Tema 4.

Aminocidos y pptidos

Bioqumica

TEMA 4

AMINOCIDOS Y PPTIDOS
1. Estructura y clasificacin de los aminocidos. 2. Propiedades cido-base de los aminocidos y pptidos 3. El enlace peptdico 4. Pptidos: hidrlisis y secuenciacin

1. Estructura y clasificacin de los aminocidos. Como su nombre indica los aminocidos son compuestos que poseen un grupo amino (-NH2) y un grupo cido (carboxlico -COOH) en su estructura. Los aminocidos son los precursores de los pptidos y las protenas, y en ellos el grupo amino y el grupo carboxilo, se encuentran unidos al mismo tomo de carbono, conocido como carbono- (-aminocidos). La estructura general de los aminocidos (a excepcin de la prolina, que es cclica) se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Estructura qumica de un aminocido. Estructura qumica en el plano y estructura espacial. Enantimeros del aminocido alanina.

Como se puede apreciar, el carbono- (a excepcin de la glicina) es un carbono quiral y como tal presenta dos enantimeros (L- y D-). Los 20 -aminocidos

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presentes en las protenas son de la serie L- y en su representacin de Fischer poseen el grupo amino hacia la izquierda. La diferencia entre los aminocidos viene dada por el resto -R, o cadena lateral, unida al carbono-. Atendiendo a la naturaleza del grupo -R los aas pueden clasificarse en: Neutros o apolares Polares sin carga Polares con carga negativa Polares con carga positiva

La Figura 2 recoge las estructuras de los 20 L--aminocidos a pH fisiolgico. Neutros o Apolares. Son 8 los aminocidos que se clasifican como poseedores de cadenas laterales no polares. La alanina, valina, leucina e isoleucina, poseen cadenas laterales de hidrocarburos alifticos. La metionina posee una cadena lateral de ter tilico (C-S-C). La prolina es el nico aminocido cclico, pues el grupo -R se cierra sobre el N del grupo -amino (realmente es un amina secundaria). Por su parte, la fenilalanina y el triptfano contienen grupos aromticos. Polares sin carga. Siete son los -aminocidos cuyo resto -R es polar pero sin carga. La glicina posee la cadena ms simple, un tomo de hidrgeno. La serina y la treonina son portadores de un grupo hidroxilo (-OH). La asparragina y la glutamina, poseen cadenas laterales portadoras de un grupo amida, y por hidrlisis dan lugar, respectivamente, a aspartato y glutamato, dos aminocidos con carga negativa. La tirosina posee un grupo fenlico y la cistena debe su polaridad a la presencia de un grupo tilico (-SH). Polares con carga negativa. Existen dos -aminocidos cuyo resto polar posee carga negativa a pH fisiolgico, debida a la presencia de un grupo carboxilo (COOH) , el cido glutmico y el cido asprtico. Polares con carga positiva. Tres son los -aminocidos que poseen restos -R cargados positivamente a pH fisiolgico. La lisina posee una cadena lateral de butilamonio, la arginina presenta un grupo -R de guanidina y la histidina es portadora de un grupo -R de imidazolio.

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APOLARES

Glicina (gly)

Alanina (ala)

Valina (val)

Prolina (pro) Leucina (leu) Metionina (met) Isoleucina (ile) Fenilalanina (phe) Triptfano (trp)

Serina (ser)

Treonina (thr) ( )

Cistena (cys)

Figura 2. Estructura qumica de los L-aminocidos.

asparragina (asn) glutamina (gln)

Asprtato (asp) ( )

Glutamato (glu) ( )

lisina (lys)

arginina (arg)

Histidina (his)

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Esta clasificacin se ha realizado en base al grupo -R, pero es importante indicar que a pH fisiolgico (pH 7,3), el grupo -amino se encuentra cargado positivamente y el grupo -carboxilo lo est negativamente, por esta razn en la Figura 2 estos grupos aparecen siempre cargados. Dentro del conjunto de los aminocidos naturales, existen unos que pueden ser sintetizados por las clulas humanas a partir de otras sustancias, pero tambin hay aminocidos que debemos tomarlos en la dieta, ya que nuestras clulas no pueden sintetizarlos o, cuando menos, no en cantidad suficiente para satisfacer la demanda del organismo; se conocen con el nombre de aminocidos esenciales y son valina, leucina, isoleucina, treonina, metionina, fenilalanina, triptfano y lisina.

cido Asprtico (Asp) D cido Glutmico (Glu)E Alanina (Ala) A Arginina (Arg) R Asparagina (Asn) N

Cisterna Cys) C Fenilalanina (Phe) F Glicina (Gly) G Glutamina (Glu) Q Histidina (His) H

Isoleucina (IIe) I Leucina (Leu) L Lisina (Lys) K Metionina (Met) M Prolina (Pro) P

Serina (Ser) S Tirosina (Tyr) Y Treonina (Thr) T Triptfano (Trp) W Valina (Val) V

2. Propiedades cido-base de los aminocidos y los pptidos El pH del medio en el que se encuentre el aminocido es esencial para determinar sus propiedades cido-base, aspecto importante pues de ello dependen las propiedades qumicas y la funcionalidad biolgica de los pptidos y protenas que forman. Las propiedades cido-base de un aminocido vienen determinadas por los grupos protonables que posea. Un aminocido puede actuar bien como cido o como base (sustancias anfteras), pudiendo tener hasta tres grupos con carcter cido-base: el -amino, el -carboxilo y, en algunos casos, el resto -R. Lo importante es que estos grupos poseen un carcter cido-base dbil, lo que hace que, dependiendo del pH, el correspondiente equilibrio pueda desplazarse en un sentido o en otro (hacia la forma protonada o hacia la desprotonada, Figura 3).

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Figura 3 Ionizacin de un formas protonada y desprotonada es: La expresin que regula la proporcin entre lasL-aminocido.

pH = pK a + log

DP P

Donde DP es la forma protonada y P es la forma desprotonada. Veamos como afecta el pH a la valina. La val posee slo dos grupos protonables, el -amino y el carboxilo. A pH fisiolgico la valina presentara la siguiente estructura:

NH3

COO CH CH CH3

CH3

Tomemos los grupos por separado y veamos como les afecta el pH. El grupo amino presentara dos formas, una protonada (P) y cargada positivamente (-NH3+), y otra desprotonada (DP) y sin carga (-NH2), segn el siguiente equilibrio:

NH 3+ NH 2 + H +

donde el pK a (= log K a ) 8

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si el pH aumenta, el equilibrio se desplaza hacia la derecha (dominando la forma con carga 0) y si disminuye lo har hacia la izquierda (dominando la forma con carga +1). Con el grupo -carboxilo ocurrira algo similar:

COOH COO + H +

donde el pK a (= log K a ) 2

En funcin del pH, la proporcin de forma protonada (carga 0) o forma desprotonada (carga -1) variar, respetando siempre la constante de ionizacin del grupo en cuestin si la temperatura se mantiene constante. Supongamos que estamos ahora a pH 1; en estas condiciones de elevada concentracin de protones en el medio ambos equilibrios estaran desplazados en un 100 % hacia las formas protonadas. Si aumentamos el pH los equilibrios comenzaran a desplazarse hacia la derecha hasta llegar a un pH muy bsico, momento en el que las formas dominantes (al 100 %) seran las desprotonadas. Pero, qu ocurre a pHs intermedios?. Para ello debemos tener en cuenta la Ka de cada equilibrio, o mejor dicho su pKa (que sera el -logKa). El grupo -amino de la valina tiene un pK de 8, y esto quiere decir que a pH 8 el 50 % de los grupos amino estarn protonados (si tenemos 100 molculas de valina, 50 tendrn el grupo amino protonado y 50 lo tendrn desprotonado, al menos tericamente, segn se desprende de la constante de ionizacin). Por su parte el grupo -carboxilo de la valina, (pK = 2), estar protonado al 50 % cuando el pH del medio sea 2. En general se asumen las siguientes consideraciones, para determinar el porcentaje de protonacin de un grupo ionizable en un aminocido: Si el pH < pK-1 el grupo esta al 100 % protonado Si el pH > pK+1 el grupo est al 100 % desprotonado Si el pH = pK el grupo est al 50 % protonado Tomemos ahora un aminocido con tres grupos ionizables, el cido glutmico:
(-amino) NH3
+

CH

COO - (-carboxilo)

CH2 CH2
COO (-carboxilo)

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que posee el grupo -amino, el -carboxilo y el -carboxilo. Los tres grupos ionizables darn lugar a tres equilibrios cido-base distintos, cada uno con su correspondiente pKa (2, 4 y 8 respectivamente). Para ver como afecta el pH a la carga de cada grupo vamos a realizar la siguiente tabla, en la que ordenamos (de menor a mayor pK) los grupos protonables y sus correspondientes valores de carga en funcin del pH: GRUPO 1 0 2 -0,5 3 -1 4 -1 5 -1 6 -1 7 -1 8 -1 9 -1 10 -1

-carboxilo (pK=2) -carboxilo (pK=4) -amino (pK=8)

carga total

-0,5

-1

-1

-1

-1

-1

-1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

+1

0,5

+1

0,5

-0,5

-1

-1

-1

-1,5

-2

-2

1) a pH= 1, el pH es inferior en una unidad al pK del grupo -COOH, el cul estar protonado al 100 %, luego su carga ser 0; y lo mismo le ocurrir al grupo -COOH, protonado al 100 % y con carga 0. Por su parte, el grupo amino tambin estar protonado, aunque en este caso la carga del grupo es +1. 2) a pH= 2, se produce coincidencia del pH con el pK del -COOH, por lo que estar al 50 % protonado. Luego la carga ser -0,5 ; este pH es an dos unidades inferior al pK del grupo -COOH, que seguir protonado (0), como tambin le ocurrira al grupo -amino (+1). La carga total del glutmico sera 0,5. 3) a pH= 3, se ha superado en una unidad el pKa del -COOH, luego estar desprotonado al 100 % y su carga ser -1 para valores superiores de pH. Los otros dos grupos siguen estando protonados al 100 % (0 y +1, respectivamente). Y la carga total ser cero. 4) a pH= 4, el pH coincide con el pKa del grupo -COOH y estar protonado en un 50% (carga -0,5). El -COOH seguir desprotonado (0) y el -amino protonado (+1). La carga total ser ahora -0,5.

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5) a pH=5 el grupo -COOH estar al 100 % desprotonado y el resto de grupos seguir igual, hasta llegar a pH= 8, donde el -amino estar desprotonado al 50 % (0,5) , grupo que se desprotonar al 100 % a partir de un pH= 9. Como se puede apreciar en la tabla, la carga total del aminocido depende del pH de la disolucin en que se encuentre. Existe un pH al cual la carga neta del aminocido es cero (si lo colocamos en un campo elctrico no se desplazar hacia ninguno de los polos). El pH al cul un aminocido posee carga neta cero recibe el nombre de punto isoelctrico (pI), que es la media aritmtica de los valores de pK1 y pK2 que delimitan la forma con carga cero. En la siguiente tabla pueden localizarse los aminocidos que, al igual que el cido glutmico, poseen grupos R protonables.

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3. El enlace peptdico Los aminocidos se encuentran unidos en los pptidos y las protenas mediante un enlace amida (-CO-NH-):

Este enlace se forma por reaccin entre el grupo -COOH de un aminocido y el amino del siguiente (con prdida de una molcula de agua) y recibe el nombre de enlace peptdico.

Figura 4. Estructura espacial del enlace peptdico. (a) Ilustracin del carcter parcialmente doble del enlace peptdico. (b) Configuracin del plano que conforman el enlace peptdico y los carbonos extremos.

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Entre los aos 1930-1940, Pauling y Corey, mediante el estudio de Rayos X de cristales de aminocidos, dipptidos y triptidos, dilucidaron la estructura tridimensional del enlace peptdico (Figura 4). As, descubrieron que la unin C-N del enlace peptdico era ms corta que en la mayor parte de los dems enlaces C-N y llegaron a la conclusin de que el enlace deba tener algn carcter de doble enlace, por la aparicin de dos formas resonantes: Luego dedujeron que los 4 tomos que rodeaban al enlace peptdico C-N (O, C, C, H) estaban situados en el mismo plano, de tal manera que el oxgeno del grupo carbonilo y el hidrgeno del N-H estaran en posicin trans. Esta ordenacin es rgida, y es el resultado de la estabilizacin por resonancia de las formas anteriormente citadas.

Partiendo de estos dos hechos, puede describirse el armazn de una cadena polipeptdica como constituido por una serie de planos, con posibilidad de giro en los C. De esta forma podemos escribir la estructura de un pptido como una sucesin de planos en la que los grupos -R se van alternando (Figura 5).
Figura 5. Estructura espacial de un pptido. Secuencia ordenada de los planos de enlace peptdico en el espacio. Los grupos R se alternan por encima y debajo del plano general de la molcula.

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4. Secuenciacin de un pptido La posicin que ocupa cada aminocido dentro de la cadena polipeptdica, esto es la secuencia, constituye el primer nivel estructural de las protenas, su estructura primaria. La secuencia de un pptido tiene gran importancia porque entre otras cosas condiciona los siguientes niveles estructurales. La insulina bovina fue la primera protena que se secuenci completamente por Sanger en 1953, lo que le vali el premio Nobel. La determinacin de la secuencia de la insulina fue el resultado del trabajo de muchos cientficos durante 10 aos, desde entonces se han secuenciado miles de protenas. La secuencia de una protena, si conocemos el gen del que proviene, puede obtenerse indirectamente, secuenciando dicho gen. Pero tambin puede hacerse la secuenciacin qumica directa. Los pasos a seguir son:

Determinacin de la composicin del pptido por hidrlisis total y posterior anlisis cromatogrfico. Determinacin de los extremos C-terminal y N-terminal Fragmentacin por hidrlisis selectiva Secuenciacin: Degradacin de Edman

La determinacin de la composicin del pptido se realiza por hidrlisis total presencia de HCl 6N, calentando a 100 C durante 10-24h, y en tubo al que se le ha hecho el vaco. Tras el proceso se utiliza un sistema cromatogrfico que permita separar y determinar cuntos y cules son los aminocidos que forman la cadena. Hay distintos mtodos que permiten determinar el primer aminocido (Resto Nterminal) o el ltimo (Resto C- terminal) de una cadena polipeptdica.

La determinacin del resto N-terminal, se puede realizar, entre otros mtodos, mediante la Degradacin de Edman: en este proceso el pptido reacciona con fenil isotiocianato que se une selectivamente al primer aminocido. A continuacin se escinde con HF anhidro el aminocido marcado, separndolo del resto selectivamente con un disolvente orgnico. Tras un tratamiento en medio cido el compuesto resultante se determina cromatogrficamente (Figura 6).

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Figura 6. Determinacin de la secuencia de un pptido. Hidrlisis total de la protena. (a). Determinacin del primer aminocido utilizando 2,4-dinitrofluorobenceno (b) o fenilisotiocianato (c). Este ltimo mtodo tambin se conoce como degradacin de Edman y permite la secuenciacin del pptido.

Por otro lado, la determinacin del resto C-terminal, se puede realizar con Hidracina: este compuesto reacciona con todos los enlaces peptdicos del pptido, provocando la hidrlisis de los mismos y dando lugar a aminoacil-hidracinas con todos los aminocidos excepto con el ltimo (C-terminal), pudiendo separarse del resto fcilmente y determinarse con posterioridad su naturaleza.

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La fragmentacin por hidrlisis parcial es necesaria porque por lo general no pueden secuenciarse pptidos con ms de 20 o 30 aminocidos. Se realiza con reactivos selectivos, en la mayora de los casos se utilizan proteasas, enzimas que hidrolizan determinados enlaces peptdicos.

La tripsina hidroliza por la derecha de Arg , Lys La quimotripsina hidroliza por la derecha de Phe, Trp, Tyr La pepsina hidroliza por la izquierda de Phe, Trp, Tyr La termolisina hidroliza por la izquierda de Val, Leu, Ile El bromuro de ciangeno (BrCN) hidroliza por la derecha de la Met

La secuenciacin. Entre los distintos mtodos existentes, podemos citar la degradacin de Edman, cuyo fundamento hemos visto en la determinacin del extremo N-terminal. La aplicacin continuada de varios ciclos de la degradacin de Edman me permite la secuenciacin de todo el pptido, siempre que este no tenga ms de 20 o 30 aminocidos. No obstante los actales requerimientos de secuenciacin de gran cantidad de pptidos en poco tiempo, han dado origen al desarrollo de nuevos mtodos de secuenciacin, desarrollados principalmente para afrontar proyectos como el del proteoma humano. Entre estos mtodos podemos citar el MALDI MS y el ESI MS, ambos basados en la espectrometra de masas. La espectrometra de masas permite calcular la masa del compuesto analizado con gran precisin. Esta tcnica se basa en que la desviacin que sufre una partcula cargada al atravesar un campo magntico depende bsicamente de su carga y masa. Si ionizamos las molculas, la mayora con carga +1, y las sometemos a un barrido de campo magntico obtenemos un espectro de masas. Esta tcnica se utilizaba con molculas en fase gaseosa lo que impeda su aplicacin a molculas sensibles a la descomposicin por calor o por los tratamientos tradicionales utilizados para pasar la muestra a fase gaseosa. En 1988 se desarrollaron dos tcnicas que permiten evitar este problema. La espectrometra de masas da mucha informacin sobre la masa molecular, la presencia de cofactores, etc. Y adems puede utilizarse para secuenciar pequeas cadenas de polipptidos, mediante una tcnica conocida como tanden MS, que bsicamente consiste en dos epectrometros de masas en serie. La protena bajo

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estudio se trata con proteasas para obtener una mezcla de pequeos pptidos. En el primer espectrmetro la mezcla de pptidos se trata de forma que solo uno de los pptidos es seleccionado para su posterior anlisis. El pptido seleccionado se fragmenta en la cmara de colisin que se encuentra entre los dos espectrmetros donde una pequea cantidad de gas noble (He o Ar) produce la fragmetacin del pptido preferentemente por los enlaces peptdicos, como la cmara est al vaco y no hay agua los productos son radicales. Los fragmentos son medidos en el segundo espectrmetro. En un especto tpico los picos mayoritarios corresponden a radicales que difieren en la masa de un aminocido particular. As puede deducirse la secuencia. La nica ambigedad tiene lugar entre la leucina y la isoleucina que tienen la misma masa molecular. Este mtodo es rpido, requiere slo minsculas cantidades de muestra que pueden ser extradas de una electroforesis bidimensional. Las grandes compaas como Celera (particip en el proyecto genoma humano) disponen de sistemas automatizados en que una gran cantidad de protenas se separan por electroforesis bidimensional o HPLC, cada punto puede ser luego secuenciado por un espectrmetro en tandem. Este mtodo podra usarse tambin para la secuenciacin de DNA, pero los mtodos tradicionales son tan rpidos que no es rentable. La figura muestra un tpico espectro realizado por espectrometra en tandem de un pequeo pptido de 10 amincidos. La secuencia deducida de este pptido fue; PhePro-Gly-Gln-(Ile/Leu)-Asn-Ala-Asp-(Ile/Leu)-Arg.

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