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UNIVERSIDAD CATLICA DE LA SANTSIMA CONCEPCIN FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE MEDICINA DEPTO. DE BIOQUMICA

INTEGRANTES: FERNANDA FUENTEALBA ULLOA VALENTINA FUENTES CONAPIADO MACARENA LOBO BLANC CARLA MORA VOGT ROMINA PULVERMLLER SALVATIERRA JONATHAN RIQUELME TAPIA DOCENTES: Dr. REGINALD DEL POZO, Ph.D. BQ. MIRNA MUOZ, M.Sc. FECHA: MIRCOLES 30 DE JUNIO DE 2010

2 INDICE

OBJETIVOS INTRODUCCIN
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES INICOS PROCEDIMIENTO FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIN RESULTADOS

02 03 04 04 05 06 08 09 09 11 12 12 13 13

APLICACIONES
MEDICIN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA DETERMINACIN DE PBG Y ALA EN ORINA EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS OTRAS APLICACIONES

CONCLUSIN BIBLIOGRAFA

OBJETIVOS
Desarrollar el concepto de las tcnicas cromatogrficas a nivel general. Comprender los principios de la cromatografa de intercambio inico. Analizar paso a paso el mtodo de la tcnica y los distintos tipos de intercambiadores inicos que permiten su funcin. Determinar los factores que afectan, interfieren o alteran el procedimiento y su correcta ejecucin para lograr el objetivo deseado. Reconocer las distintas aplicaciones preferentemente en el mbito mdico y la importancia de esta tcnica cromatogrfica.

3 INTRODUCCIN
Para el estudio de las sustancias se deben ocupar diversas tcnicas, que han ido evolucionando con el paso de los aos. Una de las tcnicas ms bsicas es la cromatografa, en sus mltiples variantes. Esta tcnica se da desde siempre en la naturaleza, como en lo que efectan las piedras, que permiten purificar el agua. La cromatografa como tal adquiere importancia cuando en 1850 el qumico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubri que los cationes orgnicos se separaban por migracin cuando se depositaba una disolucin que los contena sobre un material poroso, como papel. El botnico ruso Mijal Tswett emple por primera vez en 1906 el trmino "cromatografa" (que proviene del griego y qu e significan respectivamente chroma "color" y graphos "escribir"). Segn la definicin dada por Keulemans la cromatografa es un mtodo de separacin en el que los componentes a desglosar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a travs o a lo largo del lecho estacionario. Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografa de forma ms amplia como (1): Mtodo usado principalmente para la separacin de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es mvil. La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido soportado en un slido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una pelcula, etc. Se basa en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenmenos de interaccin que se dan entre las dos fases y que pueden ser: 1. La adsorcin, que es la retencin de una especie qumica por parte de los puntos activos de la superficie de un slido quedando delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2. La absorcin, que es la retencin de una especie qumica por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorcin pura, o a reaccionar qumicamente con la misma, absorcin con reaccin qumica, considerando ambas como un fenmeno msico y no superficial. A comienzos del ao 1903, Mijail Tsvet us columnas de adsorcin de lquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacan pasar a travs de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido de un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que stos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de la columna.

Imagen 1. Separacin de clorofilas mediante cromatografa en papel.

La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas, como son el de separar los componentes de la mezcla, para as purificarlos, o para medir las proporciones de los componentes. Existen mltiples tipos de cromatografa, que se pueden separar en dos grandes grupos: a) Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son: Cromatografa en papel, Cromatografa en capa fina. b) Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna.

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Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen: Cromatografa de lquidos, Cromatografa de gases, Cromatografa de fluidos supercrticos. El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico(3) es que las molculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente inico. La separacin mediante intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y estable; a continuacin, se eluye de la columna con tampones de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del tampn con el material, por los sitios de unin.

Dentro de la cromatografa en columna de lquidos, estn un grupo de tcnicas, dentro de las que queremos destacar la cromatografa de intercambio inico, que ocupa en su fase mvil un liquido polar, y estacionaria un slido. Esta cromatografa es un proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basadas en las propiedades de carga de molculas. Esta tcnica apareci durante la II Guerra Mundial y en principio tena la finalidad de separar las tierras raras y los elementos de transicin. En 1938 Taylor y Urey utilizan este mtodo para separar istopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de intercambio inico. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula cargada incluyendo grandes protenas, pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que debe inyectarse es usualmente llamada muestra y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad(2).

B Imagen 2. (A) Con una fase estacionaria cargada negativamente son retenidas las sustancias cargadas positivamente. (B) Deben competir con los contraiones (del amortiguador). (C) Las sustancias cargadas negativamente pasan a travs de la face estacionaria sin enlazarse.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

La cromatografa de intercambio inico es un mtodo de separacin que permite la separacin de molculas basada en sus propiedades de carga elctrica. Se compone de dos fases, la fase estacionaria o intercambiador inico y la fase mvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostticas fijas, que retienen contraiones mviles que pueden intercambiarse por iones de la fase mvil La fase mvil en cromatografa de intercambio inico suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas en forma, generalmente de buffer. Los iones de la fase mvil compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria. PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES INICOS Un intercambiador inico es, por lo general, un polmero que tiene grupos cargados unidos. Si un grupo est cargado negativamente, podr intercambiar iones positivos y ser un intercambiador de cationes o catinico. Un grupo tpico que se utiliza en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfnico, SO3-. Si se une un H+ al grupo, se dice que el intercambiador se encuentra en forma cida, y puede por ejemplo intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca2+. El grupo cido sulfnico es un intercambiador de cationes fuertemente acido. Otros grupos de utilizacin corriente son el carbonilo e hidroxilo fenlico, dos intercambiadores catinicos

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dbilmente cidos. Si el grupo cargado es positivo (por ejemplo un grupo amino cuaternario), es un intercambiador de aniones o aninico fuertemente bsico. Los intercambiadores aninicos dbilmente bsicos ms corrientes son grupos aminos alifticos o aromticos.
A

Para una correcta eleccin de la porosidad y del tamao de la malla es necesario tener en cuenta que las molculas pequeas se separan mejor sobre matrices con tamao de poro pequeo (o sea, un elevado grado de entrecruzamientos) debido a que la capacidad disponible es grande, mientras que las macromolculas necesitan un tamao de poro mayor. Los intercambiadores de celulosa han probado ser los mejores para la purificacin de molculas grandes como protenas y polinucletidos. Ello es debido a que la matriz es fibrosa, por lo que todos los grupos funcionales se encuentran en la superficie y disponibles, incluso, para las molculas mayores. PROCEDIMIENTO Para realizar una cromatografa de intercambio inico son necesarios los siguientes materiales: (1) Columna de vidrio, (2) Matriz de intercambio inico (Resina), (3) Eluyente, (4) Muestra a fraccionar y (5) Colectores(4). La mayora de los experimentos basados en esta tcnica estn basados en 4 etapas(5). 1. Equilibrio: El primer paso es el equilibrio de la fase estacionaria con las condiciones iniciales deseadas. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones complementarios (que pueden ser cloro o sodio). Por ejemplo, un intercambiador catinico sulfonado asociado a Na+ producto de la disociacin de NaOH. 2. Aplicacin y Lavado: El paso siguiente es aplicar la muestra la cual queremos filtrar a travs de la columna mediante un lavado especfico. Para ello es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y fuerza inica que el buffer inicial para que todas las protenas cargadas se unan al intercambiador. Por ejemplo: A la forma sdica de la resina lavada se le aade una solucin cida (pH=3) de la mezcla de aminocidos; a dicho pH los aminocidos se encuentran en forma de cationes con carga neta positiva. Los aminocidos catinicos tienden a desplazar algunos de los iones ligados a las partculas de resina. A pH 3 los aminocidos ms bsicos se unirn a la resina de forma ms estrecha y los ms cidos o menos bsicos, se unirn menos.

Imagen 3. Estructuras de Resinas Intercambiadoras de Cationes. (A) Resina de poliestireno, cido fuerte (Dowex-50). (B) Resina de carboximetil celulosa, cido dbil (CM Cellulose). (C) Resina de poliestireno, cido dbil y quelante (Chelex-100).

La matriz puede estar hecha de diferentes materiales. Los de uso ms corriente son el dextrano, la celulosa y copolmeros del estireno y divinilbenceno, en los que el divinilbenceno contie los grupos cargados y se entrecruza con las cadenas de poliestireno. La eleccin entre intercambiadores fuertes o dbiles est basada en el efecto del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se va a cromatografiar una sustancia dbilmente cida que necesita pH muy altos o muy bajos para su ionizacion, se requiere un intercambiador fuerte debido que este funciona a pH extremos. No obstante, si la sustancia es lbil, es preferible la utilizacion de intercambiadores dbiles. Los intercambiadores dbiles son tambien excelentes para la separacion de molculas con una carga elevada de aquellas con poca carga, debido a que los iones debilmente cargados no se unen, por lo general, al intercambiador. Los intercambiadores dbiles permiten, asimismo, una mayor resolucion de las sustancias si las diferencias de carga son muy pequeas.
A

Imagen 4. Estructuras de Resinas Intercambiadoras de Aniones. (A) Resina de poliestireno, base fuerte (Dowex1). (B) Resina de dietilaminoetil celulosa, cido dbil (DEAE).

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A B C D C D E

Imagen 5. Fases del procedimiento de cromatografa de intercambio inico. (A) Fase de Equilibrio en la parte inferior. (A) y (B) Aplicacin. (C) Elusin. (D) Regeneracin.

Imagen 6. (A) Resina de intercambio catinico antes de aadir la muestra. (B) Se aade la muestra, una mezcla de Asp, Ser y Lys. (C) Se aade Na+ (NaCl), el Asp, el aminocido con menos carga positiva eluye el primero. (D) Se aumenta el Na+, a continuacin eluye la Ser. (E) Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee ms carga positiva eluye el ltimo.

FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIN Tiempo de retencin (Tr): se describe como el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que la mayor concentracin del analito alcanza el detector (cuando se ha separado todo el analito), es decir, el tiempo que un compuesto tarda en salir de la columna. En la cromatografa de intercambio inico la retencin est basada en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones de mayor carga y radio inferior. Cuando la retencin de los compuestos se ve afectada, se favorece la elusin de ellos para ser recolectados en una serie de fracciones. pH: Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos, fuertes o dbiles. Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas, en cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catinico, reducindose as, el tiempo de retencin. Los grupos muy bsicos de amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y pierden entonces su capacidad, reducindose tambin el tiempo de retencin. Cargas: La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la carga. La fuerza de retencin es mayor y, por consiguiente la de elusin es menor, mientras ms cargado se encuentre el compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes). Los iones

3. Elusin: Las molculas captadas por el intercambiador son eludas debido a cambios en la composicin del buffer. Una manera comn es incrementando la fuerza inica con cloruro de sodio u otra sal comn. Los aminocidos sern eludos dependiendo de la carga neta que estos posean. A medida que se aumenta gradualmente el pH y la concentracin de NaCl del medio eluyente acuoso, los aminocidos descienden en la columna a velocidades diferentes y pueden recogerse en muchas pequeas fracciones. La disminucin del pH protonar a los grupos de los aminocidos por lo que su carga neta tender a ser positiva, al revs si se aumenta el pH. Si se aumenta la concentracin de sal, sus iones competirn mucho ms por la resina y se intercambiarn por los grupos de aminocidos. Las diversas fracciones pueden analizarse cuantitativamente mediante la reaccin con ninhidrina. Los aminocidos aninicos aparecen primero y los ms catinicos aparecen posteriormente (con un intercambiador catinico). 4. Regeneracin: Por ltimo, remover las partculas que an estn asociadas al intercambiador. Para ello se debe generar un cambio ms drstico en el pH y la concentracin salina. Ahora la fase estacionaria puede volver a ser utilizada.
A B

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polivalentes se unen con mayor fuerza a la fase estacionaria que los monovalentes. Porosidad: El tamao del poro de la resina al que se une el compuesto mvil por intercambio inico influye directamente en la capacidad de unin. En membranas cuyo tamao de poro es pequeo (menor de 600) no hay espacio suficiente para unir el in dentro de dichos poros por lo que la cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor. Sin embargo, en membranas con tamao de poro mayor (mayor de 600) se puede unir el compuesto mvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la cantidad de intercambiador por unidad de superficie. La porosidad busca una mayor superficie de intercambio.

Imagen 7. Muestra el intercambio catinico a la izquierda desde los menos absorbidos a los ms absorbidos. A la derecha se muestra la fuerza eluyente en el intercambio aninico.

Gradiente: Aumentando la concentracin de la fase mvil, los iones compiten cada vez ms favorablemente con la muestra por los sitios activos cargados de la fase estacionaria.

Imagen 9. Donde existe mayor porosidad (derecha), se puede unir el compuesto mvil dentro de estos poros incrementando la cantidad de intercambiador de superficie.

Imagen 8. Esquema del gradiente del Buffer con contraiones cargados negativamente. Se presenta un grfico con el poder de elusin (fuerza inica) y el porcentaje de protena eluda, que muestra una gradiente directamente proporcional.

Supresor es de iones: La cromatografa inica tard en desarrollarse debido a la falta de un buen sistema de deteccin. La eleccin evidente es un detector conductimtrico. El problema es debido a la elevada concentracin inica necesaria para eluir a la mayora de los iones en un tiempo razonable. Ello hace que la conductibilidad de la propia fase mvil sea muy elevada haciendo muy difcil la deteccin de pequeas concentraciones de analito. Este problema se resolvi mediante un sistema supresor de conductibilidad colocado a la salida de la columna cromatogrfica. Los primeros supresores fueron columna de intercambio inico que convierten los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas y por lo tanto poco conductoras. As, por ejemplo, cuando se separan cationes es frecuente emplear una

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disolucin de HCl como eluyente. La columna supresora es anionica y contiene iones OH-. Al paso de la fase mvil por la columna supresora los Cl- son intercambiados por iones OH-. De este modo se ha sustituido el HCl muy conductor por H2O poco conductora. En la separacin de iones es frecuente usar HCO3Na y CO3Na2 en la fase mvil. La columna supresora es en este caso catinica. De este modo el Na+ es sustituido por H+ formndose un electrolito dbil como H2CO3.
A

diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada.
A B

Imagen 11. Cromatograma. (A) Aniones. (B) Cationes.

La cromatografa inica es una variante de la cromatografa lquida de alta presin (HPLC). Es un mtodo eficaz para la separacin y determinacin de iones, basado en el uso de resinas de intercambio inico. Cuando una muestra inica atraviesa estas columnas, los iones presentes sufren una separacin debido a las diferentes retenciones que sufren al interactuar con la fase fija de las columnas analticas. Una vez separada, la muestra pasa a travs de un detector (conductimtrico, amperomtrico, UV, etc.) donde se registra la seal obtenida respecto al tiempo de retencin. El resultado son los cromatogramas donde la posicin de los mximos nos indica el in presente (carcter Cualitativo) y su rea nos indica la cantidad existente de dicho in (carcter Cuantitativo)(6).
Imagen 12. El Servicio de Anlisis del ICB dispone de un cromatgrafo inico Metrohm con columna Metrosep A Supp 5 y detector conductimtrico, que se emplea en la determinacin de fluoruros, cloruros, nitritos, nitratos, bromuros fosfatos y sulfatos.

Imagen 10. (A) Esquema del mecanismo de supresin de iones. (B) Reacciones de supresin de iones.

RESULTADOS El cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de separacin ptima, los

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MEDICIN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA La diabetes mellitus(7) es una condicin metablica de incidencia creciente, caracterizada por disfuncin en la homeostasis de la glucosa, con hiperglicemia crnica por inmunodeficiencia absoluta o relativa. La enfermedad es progresiva y asociada con alto riesgo de desarrollar compromiso vascular. La determinacin de los niveles de glucosa en sangre y orina y de los cuerpos cetnicos en la orina suministran una informacin muy til para el tratamiento diario de la diabetes. Sin embargo, ninguno de estos tests facilita al paciente y al equipo de cuidados mdicos un valor representativo y cuantitativo de la glicemia a lo largo del tiempo. La determinacin de las protenas glicosiladas, sobre todo de la hemoglobina y de las protenas sricas, ha aadido una nueva dimensin a la evaluacin de la glicemia. Mediante una simple medida, estos tests permiten cuantificar los valores de la glicemia media durante semanas e incluso meses, complementando los anlisis que el paciente lleva a cabo da a da. La hemoglobina(8) es una protena que se encuentra en los glbulos rojos de la sangre (hemates) y sirve para aprovisionar de oxgeno al resto de nuestras clulas y tejidos. Esta protena se une a la glucosa circulante por el torrente sanguneo. El porcentaje de protena unida a la glucosa es lo que se denomina hemoglobina glicosilada (HbA1). Esto sucede tambin en las personas sin diabetes. Cuanto mayor es la cantidad de glucosa en la sangre, ms se une a las protenas y su porcentaje de unin indica cual ha sido la cantidad media de glucosa circulante durante el tiempo de vida de la hemoglobina. La HbA1 describe una serie de componentes estables minoritarios de la hemoglobina que se forman lentamente y sin intervencin enzimtica, a partir de la hemoglobina y la glucosa. La velocidad de formacin de HbA1 es directamente proporcional al nivel de glucosa en la sangre y al ciclo de vida de las protenas glicosiladas. La hemoglobina es una de las protenas de la sangre que pueden glicosilarse en proporcin a la concentracin de glucosa en plasma, dependiendo solamente de la concentracin de glucosa y del tiempo de exposicin celular a la misma. Como los eritrocitos son fcilmente permeables a la glucosa, el nivel de la HbA1 en una muestra de sangre facilita la historia glicmica de los 120 das anteriores, que corresponde a la vida media de estas clulas. En la mujer en gestacin, el estado de la glicemia se relaciona con las ltimas 4 semanas precedentes debido al acelerado recambio de los eritrocitos. La American Diabetes Association recomienda que el objetivo de todo tratamiento debe ser un valor de la HbA1 menor a 7% y que los mdicos deben de reevaluar cualquier rgimen de tratamiento en el que los valores sean consistentemente mayores de 8%. Estos valores especficos de la HbA1 se refieren slo a los que han sido obtenidos por medios validados frente al mtodo de referencia(9). HbA1c (%) 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 10-11 11-12 Promedio de Glicemias (mg/dl) 80-120 120-150 150-180 180-210 210-240 240-270 270-300 Calificacin Excelente Muy Bueno Bueno Regular Problemtico Malo Muy Malo

Tabla 1. La hemoglobina glicosilada (HbA1c) refleja la concentracin de la glucosa en los ltimos 120 das. El porcentaje de HbA1c se aumenta en proporcin a las cifras de glicemia que han precedido en las ltimas 6-8 semanas. En general por cada 1% de aumento en la HbA1c, evidencia un incremento en los promedios de glicemia de aproximadamente 30mg/dl. Una HbA1c de 6% refleja un promedio de glicemia de 120mg/dl. Es deseable que las personas con diabetes mantengan un promedio de HbA1c inferior a 7%.

Existen varios mtodos para la determinacin de la hemoglobina glicosilada, a manera informativa se encuentran las pruebas inmunoqumicas, la electroforesis, la cromatografa de afinidad al borato, la cromatografa lquida de alta presin y la cromatografa de intercambio inico. El mtodo de cromatografa de intercambio inico(10) se basa en la elusin diferencial de la hemoglobina glicosilada por el cambio de carga que se produce en la molcula debido a la glicacin del grupo amino terminal de la cadena. Para realizar el procedimiento se utiliza carboximetil celulosa cargada (-).

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El valor de la HbA1c ha mostrado su utilidad para predecir el riesgo del desarrollo de muchas de las complicaciones crnicas de la diabetes. La determinacin de la HbA1c debe ser realizada rutinariamente en todos los pacientes con diabetes, en primer lugar para documentar el grado de control glicmico al inicio del tratamiento, y luego como parte del mismo. Para cada paciente individual, la frecuencia de la determinacin de HbA1c depender del rgimen de tratamiento utilizado y del criterio del mdico. En ausencia de estudios bien controlados que sugieran un protocolo definido, la opinin de los expertos es que se deben practicar al menos dos determinaciones de la hemoglobina glicosilada en los pacientes bien controlados que se mantienen estables y al menos cada tres meses en sujetos que no han alcanzado un nivel de glicemia ptimo o en los que se ha modificado el tratamiento. Como cualquier otro parmetro, la hemoglobina glicosilada puede resultar modificada por alteraciones que varen el natural recambio de los glbulos rojos, tales como por hemorragias, anemia hemoltica, transfusiones, embarazos, etc., situaciones que produciran falsos descensos. Tambin se puede ver alterada por la ingestin de dosis elevadas de cido acetil saliclico, vitamina C, alcohol, altas cifras de lpidos en sangre, etc., que conduciran a falsos aumentos. La HbA1c puede valorar adems el xito del tratamiento antidiabtico; permite comparar y comprobar la eficacia de nuevos tratamientos; nos posibilita determinar la duracin de la hiperglicemia y a su vez individualizar los regmenes del control antidiabtico.
Imagen 14. La glucosa se una de las cadenas de la hemoglobina en el extremo Val terminal, transformando la HbAo en HbA1c.

Imagen 13. Esquema de las variantes de hemoglobina encontradas en el torrente sanguneo; incluye el porcentaje de HbA1 en estados normales en la sangre para el control de la glicemia.

La hemoglobina adulta humana usualmente consiste de HbA (97% del total), HbA2 (2,5%) y HbF (0,5%). El anlisis cromatogrfico de la HbA identifica distintas hemoglobinas menores llamadas HbA1a, HbA1b, HbA1c, que colectivamente se denominan HbA1, glicohemoglobinas o hemoglobinas glicadas. La hemoglobina glicosilada A1c es el componente mayoritario (80%) de la hemoglobina A1. La HbA1c es el resultado de la condensacin de la glucosa con la valina N-terminal de la cadena de la hemoglobina. La incorporacin de glucosa es un proceso no enzimtico e irreversible.

La hemoglobina glicosilada es muy importante, sin embargo no puede sustituir al monitoreo de glicemias, ya que sta no puede medir su control diario y por lo tanto no le permite ajustar sus dosis de

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medicamentos orales, de insulina, de actividad fsica o de ingesta de alimentos en el da a da. DETERMINACIN DE PBG Y ALA EN ORINA Las porfirias son un grupo de enfermedades de origen gentico o adquirido que tienen como caracterstica comn una alteracin en la actividad de una o varias enzimas de la va metablica del grupo HEM, lo que ocasiona niveles anormalmente elevados de porfirinas o sus precursores (p. ej., cido deltaaminolevulnico [ALA] y porfobilingeno [PBG]). Estos se acumulan en los tejidos y se excretan en la orina y las heces. Las manifestaciones patolgicas son producidas casi en su totalidad por los efectos sobre el sistema nervioso y la piel (11). La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es una de las ms comunes y severas de las porfirias heredadas. Es un desorden autosmico dominante, que causa deficiencia parcial de la actividad de la porfobilingeno desaminasa (PBGD), tercera enzima de la ruta de sntesis del grupo HEM.

Imagen 15. Estructuras qumicas del Aminolevulinato y del porfobilingeno.

Las variedades de porfiria que presentan sobreproduccin de los precursores de las porfirinas cido delta aminolevulnico (ALA) y porfobilingeno (PBG)- suelen presentar crisis agudas, las que pueden ser muy graves y causa de muerte. Estas crisis se caracterizan por sntomas digestivos (dolor clico, vmitos, estreimiento), neuropsquicos (paresias, parestesias, parlisis, confusin, depresin, alucinaciones y psicosis), cardiovasculares (taquicardia e hipertensin) y otros (secrecin inadecuada de la hormona antidiurtica, intolerancia a la glucosa, alteracin de los niveles de la hormona del crecimiento e hipercolesterolemia). Su patogenia ha sido explicada en parte por un efecto neurotxico del ALA y PBG, y por un dficit del grupo HEM(12). Los pacientes con variedades de porfirias que presentan produccin aumentada de porfirinas manifiestan fotosensibilidad debido a la activacin de estos compuestos por accin de la luz UV. Las alteraciones cutneas se caracterizan por eritema y ampollas, que al mejorar dejan cicatrices hiper o hipopigmentadas.

Imagen 16. Signos de una crisis aguda de porfiria. Cambio de Porfobilingeno de coloracin normal a Uroporfiria I en la orina reposa.

Cuando los pacientes con PAI presentan una crisis aguda, disminuye la actividad de la PBGD y, como consecuencia los niveles de Porfobilingeno (BPG) y/o cido 5- Aminolevulnico (ALA) en la orina se incrementan significativamente. Por lo cual es necesario contar con un mtodo que cuantifique estos precursores metablicos para una pronta confirmacin del diagnstico e inicio del tratamiento. Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta de 20 a 200 mg/da, cuyos valores de referencia son de 0-4 mg/da, y la excrecin de ALA se eleva aproximadamente a la mitad, 10-100 mg/da, cuando sus valores de referencia son 0-7mg/da. El mtodo de Mauzerall-Granick y otros parecidos son los ms usados para la cuantificacin de estos dos precursores(13). Este mtodo se basa en la tcnica de cromatografa de intercambio inico, en la cual se utilizan columnas con resinas aninicas y catinicas. El PBG se queda retenido en la aninica y el ALA en la catinica. En la columna con PBG, se utiliza cido

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actico 1M para que ste eluya y pueda ser cuantificado. En la columna con ALA, se le agrega acetato de sodio 1M para que ste eluya y sea cuantificado. Luego, el eluido de cada columna reacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un producto rojo intenso. Este reactivo est conformado por 4-dimetilbenceno diluido en cido actico y cido perclrico. El producto es medido espectrofotomtricamente a 553 nm, y a partir de esta medicin se puede calcular la concentracin de estos intermediarios. En casos de intoxicacin por plomo pueden detectarse concentraciones de ALA elevadas en orina tambin, ya que el plomo puede bloquear la va metablica en la que interviene el ALA. Por lo tanto, la determinacin conjunta de ALA y PBG permite diferenciar las porfirias de la intoxicacin por plomo(14). EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS La cromatografa de intercambio inico es el mtodo ms utilizado para la separacin de cidos nucleicos. Un cido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unir a un intercambiador inico con grupos cargados positivamente, pero eluir de la columna al cambiar el pH del tampn (tampn de elusin) ya que los iones del tampn de elusin interaccionan con los grupos cargados del cido nucleico o del intercambiador inico. Primero fluirn de la columna las molculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al aadir el tampn de elusin, eluiran las molculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta(15). Actualmente se utilizan dos tipos de intercambiadores aninicos(16): el metilaminoetanol (MAE) o el dietilaminoetil (DEAE). La unin del ADN (cargado negativamente) depende principalmente del componente estrico de los grupos funcionales y de la afinidad del intercambiador aninico por el respectivo cido nucleico; puesto que el grupo MAE es menos voluminoso y ms hidroflico que el DEAE, la unin de los cidos nucleicos a los primeros es ms efectiva que a los segundos. Una modificacin de este mtodo es la extraccin en fase slida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unin se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elusin se va incrementando la concentracin de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unin y se obtiene una rpida y eficiente purificacin de los cidos nucleicos (ADN y/o ARN). Al final los cidos nucleicos se eluyen con un tampn de mxima salinidad. Por ltimo, se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los restos de impurezas, finalmente, se reconstituye el ADN de elevada pureza en un tampn de baja salinidad para su posterior utilizacin o almacenamiento. Debido a la elevada pureza del ADN obtenido con esta tecnologa, la principal aplicacin de esta cromatografa es la purificacin de ADN plasmdico para transfeccin (introduccin de material gentico externo en clulas eucariotas mediante plsmidos). Esta tcnica incluye un pretratamiento de la muestra que consiste en una lisis bacteriana en condiciones alcalinas que ocasiona una desnaturalizacin del ADN cromosmico y plasmdico. Antes de la introduccin de la muestra en la columna se trata con acetato potsico, lo que ocasiona que el ADN cromosmico precipite junto con el resto de componentes de la muestra, mientras que el ADN plasmdico se renaturaliza y permanece en disolucin. OTRAS APLICACIONES Purificacin de agua Purificacin del fibringeno de la leche Determinacin de anticonvulsantes en el suero despus de la extraccin de la fase slida. Anlisis de antibiticos de politer Determinacin de pesticidas. Identificacin de cidos orgnicos en la fruta y en el jugo. Deteccin de derivacin-fluorescencia postcolumna para anlisis para varios tipos de pesticidas agrcolas . Determinacin de metabolitos de Triptofan en el suero umbilical.

13 CONCLUSIN
La cromatografa de intercambio inico, tambin llamada cromatografa inica o cromatografa del in, es una tcnica que permite la separacin de iones y molculas polares basada en las propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula con carga. La solucin que debe inyectarse es llamada "muestra" y los componentes separados individualmente; analitos. El intercambio inico es el intercambio reversible y estequiomtrico de iones entre una fase slida y una fase lquida. Si nos interesa separar analitos catinicos se utiliza una fase estacionaria que contenga sitios activos negativos, los cuales debern encontrarse unidos a algn catin que mantenga la electroneutralidad. Este catin deber ser desplazado por el analito para establecer el equilibrio y unirse al sitio aninico de la fase estacionaria. De manera anloga, para separar aniones se utilizan fases estacionarias con cargas fijas positivas que se encontrarn unidas a algn anin encargado de mantener la electroneutralidad, y que ser desplazado por el analito para el establecimiento del equilibrio. Diversos factores como el pH, cargas, gradiente y porosidad afectan el tiempo que un compuesto demora en eluir de la columna (tiempo de retencin). Los resultados se muestran en un cromatograma, que es una representacin grfica de los resultados obtenidos; en el caso de separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada. Este tipo de cromatografa presenta diversas aplicaciones, en este informe se mecionaron la determinacin de la hemoglobina glicosilada, determinacin de PBG y ALA en orina y separacin de cidos nucleicos, pero su uso no termina all, ya que hay numerosos usos ms, como por ejemplo, anlisis de protenas en la industria alimenticia con valor nutricional, y en la purificacin del agua; as como tambin a lo largo de la historia cobr relevancia en el Proyecto Manhattan durante la segunda guerra mundial para la fabricacin de la bomba atmica.

BIBLIOGRAFA
(1) http://www.textoscientificos.com/quimica/cromato grafia (2) Harris, Daniel C. Anlisis Qumico Cuantitativo, 3 Edicin, Editorial Revert. (Pgina 641). (3) Freifelder, D. Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular, Editorial Revert. (Pgina 217). (4) http://www.mnstate.edu/provost/IonExchangeProt ocol.pdf (5) http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivo s/Quimica%20analitica%20ambiental/Tema6.pdf (6) http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/ class/08_chrom.pdf (7) Costanzo, Linda S. Fisiologa, 2000, McGrawHill, Mxico. (Pgina 416). (8) http://www.diabetesalinstante.com/index.php?id= 7 (9) Hernndez Ventura, Jaime Roberto. Importancia de la Hemoglobina Glicosilada, SlideShare.net (Documento Power Point). (10) Hemoglobina Glicosilada, el marcador de la diabetes. Diagnostics Roche. (Folleto informativo) (11) http://manualmerck.tripod.com/MMCap14.htm (12) http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S021271992003000600012&script=sci_arttext (13) http://www.aebm.org/formacion%20distancia/dist ancia%202007-2008/taller/monografias/3.%20PORFIRIAS.pdf (14) http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos/CROM ATOGRAFIA/11017c.pdf (15) http://interware.org/labeutm2006/wpcontent/uploads/2007/09/practico-eutm.doc (16) http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluci ones-QPCR-protocolos.pdf **** Voet, Donald; Voet, Judith. Bioqumica 3a Edicin 2006
**** Texto base gua para todo el desarrollo y entendimiento de la investigacin sobre cromatografa de intercambio inico.