ec. 2.1).
Rf = distancia recorrida por el soluto distancia recorrida por la fase mvil

Ecuacin 2.1

El Rf debe calcularse de acuerdo a la distancia recorrida por el soluto, desde su punto de partida hasta el punto medio de la posicin de ste una vez corrida la cromatografa, y la distancia recorrida por la fase mvil, tambin medida desde el punto de partida del soluto hasta el frente del solvente en el papel. Como los Rf son constantes en condiciones definidas y controladas permiten identificar los componentes de una mezcla de solutos, en la medida que los Rf de muestras y patrones se obtengan en un mismo experimento. b. Cromatografa de Adsorcin: Est basada en la diferente adsorcin y posterior desorcin de sustancias contenidas en un disolvente mvil (lquido o gas) sobre un slido estacionario. No se debe confundir la adsorcin que es un fenmeno de superficie que se manifiesta por el aumento de concentracin de la interfase que rodea al medio estacionario, con la absorcin que consiste en la penetracin de una sustancia en el seno de otra. Ejemplos de cromatografa de adsorcin son la cromatografa en columna de almina y de carbn activado, la placa de slica gel. c. Cromatografa de Intercambio Inico: La fase estacionaria es una matriz polimrica porosa que posee grupos inicos unidos covalentemente y contraiones mviles que pueden ser intercambiados por iones arrastrados por la fase mvil (lquido). d. Cromatografa de Exclusin Molecular: Las molculas pueden ser separadas tambin sobre la base de sus diferentes tamaos al pasar a travs de una columna que contiene partculas hidratadas de geles porosos. Se encuentra en el mercado un buen nmero de materiales para estos fines, cuya composicin y porosidad son controladas cuidadosamente, de modo que molculas de tamao relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada seleccin del tamao del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partculas pequeas de dextrano formadas por una red tridimensional de cadenas de polisacridos ramificados. Es altamente polar debido a su alto contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha considerablemente cuando se coloca en agua. La mezcla de molculas grandes y pequeas se colocan sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la columna, las molculas pequeas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un camino ms largo, mientras que las molculas grandes pueden ser completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una 9

separacin completa en la que las molculas grandes salen primero de la columna y por ltimo las ms pequeas. El resultado de la columna cromatogrfica se expresa en la forma de un diagrama de elucin que muestra la variacin de la concentracin del soluto en el eluyente versus el volumen del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama se obtiene el volumen de elucin. El volumen de elucin (Ve) no es un criterio para definir el comportamiento de un compuesto, ya que vara con el volumen total de la columna ( Vt) y la forma como la columna ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante Kav (Ec. 2.2).

K av =

v v v v
e t

0 0

Ecuacin 2.2

En cromatografa de exclusin el volumen de la fase mvil se llama volumen intersticial (V0). El valor de V0 se determina haciendo pasar por la columna una molcula grande e inerte de peso molecular superior al lmite de exclusin del gel. El azul de dextrano 2000, un colorante con peso molecular de 2*10 6, se utiliza generalmente con este propsito. Cuando no se dispone de la informacin adecuada para este clculo, el Vo se puede estimar como el 35% del volumen total de la columna ( Vt). El volumen total de la columna se calcula a partir de las dimensiones de la columna (V t = r2 h ). De los cuatro tipos de cromatografa, en este laboratorio se usar la cromatografa de reparto en papel y la de exclusin sobre Sephadex G-25. 2. Objetivos. Identificar aminocidos de una muestra problema mediante la cromatografa de reparto en papel. Separar diclorofenol-indofenol y hemoglobina ocupando la tcnica de cromatografa de exclusin.

10

Parte experimental. 3.1 Materiales espectrofotmetro / celdas. 1 cmara cromatogrfica 6 capilares 1 papel filtro (14 cm de ancho) 1 pizeta 2 placas de porcelana 1 columna cromatogrfica de Sephadex G-25 hidratado 1 manguera y regulador 1 pipeta graduada de 1 ml 1 pipeta graduada de 5 ml 1 vaso precipitado de 250 ml 1 vaso precipitado de 150 ml 2 gradillas 20 tubos de ensayo 3.2 Reactivos leucina, glicina, lisina y prolina (1mg/ml) (patrones) solucin n-butanol / cido actico/ H2O en relacin 3:1:1 (fase mvil). ninhidrina 0,2 % en etanol. tampn fosfato 67mM pH 7,0 / NaCl 0,1 M .

4. Procedimiento. 4.1 Cromatografa de reparto en papel para separacin e identificacin de aminocidos. Coloque con anticipacin la fase mvil en la cmara cromatogrfica y tape la cmara, de modo que se sature con los vapores de esta fase. Tome el papel de un borde (superior) ocupando guantes de goma para evitar contaminarlo con aminocidos o protenas que se encuentren en las manos. Corte el papel filtro como un rectngulo de 30 cm de alto y 14 cm de ancho. Marque con lpiz grafito una lnea a lo ancho del papel a 1,5 cm del borde inferior. Marque puntos en esta lnea separados por una distancia de 1,5 a 2,0 cm entre si. Coloque con un capilar fino, diferente para cada muestra, las soluciones de los aminocidos patrones y las muestras problemas sobre la lnea marcada. Identifique siempre con lpiz grafito cada aplicacin. Enganche la tira de papel filtro en la parte superior de la cmara cromatogrfica que se encuentra saturada con los vapores de la fase mvil. Deje el borde inferior del papel sumergido 1,0 cm en la fase mvil. 11

Deje que la fase mvil ascienda unos 15 cm aproximadamente, no permita que el lquido sobrepase el borde superior y saque el papel de la cmara. Deje secar a temperatura ambiente. Revele la cromatografa rociando el papel con ninhidrina y secando el cromatograma en una estufa a 80 90C. Los aminocidos aparecen como manchas prpuras y amarillas. Marque el centro de las manchas de los aminocidos, mida el avance de cada muestra y del frente del solvente a la altura de cada muestra. Calcule la razn de migracin de los solutos con respecto a la fase mvil (R f) (Ec. 2.1).

4.2 Separacin de la hemoglobina (Hb) del colorante diclorofenol-indofenol (DCPIP) por cromatografa de exclusin en Sephadex G-25 (1- 5 kD). Abra la llave reguladora del flujo de la columna cromatogrfica y deje salir el tampn hasta que quede al nivel del Sephadex, una vez realizado, detenga el flujo cerrando la llave. Agregue 0,5 ml de la muestra problema sobre la superficie del gel de la columna cromatogrfica y mantenga el flujo detenido. Recolecte y mida el volumen eluido a partir de este momento. Conecte la columna a la fase mvil y regule el flujo a 10 gotas por minuto mediante las llaves reguladoras. Recoja fracciones de 3,0 ml del eluyente hasta que toda la muestra haya eluido. Mida la absorbancia de todas las fracciones recolectadas a 420 nm (Hb) y 580 nm (DCFIF) Mida la absorbancia de las muestras recogidas a 420 (Hb) y 580 nm ( DCFIF). Grafique en un grfico la absorbancia versus el volumen de elucin a ambas longitudes de onda. Determine el Kav para cada constituyente de la mezcla segn la Ec. 2.2.

5. Bibliografa Robert Bohinski, 1991. Bioqumica, 5 Edicin, Addison-Wesley, Iberoamericana. Donald Voet and Judith G. Voet, 1998. Biochemistry. John Wiley & Sons. A.L. Lehninger, D.L. Nelson and M.M. Cox, 1993. Principles of Biochemistry (Second Edn.) Worth Publishers.

12