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Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato

Produccin, purificacin e inmovilizacin de alfa-amilasa


obtenida a travs de Bacillus subtilis para su uso en la industria panificadora
Proyecto de Bioconversiones

4BM2 Integrantes: Jos Vctor Alvarado Ruz Mara Fernanda Gonzlez Medina Mara del Carmen Jurez Morales Laura Marcela Lpez Gonzlez Jessica Eugenia Rojas Garca
Fecha de entrega: 13/06/2012

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Fecha de entrega: 13/06/2012

ndice I. II. III. IV. IV.I Objetivo general.Pg.3 Objetivo especfico........Pg.3 Justificacin........Pg.3 Marco terico..Pg.4
Alfa-amilasa..........Pg.4

IV.II Produccin de alfa-amilasa.Pg.4 IV.III Purificacin de alfa-amilasa....Pg.5 IV.IV Inmovilizacin de alfa-amilasa.......Pg.5 V. V.I V.II Metodologa...Pg.6
Produccin.Pg.6 InmovilizacinPg.7

V.III PurificacinPg.7 VI Referencias.Pg.8

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Produccin, purificacin e inmovilizacin de alfa-amilasa obtenida a travs de Bacillus subtilis para su uso en la industria panificadora.

I.

Objetivo general.

Disear un procedimiento para la produccin, purificacin e inmovilizacin de la enzima alfa-amilasa, e implementarla en la industria panificadora, aplicando los conocimientos obtenidos en el laboratorio de Bio-conversiones.

II.
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Objetivo especfico.
Comparar diversos mtodos de produccin, purificacin e inmovilizacin de la enzima alfa-amilasa. Detectar el mejor modelo de produccin para la enzima alfa-amilasa Implementar el protocolo ms ptimo para la purificacin de la enzima alfa-amilasa. Encontrar el mtodo de inmovilizacin ms adecuado para la enzima alfa-amilasa.

III.

Justificacin.

Las enzimas son ampliamente utilizado en la industria y la alfa-amilasas resulta ser muy atractiva para los procesos industriales sobre todo en la panificadora ya que presenta actividad significativa en un rango alto de temperatura que van desde los 30 hasta 80 centgrados (Montes y Magaa. 2002). Sin embargo, algunos autores opinan que esta enzima, a pesar de su importancia y buenas propiedades antes mencionadas, no se usa en las proporciones ms idneas, por lo que se tienen que utilizar enzimas complementarias que ayuden a mejorar su actividad (Corts. 2004), destacando las propiedades del pan. Es por esto que hemos decidido crear una metodologa para optimizar la produccin, purificacin e inmovilizacin de la enzima alfa-amilasa con el fin de proporcionar a las industrias panificadoras una enzima de mayor calidad.

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IV.

Marco terico.

IV.I Alfa-amilasa En la actualidad, las enzimas de uso industrial desempean un papel sin precedentes en la economa, debido a su propiedad cataltica que facilita la produccin de grandes volmenes de producto. Dentro de las enzimas de este tipo se encuentra la amilasa, por su capacidad hidroltica que cataliza la degradacin del almidn, que es uno de los productos alimentarios ms explotados a nivel mundial. Esta familia de enzimas hidrolticas, est compuesta por amilasa, beta-amilasa, glucoamilasa e isoamilasa. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a un pH de 3.3 o a un pH todava menor, a 0C por 15 min. El pH ptimo de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6.5 para el alfa-amilasa bacteriana y pancretica. Por otro lado la enzima es resistente al calor, pues a 70C conserva un 70% de su actividad. Las alfa amilasas obtenidas de B.subtilis tienen un ion calcio fuertemente ligado por molcula, que es necesario para la actividad de la enzima y que lo estabiliza en gran medida frente al calentamiento. Se utiliza como enzima soluble en tratamientos de dos horas a 85 C y con un pH de 5.5-7 como una alternativa a la utilizacin de cido clorhdrico que produce excesivos compuestos coloreados y la formacin de productos de reversin. Debido a que los almidones de patata y de cereales cerosos no pueden tratarse por gelatinizacin, se les somete a un proceso en dos etapas, en el que se aade una segunda dosis de enzima y se contina el tratamiento hasta lograr el contenido deseado de glucosa. IV.II Produccin de alfa-amilasa Las cepas de Bacillus subtilis han sido utilizadas para la produccin del enzima alfaamilasa debida a su capacidad para producir amilasa y a su alto rendimiento (Prabakaran y Pugalvenghan. 2009). La mayora de las veces la produccin de alfa-amilasa se realiza a partir de cultivos con agitacin, estos se utilizan con mayor frecuencia debido a la facilidad de manejo y control de los factores ambientales como son la temperatura y el pH (Bozic. 2011). protenas catalticas: alfa-

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La produccin de alfa-amilasa depende de varios factores como son las cepas, la composicin de los medios, los mtodos de cultivo, los tipos de nutrientes, el pH, la temperatura, el tiempo de incubacin, entre muchos otros factores (Akcan. 2011). Es muy importante tomar en cuenta los factores antes mencionados para la produccin de alfaamilasa, ya que de estos depende la cantidad de enzima que obtengamos, as como su rendimiento y la actividad enzimtica de la misma. IV.III Purificacin de alfa-amilasa. La purificacin de la alfa-amilasa obtenida a partir de Bacillus subtilis reportada en el artculo Partial purification and some properties of alpha-amylase from Bacillus subtilis KIBGE-HAS (Bano S. 2004), se realiz parcialmente por ultrafiltracin y precipitacin con sulfato de amonio, la actividad especfica obtenida fue de 4195 U/mg. La enzima mostr termo estabilidad relativamente alta y retuvo 62% de su actividad a una temperatura de 70 C durante 15 min. La alfa-amilasa fue altamente estable a -18 C. Segn el artculo Purificacin y caracterizacin de una -amilasa producida por la cepa nativa Bacillus subtilis (Quintero 2010), la purificacin se realiz con la adicin de sulfato de amonio mostrando un alto grado de pureza de 10% (SDS-PAGE).

IV.IV. Inmovilizacin de alfa-amilasa Para la inmovilizacin de alfa-amilasa producida por Bacillus subtilis el pH ptimo resulta estar en un rango cido y la temperatura de reaccin ms adecuada se encuentra entre los 70 y 80 C. Tambin cabe mencionar que los valores de Km y Vmax as como la estabilidad trmica tienden a ser mayores en la enzima inmovilizada. (Tarek E. 2007). Segn el artculo Production and immobilization of alfa-amylase from Bacillus subtilis (Tarek E. 2007), el mtodo que ejerci un mayor efecto estimulante para la inmovilizacin de alfa-amilasa fue el atrapamiento en alginato de sodio. Este mtodo consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa. Por tal motivo es de suma importancia la creacin de una metodologa que pueda optimizar y en tanto hacerla ms fcil, como lo es su produccin, purificacin e inmovilizacin; todo esto con el fin de que est al alcance de cientficos o investigadores, ya sea para aplicarlo en la industria, laboratorios de investigacin o cualquier otra rea de inters donde sirva como una herramienta benfica.

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V.

Metodologa.
En base a la literatura revisada y la bibliografa citada anteriormente se procedi a proponer la mejor metodologa para produccin, purificacin e inmovilizacin de la enzima alfa-amilasa producida por Bacillus subtilis, con el fin de cumplir los objetivos propuestos.

Tabla 1. Material y reactivos a utilizar.

Reactivos Extracto de carne 3 g/L Peptona 10 g/L Cloruro de sodio 5 g/L Almidn 10 g/L Agua destilada Sulfato de amonio Citrato Alginato de sodio Cloruro de calcio

Materiales Matraz Erlenmeyer Pipeta Pasteur Centrfuga Columna Biogel Potencimetro

V.I Produccin. 1. Preparar 250 mL de caldo de cultivo en un matraz Erlenmeyer para el crecimiento de Bacillus subtilis, la composicin del caldo es la siguiente: 3 g/L de extracto de carne, 10 g/L de peptona, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de almidn, 1000 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7.5. 2. Inocular 1 mL de la espora suspendida para cultivarla en agar nutritivo. 3. Incubar a una temperatura de 40C, con una agitacin constante de 150 rev/min durante 48 horas. Comentario: Cabe mencionar que para la propuesta de la metodologa se modifico fue el pH y la temperatura, puesto que estos son factores que afectan a la produccin de la alfa-amilasa, adems se encontr que hay

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mayor produccin de alfa-amilasa a un pH de 7.5 con una temperatura de 40C, que a un pH 7 con una temperatura de 37C.

V.II Purificacin. 1. La enzima se precipita a partir del extracto enzimtico mediante adicin de sulfato de amonio hasta una saturacin del 40%, incubacin en hielo por 20 minutos y colectada por centrifugacin (20 minutos a 7000g, 4 C). 2. El sobrenadante se re-suspende en un volumen mnimo de tampn citrato (50 mM, pH 6.0) y se pasa a travs de una columna Biogel P100 pre-equilibrada con la solucin de citrato. 3. Se toman fracciones de 1 ml y se seleccionan aquellas con actividad amiloltica. 4. El grado de pureza se evala mediante la relacin actividad/ [protena total] y electroforesis en poliacrilamida 10% (SDS-PAGE) (LEAMMLI, U.K. 1970). 5. La concentracin de protena se estima finalmente mediante el mtodo de Bradford (BRADFORD, M.M. 1976).

V.III Inmovilizacin. 1. Mezclar volmenes iguales de solucin de enzima y solucin de alginato de sodio, hasta obtener una concentracin final de alginato de sodio al 4% (p/v). 2. La mezcla obtenida se expulsa gota a gota por medio de una pipeta Pasteur (1mm de dimetro) a una solucin 2% (p/v) de cloruro de calcio la cual se agita durante dos horas hasta que las perlas alcanzan un tamao de 3mm de dimetro. 3. Las perlas que contienen ya la enzima se lavan con agua destilada y ya pueden ser utilizadas.

Comentario: Cabe mencionar que para la realizacin de las perlas de alginato se utilizara una pipeta Pasteur, ya que con esta obtenemos perlas del mismo tamao y mas uniformes, en cambio si se realiza con una jeringa esta resulta muy problemtica al momento querer expulsar el

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alginato de sodio, generndonos perlas ovaladas en vez de circulares y perlas de diferente tamao.

VI.

Referencias.
immobilization of -amylase from Bacillus subtilis". Pakistan Journal of Biological Sciences 10 (12): 2039-2047.

o Tarek E., Ahmed A., Abd-Aziz, Mohamed I., Reham I. (2007) "Production and

o Corts Gavilanes Ana Lucia. (2004). Aplicacin de Enzimas en la Produccin Industrial. o Akcan Nurullah, Uyar Fikret, Gven Asel. (2011). Alpha-Amylase Production by Bacillus subtilis in Submerged Cultivation. o Bozic Natasa, Ruiz Jordi, Lpez Josep y Vujcic Zoran. (2011). Optimization of the growth and -amylase production of Bacillus subtilis in shake flask and laboratory fermenter batch cultures. o Montes Ma. Del Carmen y Magaa Plaza Ignacio. (2002). Enzimas con aplicacin industrial. o Prabakaran G. y Pugalvendhan R. (2009). Production and immobilization of alpha amylase by using Bacillus subtilis. Recent Research in Science and Technology. 1 (4): 189-194.
o

Quintero

Moreno

Mnica,

Montoya

Olga

Ins,

A.

Gutirrez

Pablo.

(2010).Purificacin y caracterizacin de una -amilasa producida por la cepa nativa Bacillus subtilis.

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