Métodos Instrumentales de Separación

Curso Académico 2014/15

UCLM

PRÁCTICA 1. SEPARACIÓN DE DROGAS EN

UNA MEZCLA UTILIZANDO LA
ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA

 OBJETIVO

El objetivo principal es la separación de una mezcla de drogas mediante electroforesis

capilar en zona, aprovechando la distinta movilidad de cada uno de los compuestos en
presencia un campo eléctrico y ajustando las condiciones experimentales (pH,
temperatura, presión…)

 INTRODUCCIÓN TEÓRICA

El equipo de electroforesis capilar en zona con el que trabajamos en esta práctica,

está formada por las siguientes partes:

- Inyector: Introduce las muestras

depositadas en los viales una a una de
forma automática(Electrolito de
separación para limpiar el capilar,
patrones y muestras problema)
- Electrodos: Zonas cargadas hacia donde
irán los compuestos en función de sus
características y las del medio ( Cátodo(-
), Ánodo(+) )
- Fuente de alto voltaje: Fuente externa
que proporcionará una diferencia de
potencial, tal que permita a los
compuestos moverse por el soporte
electroforético en un sentido u otro.
- Detector: Mide la señal eléctrica de cada
compuesto, reflejándolo en el
electroferograma.

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 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

A partir de las disoluciones madre de 100mg/L de ácido benzoico y ácido p-

hidroxibenzoico, se preparan cuatro disoluciones en matraces de 25 mL que contengan
las dos drogas.

Preparación disoluciones:

𝐶100 · 𝑉100 = 𝐶𝑥 · 𝑉25

𝑚𝑔
𝐶𝑥 ( 𝐿 ) · 25 (𝑚𝐿)
𝑉100 = 𝑚𝑔
100 ( 𝐿 )

𝑚𝑔
𝑆𝑖 𝑥 = 5 → 𝑉100 = 1,25 𝑚𝐿
𝐿
𝑚𝑔
𝑆𝑖 𝑥 = 10 → 𝑉100 = 2,5 𝑚𝐿
𝐿
𝑚𝑔
𝑆𝑖 𝑥 = 20 → 𝑉100 = 5 𝑚𝐿
𝐿
𝑚𝑔
𝑆𝑖 𝑥 = 40 → 𝑉100 = 10 𝑚𝐿
𝐿

Se prepara además, una disolución tampón 10mM borato pH 9,2 a partir de una
disolución madre 200mM.

𝐶200 · 𝑉200 = 𝐶10 · 𝑉25

10 𝑚𝑀 · 25𝑚𝐿
𝑉200 = → 𝑉200 = 1,25 𝑚𝐿
200 𝑚𝑀

Una vez que las disoluciones han sido preparadas, se introducen en viales color topacio
( un vial para cada patrón, dos para el electrolito de separación y otro para la muestra
problema).

En las posiciones 12 (exterior) y 1 (interior) se introducen los viales con el electrolito de

separación. En la posición 10 (interno) se introduce un vial vacío de desecho. Las
posiciones 14, 15, 16 y 17 se introducen los patrones de concentración 5ppm, 10 ppm ,
20ppm y 40ppm respectivamente. Por último, en la posición 18 se introduce el vial que
contiene la muestra.

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Hay que tener en cuenta el secado previo de los tapones de los viales, así como de la
boca del vial. Si están mojados, se produce fuga de corriente. El equipo entonces no
detecta señal y se para, no hay separación.

En el software, hay que crear un método de trabajo. Hay que fijar una serie de
condiciones:

 Tª separación : 25ºC
 Barra de Diodos ( detector) : 190 – 300 nm // 4Hz

Se rellena el capilar con el electrolito de separación. Se seleccionan los siguientes

parámetros:
 Dirección : Ánodo  Cátodo
 Viales : 12  10 ( desecho)
 Presión : 10 psi
 Inyección : hidrodinámica por presión

Cuando inyectamos, se hace la separación.

 Condición : Voltaje constante ( V= 25kV)

 Rampa: 0 – 2 min. (si el voltaje se hace bruscamente se puede producir
expansión de la muestra).
 Separación : 4min

Una vez que se ha fijado el método de trabajo, hay que fijar una Secuencia de trabajo.
Marcamos las condiciones:

 Tipo de muestra : desconocida

 Orden viales: 14  15 16 17 18.
 Repeticiones : 1 ( para cuantificar se deberían de realizar 3 repeticiones)
 Método : el creado anteriormente

Al acabar el experimento se lleva a cabo un método distinto que se denomina

‘’parada’’, que limpia y lava el capilar dejándolo preparado para otros experimentos.

Cuando todos los parámetros han sido señalados, se lanza la secuencia y se registran
los electroferogramas de cada una de las disoluciones introducidas en el equipo.
Cuando se han recogido los electroferogramas, se selecciona en el software las
longitudes de onda dónde los compuestos presentan el máximo de absorción.

1º 𝑝𝑖𝑐𝑜 ∶ 193 𝑛𝑚
2º 𝑝𝑖𝑐𝑜 ∶ 196 𝑛𝑚

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Los dos picos absorben mucho a longitudes de onda próximas, por ello, se marca λ =
194 nm para llevar a cabo el estudio de los picos.

Los datos recogidos han sido los siguientes:

 PICO 1

PICO 1º tmigración Area A/tm

p1g1g2 2,721 48214 17719,22
p2g1g2 2,725 93275 34229,36
p3g1g2 2,737 169258 61840,7
p4g1g2 2,767 336581 121641,1
m1g1g2 2,746 170021 61915,88

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1º𝑝𝑖𝑐𝑜 𝑒𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 19,78 𝑚𝑔/𝐿

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 PICO 2

PICO 2º tmigración Area A/tm

p1g1g2 2,929 25691 8771,253
p2g1g2 2,908 43775 15053,3
p3g1g2 2,892 88428 30576,76
p4g1g2 2,875 175300 60973,91
m1g1g2 2,904 89563 30841,25

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 2º 𝑝𝑖𝑐𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ∶ 20,1 𝑚𝑔/𝐿

 CONCLUSIÓN

Para saber que compuesto es el que sale antes, si es el ácido benzoico o el

p-hidroxibenzoico, habrá que comprar la movilidad de uno y de otro.

El pH del tampón de separación es básico por lo que habrá flujo electroosmótico que
desplazara a los aniones también al cátodo.

El orden al que van saliendo nuestros compuestos será marcado de la siguiente

manera:

Los dos compuestos que tenemos son aniones por lo que tenderán a ir hacia el
ánodo pero serán desplazados por el flujo electroosmótico. Por un lado afectará a la
movilidad el tamaño del anión. El ácido p-hidroxibenzoico presenta mayor tamaño que
el ácido benzoico por lo que su movilidad sería menor y sería más fuertemente
arrastrado por el flujo electroosmótico, pero no es así. Esto es debido a que el ácido
p-hidroxibenzoico tiene dos cargas negativas, una en el grupo ácido y otra en el grupo
alcohol mientras que el ácido benzoico solo tendría la carga del grupo acido. Al tener

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dos cargas la movilidad de este se multiplicaría prácticamente por dos, y se opondría
más al flujo electroosmótico, llegaría después. La diferencia de tamaño seria
despreciable frente a la diferencia de cargas.

Se concluye que el ácido p-hidroxibenzoico por tener dos cargas negativas tiene mayor
movilidad, entonces saldría después que el ácido benzoico que solo tiene una carga.