Manual Inmunología Aplicada

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE INMUNOLOGIA APLICADA
Profesores de Laboratorio Dra. Mara del Carmen Oliver Salvador M. en C. Paola B. Zrate Segura Dr. Luis Gilberto Torres Bustillos M. en C. Rodrigo Balam Muoz Soto IBT Hctor Molina Jimnez IBT Hernn Corts Arroyo
OCTUBRE 2008

NDICE GENERAL
PRCTICA 1. TIPIFICACIN DE GRUPOS SANGUNEOS PRCTICA 2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIN PRCTICA 3. REACCIONES DE PRECIPITACIN
4 8 14
PRCTICA 4. DETERMINACIN DE PROTENA POR EL MTODO DE BRADFORD 18 PRCTICA 5. DETERMINACIN DE REACCIN Ag-Ac POR ELECTROTRANSFERENCIA 20

REGLAMENTO DEL LABORATORIO
El laboratorio representar el 30% de la calificacin final de la materia de Inmunologa Aplicada. La calificacin de laboratorio se distribuir de la siguiente manera: 1. TRABAJO PRCTICO 40% - Asistencia al laboratorio. - Puntualidad. Se dar un mximo de tolerancia de 10 minutos. - Manutencin de los conejos. Se evaluar la limpieza del bioterio as como el cumplimiento y la responsabilidad de los conejos diariamente. - Cada alumno deber presentarse a la sesin de laboratorio con bata y con el manual de prcticas engargolado en el cual debern anotar todos los resultados obtenidos en las prcticas. No se permitir el acceso al laboratorio si no se cumple este requisito. - El material se entregar una vez llenado de manera correcta el vale correspondiente. - El comportamiento del alumno dentro del laboratorio estar regido por el reglamento general del laboratorio de biotecnologa. 2. INFORME POR EQUIPO 40% Este porcentaje se divide en: - Introduccin 10% - Objetivo - Resultados 15% - Discusin de resultados 20% - Cuestionario 20% - Conclusiones 30% - Referencias 5% (diferentes a las mencionadas en la prctica) 3. EXAMEN DE LABORATORIO Consistir en una evaluacin del conocimiento adquirido durante las prcticas

PRCTICA 1 TIPIFICACIN DE GRUPOS SANGUNEOS 1. INTRODUCCIN SISTEMA ABO Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antignicas determinadas genticamente, las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos especficos. El primer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, y le llam sistema ABO, el cual consiste en que un individuo tiene en sus glbulos rojos uno, dos o ninguno de los dos antgenos (A y/o B) pertenecientes a este sistema. As, los individuos pueden ser del tipo A, si solamente poseen el antgeno A; del tipo B, si nicamente tienen el antgeno B; del tipo AB si poseen ambas, o del tipo 0 si no tienen ninguno de los dos. La naturaleza qumica de los determinantes antignicos es polisacardica. Aproximadamente el 85% de la poblacin posee sustancias con caractersticas antignicas y estructurales similares a las presentes sobre las membranas de los eritrocitos en prcticamente todas las secreciones corporales. A estos individuos se les llama secretores. Los carbohidratos que forman estructura antignica A y B en la membrana de los glbulos rojos, tambin estn presentes en otros materiales biolgicos como bacterias, alimentos y otros agentes ampliamente distribuidos que constituyen un persistente estmulo. Los humanos reaccionan a este estmulo produciendo anticuerpos contra aquellos antgenos que no forman parte de su propia estructura celular. Por esta razn, el anticuerpo anti-A se produce en personas del grupo AB, que contienen ambos antgenos, no forman dichos anticuerpos. A estos anticuerpos se les llama isohemaglutininas.
Sistema Rh En 1939. Levine y Stetson reportaron el caso de una mujer con severa reaccin hemoltica despus de la transfusin sangunea proveniente de su esposo. El antgeno responsable fue diferente de los ya conocidos en la poca. En 1940, Landsteiner y Winier inmunizaron conejos y cobayos con eritrocitos de monos Macacus rhesus, basandose en la suposicin de que en los eritrocitos de estos monos podran existir antgenos similares a los de los humanos. El suero obtenido aglutinaba los glbulos rojos de los monos rhesus y del 85% de la poblacin humana blanca. Hasta ese momento todo sugera que el supuesto antgeno hallado por Landsteiner y Wiener en monos, y el supuesto antgeno descrito por Levine y Stetson en humanos, era el mismo. Posteriores investigaciones demostraron que los supuestos antgenos eran diferentes; se determin que la mayora de los humanos tienen el antgeno del mono rhesus y adems otro diferente, pero relacionado. A sugerencia de Levine, se conserv la demostracin del factor Rh para el antgeno humano, y se le asign el nombre de LW al antgeno comn al hoimbre y al mono. A mediados de la dcada de los 40, se haban identificado cinco antgenos como pertenecientes al actualmente denominado Rh. Estos cinco antgenos (C, c, D, E, e) se combinan entre s, dando lugar a diversos patronesantignicos. El D tiene dominancia antignica. Los individuos que presentan el antgeno D en sus eritrocitos se denominan Rh(+), y aquellos que no tienen el antgeno D se denominan Rh(-).

Adems de los sistemas AB0 y Rh pueden ser detectados otros sistemas antignicos de la membrana de los eritrocitos (Lewis, Duffy, MN, Ss. Li, etc). Estos sistemas se consideran secundarios. El conocimiento de los antgenos sanguneos ABO y Rh. Como antgenos celulares importantes en transfusiones sanguneas, en medicina legal y en la isoinmunizacin materno-fetal. Los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM. Por lo que son altamente aglutinantes y fijadores de complemento. Por este motivo, la determinacin de este sistema es de gran relevancia en transfusiones sanguneas. 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GENERAL Determinar el sistema ABO y Rh de diferentes muestras. 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 2.2.1 Realizar la extraccin sangunea por jeringa 2.2.2 Realizar la tipificacin sangunea del sistema ABO 3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Material por grupo Centrfuga clnica Bao mara a 37C 3.2 Material por equipo 1 Frasco de torundas de alcohol 2 portaobjetos 3 pipetas Pasteur Jeringa desechable de 5 mL con aguja de 21x32mm 2 tubos de ensaye de 13x 100mL 1 pipeta serolgica de 5 mL 1 pipeta serolgica de 1 mL 5 palillos de madera Sueros tipificadotes anti-A, anti-B, anti-AB Solucin de albumina bovina al 25% Eritrocitos humanos tipo A, B y 0, en suspensin al 5% 2 tubos de ensaye 10 x 75mm Tubo con tapn de rosca Suero tipificador anti-D comercial Solucin salina al 0.85% Suero de Coombs 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1. Tipificacin Sangunea 1. Obtener aproximadamente 5 mL de sangre venosa y colocarla en un tubo sin anticoagulante, permitir que se retraiga el cogulo incubando a 37C 10 min y centrifugar para separar el suero del paquete celular.

2. Rotular una placa o portaobjetos de la siguiente manera: anti-A, anti-B, anti-AB y testigo. Rotular otra placa diferente con: A, B y 0. 3. Del mismo tubo donde se dej coagular la sangre, con una pipeta pasteur tomar eritrocitos del fondo (de los no atrapados en el cogulo). Colocar una gota de esta suspensin en el portaobjetos que tiene las marcas anti A, anti-B, anti-AB y testigo. 4. Cerca de cada gota, adicionar una gota de suero comercial anti-A, anti-B y antiAB, segn corresponda y en el lugar marcado como testigo, colocar una gota de la solucin de albmina al 25%. Mezclar primero suavemente con un palillo y despus con movimientos rotatorios. 5. Buscar la presencia de aglutinacin antes de 25 seg. Por ejemplo, si se observa el siguiente resultado:
Aglutinacin Anti-A Anti-B + Anti-AB + Testigo -
Esto indicara que los eritrocitos probados corresponden al grupo sanguneo B. 6. Para buscar las isohemaglutininas, en la otra placa marcada como A, B y 0, colocar una gota del individuo frente a las marcas y agregar cerca una gota de eritrocitos previamente tipificados de tipo sanguneo A, B y 0, segn corresponda. 7. Mezclar suavemente, primero con ayuda de un palillo y despus con movimientos rotatorios. 8. Buscar la presencia de aglutinacin. Resultados. De acuerdo al ejemplo anterior, los resultados esperados para confirmar el grupo sanguneo seran:
Aglutinacin A + B 0 -
Por lo que el individuo correspondera al tipo B. En el sistema ABO el grupo sanguneo esta dado por la siguiente tabla.
Reaccin de los eritrocitos con antisueros comerciales Anti-A Anti-B Anti-AB + + + + + + + Reaccin con el suero con antgenos conocidos A B O + + + + Grupo sanguneo A B AB O
En caso de que se presente aglutinacin en el testigo, se debe a que existen autoanticuerpos antieritrocitos y esto DEBE de ser reportado inmediatamente. 4.2. Sistema Rh De este sistema por su mayor inmunogenicidad, slo se determina de forma rutinaria el antgeno D en caso de requerirse una transfusin sangunea. Por la naturalez proteica del antgeno, los anticuerpos inducidos son de clase IgG que pueden atravesar placenta y causar hemlisis intrauterina en caso de incompatibilidad materno-fetal.

1. Con una pipeta Pasteur colocar cuatro gotas de sangre en un tubo con tapn de rosca que contenga 2 mL de SS. 2. Marcar dos tubos: Rh y Testigo, colocar una gota de eritrocitos en cada uno. 3. Al tubo Rh adicionar una gota de suero anti-D y agitar suavemente. 4. Al testigo adicionar SS y agitar suavemente. 5. Centrifugar 1000 rpm 60seg 6. Buscar aglutinacin, en caso de que el tubo Rh presente es Rh(+) 7.Si no hay en ninguno incubar a 37C, 20 min y lavar 3 veces con SS centrifugando a 1500 rpm 2 min. Despus de la ltima centrifugacin remover el sobrenadante y adicionar al paquete celular dos gotas de suero de Coombs. 8. Resuspender suavemente y centrifugar ambos tubos a 1000 rpm 60 seg. Resultados. Presencia de aglutinacin. Rh con aglutinacin corresponde al grupo Du Rh(+), en caso negativo Rh(-). Testigo debe ser negativo, en caso opuesto es autoinmune. Para transfusin el sujeto clasificado como Du, se considera como donador Rh (+) y receptor Rh (-). 5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS. 1. Bird, G. W.G. and Cunningham, J. 1977. Agglutination and agglutinationinhibition. Techniques in Clinical Immunology. R.A. Ed. Thompson, Black Scientific Publications. Oxford. 2. Dodd, B.E. and Lincoln, P.J. 1975. Blood Group Topics. John Turk Editor. Year Book Medical Publishers, Inc.Chicago.

PRCTICA 2 ESQUEMAS DE INMUNIZACIN 1. INTRODUCCIN. La Inmunizacin es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo competente desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un inmungeno. El tipo y magnitud de la respuesta producida se deben a mltiples variables entre ellas se encuentra: la inmunogenicidad de un antgeno, que depende de su complejidad estructural, peso molecular, conformacin y naturaleza qumica, dosis, va de administracin etc. La sntesis de anticuerpos (Ac) es dirigida contra molculas especficas que el organismo no reconoce como propias (determinantes antignicos), para que esta sntesis ocurra, primero debe existir un contacto entre las clulas encargadas de la sntesis y el determinante antignico, contacto que es mediado por algunas clulas involucradas en la respuesta celular. Cuando un organismo se expone a un antgeno desconocido, el sistema inmune puede requerir mucho tiempo para producir cantidades apreciables de anticuerpos. Al final de la infeccin la concentracin alcanzada de anticuerpos declina. A tal respuesta se le llama primaria. Cuando el organismo se expone posteriormente al antgeno, la respuesta ocurre mucho ms rpido y la concentracin alcanzada, es apreciablemente mayor, en este caso se habla de respuesta secundaria. La aplicacin prctica de los antisueros es muy diversa, pues se puede utilizar con fines teraputicos (inmunizacin pasiva), en diversos estados infecciosos o txicos (neumona lobar, ttanos, etc.). Adems son tiles en la identificacin de microorganismos aislados de procesos infecciosos y en la clasificacin taxonmica de diversas especies. Tambin han servido como herramienta de trabajo para dilucidar mecanismos inmunolgicos bsicos (especificidad inmunolgica, activacin del complemento, fagocitosis, citotoxicidad, etc.) y en la determinacin rpida y especfica de la naturaleza de diversas sustancias qumicas (protenas, carbohidratos, haptenos, etc). ADYUVANTES INMUNOLGICOS Son sustancias inmunomoduladoras que constituyen una familia muy heterognea si se toman en consideracin su origen, naturaleza qumica y actividad biolgica especfica; Como los agentes inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen 2 funciones fundamentales: la estimulacin de la resistencia no especfica del husped contra las enfermedades infecciosas y el cncer; y, por otra parte, la potenciacin de la inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales de laboratorio durante la inmunizacin experimental con vistas a la produccin de antisueros. Los adyuvantes son sustancias o preparados que incorporados al antgeno o inyectados simultneamente con l, hacen ms efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se logra una economa de antgeno y de tiempo, as como un mayor nivel de anticuerpos especficos. El aumento de la inmunogenicidad puede estar mediado por uno o varios de los siguientes procesos: a) Incremento de la produccin de anticuerpos especficos frente a un antgeno vacunal.

b) Aumento de la afinidad de los anticuerpos inducidos con una potenciacin de su funcin neutralizante, germicida, opsonizante etc. c) Incremento de la magnitud y/o efectividad de la respuesta mediada por clulas T. d) Generacin de una respuesta humoral y/o celular de mayor duracin. e) Generacin de una respuesta incrementada de memoria inmunolgica. Algunos adyuvantes son en si antignicos (endotoxinas de bacterias gramnegativas, como Bordetella pertussis, o algunas bacterias grampositivas y el gnero de las micobacterias, etc.) mientras que otros no lo son (tartrato de alumnico de potasio o alumbre, fosfato de calcio, aceite mineral, lanolina, diversos agentes tensodepresores, polinucletidos y otros). El adyuvante incompleto de Freund es una mezcla de aceite mineral (Drakeol, Bayol o Nujol) con un detergente (Falba, Arlacel, Aquafor) en diferentes proporciones, por ejemplo, Arlacer-Drakeol (1:9); Arlacel-Bayol (3:17). El adyuvante completo de Freud (FCA) contiene adems del aceite y el detergente, una micobacteria (M. tuberculosis, M. bovis u otras) cuya cantidad es variable (de 1 a 5 mg de la bacteria, peso seco, por cada mL de la mezcla incompleta de Freund). Este ha sido utilizado durante ms de 50 aos en la produccin de antisueros en animales y es empleado con frecuencia cuando se dispone de cantidades limitadas de antgenos o cuando presentan una baja inmunogenicidad. La gravedad de su toxicidad fue reconocida inmediatamente, pero los esfuerzos por encontrar opciones igualmente efectivas y menos txicas no han resultado del todo exitosos. Con los avances alcanzados en numerosas reas de las ciencias biolgicas y el creciente inters por el bienestar de los animales de experimentacin, existe una considerable presin para restringir el uso del FCA, y aunque no se cuenta en la actualidad con alternativas definitivas para este adyuvante, en diferentes estudios comparativos se informan resultados estimulantes en cuanto a eficiencia, menor nmero de efectos adversos y mayor facilidad en la manipulacin. En los humanos no se recomienda el uso de este tipo de adyuvante Freund completo e incompleto ya que frecuentemente su aplicacin conduce al desarrollo de granulomas severos. VAS DE INMUNIZACIN. Se pueden emplear vas tales como la oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intracardiaca, intraperitoneal, intradrmica, subcutnea, etc. El estado fsico del antgeno (particulado o soluble) debe tenerse en cuenta para escoger la ruta de inmunizacin; es decir, los antgenos particulados por lo general son introducidos por va intravenosa, mientras que los antgenos en solucin pueden introducirse por otras vas como la intramuscular, la intraperitoneal, la subcutnea o la intradrmica. En estas dos ltimas vas preferentemente se utiliza al antgeno acompaado con adyuvante. La mayora de las veces slo se logra una respuesta adecuada llevando a cabo ms de un estmulo antignico, asegurando as que se obtendrn ttulos altos de anticuerpos o el nmero deseado de clulas especficas estimuladas. 2. OBJETIVOS. 2.1. OBJETIVO GENERAL. Desarrollar diferentes esquemas de inmunizacin en animales.

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2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS. 2.2.1. Desarrollar esquema de inmunizacin en conejos raza Nueva Zelanda 2.2.2. Desarrollar el esquema de inmunizacin para diversos antgenos 3. MATERIALES Y REACTIVOS. 3.1 Material por Grupo. Centrfuga clnica. Bao Mara a 37C. 3.2. Material por Equipo. Antgeno suficiente para inmunizar a conejos, de acuerdo al protocolo de inmunizacin. Un conejo que no rebase 5 Kg. de peso (de preferencia de color blanco, para facilitar la localizacin de la vena marginal de la oreja). Adyuvante incompleto de Freund. Jeringas de 1 mL con aguja de 25x16 (5/8) mm. Un lienzo para sujetar al conejo. Un frasco con torundas de algodn y alcohol al 70%. Frasco de solucin salina fisiolgica estril (0.85%). Mechero Bunsen. 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL. 4.1 TOMA DE MUESTRA SANGUNEA Para todos los antgenos el sangrado se hace antes y despus de la ltima inmunizacin, tratando de extraer la mayor cantidad de sangre posible. El sangrado previo es indispensable para contar con un suero testigo. Venosa. 1. Inmovilizar al animal. 2. Tomar la oreja. 3. Limpiar la zona de la vena lateral con alcohol al 70%. 4. Sujetar y colocar una torunda con agua tibia para ayudar a la exposicin del a vena. 5. Hacer un corte con una navaja de bistur estril de 2mm de longitudinalmente a la vena y colectar 2 mL por goteo en un tubo sin anticoagulante. 6. Una vez colectados los 2mL, colocar un vendolete en la oreja.
Antes de iniciar el esquema de inmunizacin correspondiente. Dejar coagular la muestra sangunea y separar el suero por centrifugacin. Este suero, ser el testigo, debe ser conservado en un tubo de ensayo, sellado y rotulado adecuadamente, en congelacin, hasta que se concluya con el esquema. 4.2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIN. A. mexicaina (Proteasa de origen vegetal, extrada, tratada y purificada)
Inyeccin Tiempo (Das) Dosis (mg) Va

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0.5
15
0.5
3 Sangrado
30 39
0.5 --
El antgeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85% emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto de Freund va intradrmica o subcutnea. Se sigue el mismo procedimiento de la primera inmunizacin pero usando el adyuvante incompleto de Freund, por va subcutnea o intradrmica. En SS 0.85%, por va subcutnea o intradrmica. Va intravenosa o intracardaca para la obtencin del antisuero.
SS = Solucin Salina
Nota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificacin por densitometra y por la concentracin final obtenida por la tcnica de Bradford.
A. Papana (Proteasa de origen vegetal, extrada, tratada y purificada)

Inyeccin 1 Tiempo (Das) 0 Dosis (mg) 0.5 Va El antgeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85% emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto de Freund va intradrmica o subcutnea. Se sigue el mismo procedimiento de la primera inmunizacin pero usando el adyuvante incompleto de Freund, por va subcutnea o entradrmica. En SS 0.85%, por va subcutnea o intradrmica. Va intravenosa o intracardaca para la obtencin del antisuero.
15
0.5
3 Sangrado
30 39
0.5 --
SS = Solucin Salina
B. Salmonella entrica transformada con plsmidos pL-STPN. Las cepas fueron sembradas en tioglicolato durante 10h para inducir la expresin de las protenas, la inoculacin se realizara en concentraciones de 1x 10 5 celulas/mL.

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Inyeccin 1
Tiempo (Das) 0
Dosis (mg) 0.5
Va El antgeno se disuelve en 0.5mL de SS al 0.85% emulsificando con 0.5mL de adyuvante incompleto de Freund va intradrmica o subcutnea. Se sigue el mismo procedimiento de la primera inmunizacin pero usando el adyuvante incompleto de Freund, por va subcutnea o intradrmica. En SS 0.85%, por va subcutnea o intradrmica. Va intravenosa o intracardaca para la obtencin del antisuero.
15
0.5
3 Sangrado
30 39
0.5 --
SS = Solucin Salina
4.2. Una vez terminado el esquema de inmunizacin en cada caso, realice un gel de electroforesis de poliacrilamida utilizando muestras del suero testigo, del suero obtenido despus de terminado el esquema de inmunizacin y de los antgenos utilizados. Colocar el siguiente orden en el gel. 1. Marcador de peso molecular. 2. Antisuero del conejo antes de iniciar el esquema de inmunizacin. 3. Antisuero del conejo una vez concluido el esquema de inmunizacin. 4. Antgeno inyectado. 5. Estandar de IgG de conejo. 4.3. Cuantificar por medio de densitometra la proporcin de IgG obtenidas. (% pureza). 4.4. Reportar el gel final como resultado de esta prctica. 5. CUESTIONARIO. 5.1 Qu es un antgeno soluble y qu es un antgeno partculado? 5.2 Por qu se utilizan las diferentes vas de inmunizacin para los antgenos? 5.3 Investigue la importancia del uso de adyuvantes en la vacunacin, los principales tipos de adyuvantes y su mecanismo de accin, as como restricciones de uso. 5.4 Cite 5 tipos de antgenos utilizados para la inmunizacin de animales, describiendo la naturaleza del antgeno, la va de inmunizacin que se utiliza y especie de animal en que se desarrolla. 5.5 . Investigue las nuevas vas de administracin de protenas para generar respuesta inmune. 5.6 . Explique de que depende el desencadenamiento un tipo especfico de respuesta inmune (no especfica, humoral o celular) en un organismo. 5.7 . Investigue el peso molecular de las IgG y compare los resultados obtenidos en el gel de acrilamida.
6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
6.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de tcnicas modernas en Inmunologa. Teora y prctica. 1. Edicin. INDRE-SSA. Mxico. 6.2. Manual de laboratorio de Inmunologa. (1998). Departamento de Inmunologa. Escuela Nacional de Ciencias Biolgica. ENCB-IPN. Mxico.

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6.3. Biotecnologa Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba. 6.4 Grupta R., Relyveld E., Lindblad B., Bizzine B., Ben-Efraim S. and Grupta C (1993). Adjuvants-a balance between toxicity and adjuvancicity. Vaccine (11):293-306.

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PRCTICA 3 REACCIONES DE PRECIPITACIN 1. INTRODUCCIN La reaccin de la precipitacin se presenta cuando un antgeno multivalente en estado soluble, se une con su anticuerpo especfico y as da lugar a la formacin de un complejo insoluble. Esta reaccin se utiliza ampliamente para demostrar y cuantificar antgenos y anticuerpos y se puede llevar a cabo en medio de lquido o semislido. La precipitacin en medio lquido puede ser semicuantitativa o cuantitativa. En la primera, slo se estima la cantidad relativa de precipitado formado y en la segunda, al precipitado formado se le determina la concentracin de protenas totales por mtodos espectrofotomtricos o bien por el anlisis de nitrgeno proteico empleado en el mtodo de Kjelndahl. Cuando la reaccin se realiza en medio lquido, la cantidad de precipitado vara segn la proporcin de los reactivos. Si se dispone de una serie de tubos capilares que contengan el mismo volumen de suero y cantidades crecientes de antgeno, puede observarse que el precipitado formado alcanza un mximo, despus del cual, progresivamente, se encuentra una disminucin en la cantidad de precipitado. Si se analizan los sobrenadantes de todos los tubos, los correspondientes a los que presentan un mximo de precipitacin prcticamente no tienen antgeno ni anticuerpos, en tanto, en los precedentes puede demostrarse la presencia de anticuerpos y en el resto, la presencia de antgenos. Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de antgeno agregado y en el eje de las ordenadas la cantidad de precipitado, se obtiene una curva, generalmente en forma de campana, que se puede dividir en tres regiones. La reaccin de precipitacin en medio semislido, se efecta en un gel y se conoce como inmunodifusin. Esta consiste en la difusin, a travs de un gel, de un antgeno, y su anticuerpo homlogo con la consiguiente aparicin de una banda de precipitado en el sitio donde se alcanzan las concentraciones ptimas de ambos reactivos. La velocidad de la difusin depende de la forma, tamao y la concentracin de las molculas precipitantes, as como de la temperatura a la cual se realice la reaccin. Cuando se tienen dos o ms tipos de molculas, stas se pueden difundir a diferente velocidad. En el sitio donde se localicen zonas de concentracin ptima de antgeno y de anticuerpos se formarn bandas de precipitacin. Existen diferentes tipos de inmunodifusin; aquel en el que ambos reactivos difunden libremente en el gel es llamado doble difusin o mtodo de Ouchterlony, el cual puede tener diversas aplicaciones, por ejemplo, la determinacin de la posible relacin inmunolgica entre dos antgenos y del nmero de sistemas antgeno-anticuerpo presentes, as como la semicuantificacin de un antgeno o de un anticuerpo. Otra variante en la que slo uno de los reactivos (generalmente el antgeno) difunde en el gel, donde se haya embebido el otro (generalmente el antisuero), se conoce como imunodifusin simple. En la imunodifusin radial se aplica este principio para determinar cuantitativamente la concentracin del antgeno, ste se encuentra en una concentracin inicial tan alta, que se forman complejos solubles y a medida que se van difundiendo, la

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concentracin disminuye hasta que, en el sitio donde los reactivos estn en proporciones ptimas, se forma un halo de precipitacin cuyo dimetro tiene relacin directa a la concentracin del antgeno. La tcnica de imunoelectroforsis fue propuesta por Grabar y Williams quienes combinaron las tcnicas de electroforesis y de inmunodifusin para separar y determinar la presencia de los componentes de una mezcla de sustancias antignicas. Primeramente, los componentes de la mezcla son separados por la aplicacin de una corriente elctrica y posteriormente, se hacen reaccionar con sus anticuerpos especficos, con los que se realiza la precipitacin. Esta prueba es ampliamente utilizada para determinar la pureza de sustancias antignicas. En la contrainmunoelectroforesis, los antgenos y sus anticuerpos simultneamente se someten a la accin de un campo elctrico en un gel a Ph de 8.6. En estas condiciones, los anticuerpos casi no tienen carga, por lo que no se desplazarn bajo el efecto de la corriente elctrica, sin embargo, se mueven hacia el ctodo debido al flujo endosmtico del regulador usado. Los antgenos que poseen carga negativa migran hacia el nodo y mediante la disposicin apropiada de los pozos en el agar, se puede lograr que el antgeno y el anticuerpo se encuentren, reaccionen y se desarrollen bandas de precipitacin en poco tiempo, dependiendo de la concentracin y de la velocidad de migracin de los reactivos. Obviamente, este mtodo no es aplicable a antgenos con carga positiva o neutra. 2. OBJETIVOS. 2.1. OBJETIVO GENERAL. Evidenciar la reaccin de precipitacin que se lleva a cabo cuando hay interaccin entre antgeno soluble con anticuerpo homlogo. 2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS 2.2.1 Desarrollar la tcnica de precipitacin en capilar para la cuantificacin de los anticuerpos presente en un antisuero especfico. 2.2.2 Valorar la reaccin de precipitacin 3. MATERIALES Y REACTIVOS. 3.1Material por equipo. - 11 tubos capilares de 100 mm de largo y de 1.6 a 1.8 mm de dimetro. - 8 tubos de ensaye de 13 x 100mm. - 8 pipetas de 1.0 ml. - 1 gradilla de plastilina. - Papel absorbente. 3.2 Reactivos - 5 ml. de solucin salina isotnica. - 1.0 ml. de solucin de antgeno que se desea probar. - 1.0 ml. del antisuero correspondiente. - Antisuero del conejo obtenido antes de empezar el esquema de inmunizacin. 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL. 4.1. PRECIPITACION EN CAPILAR.

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1. Se toman 7 capilares y con ayuda de un marcador se marcan a a un volumen de 0.5 mL y 1 mL 2. En 7 tubos de ensaye de 13 x100 mm debidamente rotulados, se hacen diluciones seriadas de la solucin de antgeno: a) Se colocan 0.5 ml de solucin salina en cada uno de los tubos de ensaye. b) Al tubo 1 se le agrega 0.5 ml de la solucin del Ag, se mezclan bien con la misma pipeta (dilucin 1: 2). c) Con una pipeta diferente se toman 0.5 ml del tubo 1 y se pasan al tubo 2, se mezclan bien con la misma pipeta (dilucin 1: 4) d) El procedimiento se repite para los tubos siguientes (dilucin 1:8 a 1:128). 3. Se toma un tubo capilar y por capilaridad se absorbe un volumen tal de antisuero que llegue hasta la primera marca. La parte externa del capilar se limpia con papel absorbente (papel filtro grueso). 4. El tubo capilar se gira ligeramente y se hace descender el volumen de antisuero hasta el otro borde. 5. Por el extremo en el que se encuentra el antisuero en seguida se absorbe la cantidad necesaria de antgeno sin diluir (dilucin 1:1), de tal modo que el volumen total llegue hasta la siguiente marca del tubo. Se limpia la parte externa con papel absorbente. 6. Es necesario realizar dicha operacin con sumo cuidado, evitando que el antisuero se salga del capilar y contamine el antgeno. 7. Con el dedo ndice se tapa uno de los extremos del capilar y se deja que el contenido quede centrado en el capilar. 8. Un extremo se introduce en una barra de plastilina. 9. Se repite el procedimiento sealado en los incisos de 3 al 8 usando cada una de las diluciones del antgeno (de 1:2 a 1:128). 10. Un capilar se llena hasta la segunda marca con antgeno sin diluir y otro, en la misma forma, nicamente con antisuero. El primero es el testigo del antgeno y el segundo es el del anticuerpo. 11. Se dejar reposar y al trmino de la prctica a temperatura ambiente, si no hay reaccin aparente se guardan en el refrigerador y observar a las 12 y 24 horas. 12. Se mide la cantidad de precipitado en milmetros. 4.2 PRECIPITACION EN CAPILAR. Observe cuidadosamente la serie de tubos capilares y mida la altura de la columna de material precipitado en aquellos en que se encuentre. Con estos datos complete una tabla que contengan los siguientes datos: Numero de tubo, factor de dilucin, concentracin del antgeno y altura de la columna.
Numero de Capilar Dilucin del antgeno Concentracin del antgeno Precipitacin en mm
1 2 3 4
1:1 1:4 1:16 1:64
5. CUESTIONARIO Que metodologas actuales se pueden aplicar para medir la reaccin antgenoanticuerpo.

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Desarrolle un esquema para cuantificar la reaccin antgeno anticuerpo en el laboratorio. Qu sugerencias tiene para optimizar la prctica. A nivel comercial que pruebas biolgicas-clnicas se utilizan en la reaccin Ag-Ac?
6. REFERENCIAS. 7.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de tcnicas modernas en Inmunologa. Teora y prctica. 1. Edicin. INDRE-SSA. Mxico. 7.2. Manual de laboratorio de Inmunologa. (2). Departamento de Inmunologa. Escuela Nacional de Ciencias Biolgica. ENCB-IPN. Mxico. 7.3. Biotecnologa Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba. 7.4. Mueller UW, Hawes CS, Jones WR. Monoclonal antibody production by hybridoma growth in Freunds adjuvant primed mice. J. Immunol. Methods 1986; 87:193.

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PRCTICA 4 DETERMINACIN DE PROTENA POR EL MTODO DE BRADFORD 1. INTRODUCCIN El mtodo de Bradford, (1976) involucra la unin del azul brillante de Coomassie G-250 a la protena. Esta unin provoca un cambio en el mximo de absorcin de 465 a 595 nm y este incremento a 595 nm es el que se cuantifica. Dicha unin es independiente de la composicin de aminocidos de las protenas. 2. OBJETIVO 2.1 OBJETIVO GENERAL Determinar de manera cuantitativa el anticuerpo producido, para realizar la inmunodeteccin en medio slido western blot 2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS Cuantificar el anticuerpo producido por la tcnica de Bradford Determinar la variacin de las muestras 3. MATERIALES Y REACTIVOS. 3.1 Material por equipo. - Espectrofotometro - celdas de cuarzo para leer - tubos tipo ependorff - 1 gradilla - Micropipetas - Puntas 3.2 Reactivos - Reactivo de Bradford - Suero del conejo obtenido despus el esquema de inmunizacin. 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL. Se determina la concentracin de protenas, por medio de una curva tipo con BSA y el reactivo de Bradford, como se indica abajo: (BSA) 200 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25 g/mL (mL) Agua destilada 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0 (mL) Reactivo de 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 Bradford (mL)

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160 180 200
Concentracin de BSA g/mL)
20
40
60
80
100
120 140
Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Despus de 5 min de agregado el reactivo de Bradford, se lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con un blanco de reactivos (el que no contiene protena) y se calcula la ecuacin de la recta. La cantidad de protena contenida en la muestra se determina interpolando el dato de absorbencia en la curva tipo elaborada con la albmina de suero de bovino a diferentes concentraciones. Se utiliza la ecuacin obtenida de la curva tipo ANEXOS Preparacin del reactivo de Bradford: 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 se disuelven en 50mL de etanol al 95%. A esta solucin se le aaden 100 mL de cido fosfrico al 85% (w/v). La solucin resultante se diluye a un volumen final de 1litro. Las concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) del colorante, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de cido fosfrico. 5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976. Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).

20
PRCTICA 5 DETERMINACIN DE REACCIN Ag-Ac POR ELECTROTRANSFERENCIA 1. INTRODUCCIN La tcnica de inmunoelectrotransferencia (IET), descrita por Towbin et al en 1979, es uno de los mtodos ms tiles con que se cuenta para el anlisis antignico (Peferoen et al, 1982). Esta metodologa combina el poder resolutivo de la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), en presencia o en ausencia de detergentes como el docecil sulfato de sodio (SDS), con las reacciones inmunoenzimticas en fase slida. Las protenas separadas por pesos moleculares son electrotransferidas a membrana de nitrocelulosa (NC) o de Nylon, en donde se unen a los grupos reactivos de stas, quedando inmovilizadas y expuestas en la superficie para reaccionar con los anticuerpos correspondientes. El patrn que se obtiene sobre el papel de NC es una copia del patrn de separacin obtenido en el gel. Posteriormente de bloquean los sitios reactivos del papel de NC que quedan libres, con alguna protena que no interfiera y a continuacin se hace reaccionar con los anticuerpos problema, los cuales podrn unirse a sus antgenos correspondientes inmovilizados en el papel (Brunete, 1981). La siguiente reaccin que se efecta corresponde a la primera interaccin antgeno-anticuerpo, que se pone de manifiesto al agregar un segundo anticuerpo unido a una enzima como peroxidasa u otro conjugado como protena A de Staphyloccocus aureus igualmente marcada. En el ensayo enzimtico se agrega el sustrato y un cromgeno que precipiten in situ para hacer visible la reaccin. Se puede identificar la clase de respuesta inmunolgica del husped (IgM, IgG, IgA, IgE), usando el conjugado correspondiente. 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GENERAL. Cuantificar el anticuerpo producido, para realizar la inmunodeteccin en medio slido western blot 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 2.2.1 Determinar la presencia del antgeno por medio de la tcnica electrotransferencia. 2.2.2 Realizar la transferencia y deteccin por unin especifica. 2.2.3. Corroborar que el esquema de inmunizacin se llevo de la manera adecuada 3. MATERIALES Y REACTIVOS. 3.1. Material por equipo. Cmara de electrotransferencia Fuente de Poder Papel filtro Whatman 3mm de
Papel de Nitrocelulosa
Ambos papel de nitrocelulosa y papel filtro hay que cortarlos del mismo tamao del gel de porteinas (SDS-PAGE).
Vasos de precipitado

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Micropipetas Matraces aforados Matraces erlenmeyer 3.2. Reactivos Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8% Amortiguador del gel separador pH 8.8 Amortiguador del gel separador pH 6.8 Amortiguador de corrida 5X / SDS Amortiguador de muestra pH 6.8 Persulfato de amonio al 10% Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mL Sol. teidora Sol. desteidora Amortiguador de electrotransferencia [25 mM Tris-HCl, 192 mM glicina, 20% (v/v) metanol, 0.01% (w/v) SDS, pH 8.3]. Solucin salina de fosfatos 0.01M, NaCl 0.15M, pH 7.2 (PBS) Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20,, 0.05%) Rojo de Ponceau [0.2% en cido tricloroactico 3%] Solucin de bloqueo Solucin cromgeno /sustrato 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL. 4.1 Tratamiento de las muestras 5. A la muestra de protena con concentracin conocida se lleva a un volumen de 85 L con amortiguador de muestra. Adicionar con 10 L de la sol. de azul de bromofenol y 5 L de -mercaptoetanol. 6. Poner a ebullicin durante 5 minutos y enfriar. 4.2 Procedimiento para el gel de SDS-PAGE 7. Limpiar con etanol al 70% las placas de vidrio. 8. Colocar el juego de placas de vidrio y separadores en la base para preparar el gel. 9. Preparar el gel separador con forme a la Tabla 1, considerando que al final se adiciona el TEMED y Persulfato de amonio para vaciar en la cmara de electroforesis. Vaciar el gel separador evitando la formacin de burbujas hasta dejar un espacio de 3 cm a partir del borde superior de los vidrios (Tabla 1). Tabla 1.Gel separador para 15 mL Sol. stock (mL) / Conc. gel (%) Sol. Acrilamida bisacrilamida Amortiguador pH 8.8 Agua desionizada Persulfato de amonio 5 6 7 8 9 10 12 13 15 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

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TEMED
0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
10. Dejar polimerizar de 20-30 minutos 11. Preparar el gel concentrador como lo ndica la Tabla 2, vaciar en la parte superior del gel. Tabla 2. Gel concentrador para 2 mL Sol. Acrilamida bisacrilamida Amortiguador pH 6.8 Agua desionizada Persulfato de amonio TEMED 3. 4. 5. 6. 7. 0.26 mL 0.5 mL 1.22 mL 0.01 mL 0.002 mL
Colocar el peine con cuidado de no formar burbujas y dejar polimerizar por 20 min. Preparar las muestras y el marcador de peso molecular. Montar las placas de vidrio en su base y sta en la cmara de electrofresis. Preparar el amortiguador de corrida al 1X. Llenar la cmara interna con amortiguador de corrida hasta el lmite y la parte externa hasta cubrir los electrodos. 8. Cargar el gel con las muestras y el marcador de peso molecular. 9. Tapar y conectar los electrodos a la fuente de poder. 10. Iniciar con un voltaje de 50 V hasta que las muestras pasen del gel concentrador, posteriormente aumentar a 100 V hasta que el frente alcance la parte inferior del gel. 11. Apagar la fuente de poder y recuperar el amortiguador de corrida (se puede utilizar hasta 3 veces) 12. Desmontar la cmara y extraer con cuidado el gel. Colocar el gel en un recipiente adecuado y teirlo con la sol. correspondiente. Colocar en agitacin orbital durante 1 hora aprox. Retirar el gel y sumergirlo en la sol. desteidora hasta desteir bien el gel. Una vez obtenido el gel SDS-PAGE, se sumerge en amortiguador de transferencia. 4.3 Preparacin de la cmara y transferencia. 1.- Colocar fibras Scotch y papeles Whatman (grosor 0.16 mm) en un recipiente con suficiente amortiguador de transferencia, 30 minutos antes de transferir. 2.- Cortar la membrana de nitrocelulosa (NC) de acuerdo al tamao del gel (utilizando guantes) y colocarla en otro recipiente que contenga amortiguador de transferencia. 3.- Colocar dos fibras Scoth en un cassette para electrotransferencia, sobre las cuales se colocan dos porciones de papel filtro teniendo cuidado que no queden burbujas atrapadas entre los papeles; despus colocar el gel y sobre este la membrana de NC; eliminar las burbujas. 4.- Con un lpiz marcar el frente de electroforesis del gel, sobre el papel de NC y sealar el nmero de carril de acuerdo a la colocacin de las muestras, colocar otros dos papeles filtros sobre la NC y otras dos fibras. Cerrar el cassette e insertarlo en el contenedor. 5.- Colocar el contenedor en la cmara y llenarla con el amortiguador de transferencia, tapar y conectar los electrodos de tal manera que el nodo (-) quede del lado del gel y el

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ctodo (+) del lado de la NC; conectar a la fuente de poder y transferir durante 1 hora a 100 V, cuidando de que la temperatura del lquido no se eleve a ms de 60 C. 6.- Al terminar la transferencia tomar la membrana de NC con guantes y colocarla en un recipiente con solucin para teir (durante 20 minutos) 7.- Observar en la membrana si se distinguen las protenas que fueros transferidas, lavar con agua destilada para retirar el exceso de colorante y secar; si no se alcanzan a distinguir las bandas teir otros 20 min. 4.4 Reaccin inmunoenzimtica 1.- Colocar la membrana de NC en un recipiente que contenga 30-50 mL del amortiguador de bloqueo e incubar 2 h a temperatura ambiente en agitacin continua. 2.- Eliminar el exceso de solucin de bloqueo por decantacin y hacer 3 lavados con PBSTween de 5 min. Cada uno con agitacin contina. 3.- Incubar la membrana con el suero o anticuerpo de inters a las diluciones establecidas con anterioridad. 4.- Eliminar el exceso y lavar come en el paso 2. 5.- Posteriormente se agrega el conjugado correspondiente en la dilucin apropiada con PBS-Tween. Se incuba durante 2 h a temperatura ambiente con agitacin continua. 6.- Se repite el paso 4. 7.- Por ltimo se agrega la solucin cromgeno/sustrato para dot-ELISA e inmunoelectrotransferencia y se espera hasta que aparezcan las bandas; despus se enjuaga con agua desionizada y se deja secar. ANEXOS SOLUCIONES PARA GEL SDS-PAGE Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8% Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) ms 0.8g de bis-acrilamida. Disolver en agua bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco mbar a 4 C. Usar guantes al pesar ya que la archilamida es un compuesto neurotxico. Amortiguador del gel separador pH 8.8 Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente. Amortiguador del gel separador pH 6.8 Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el pH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente. Amortiguador de corrida 5X / SDS Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de Glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada y aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X. Amortiguador de muestra pH 6.8 Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y ajustar el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el volumen a 100 mL. Persulfato de amonio al 10%

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Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mnimo necesario. Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mL Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar en refrigeracin. Sol. teidora Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de cido actico y 40 mL de agua desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Commasie en el metanol y adicionar el cido actico. Aforar con el agua desionizada. Sol. desteidora Para preparar 500 mL se usan 25 mL de cido actico, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de agua desionizada. SOLUCIONES DE ELECTROTRANSFERENCIA Amortiguador de transferencia (Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2M y agregar 14.49 g de glicina, aadir 200mL de metanol aforar a 1000 mL con agua bidestilada. Guardar a 4C. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de la calidad del tris, el metanol debe ser grado analtico, este amortiguador se puede usar hasta 3 veces, despus de cada uso filtrar con papel Whatman n 1. Solucin salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS) Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl. Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solucin de PB se prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobsico monohidratado y 11.5 g de fosfato de sodio dibsico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L con agua desionizada. Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%) A un litro de PBS pH 7.2 aadir 500 L de Tween 20. Solucin de bloqueo. Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20. Guardar a -20 C. Rojo de Ponceau 0.2% en cido tricloroactico 3% Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y aadir 3 g de cido tricloroactico. Aforar a 100 ml con agua desionizada. Mantener a 4 C en frasco color ambar. Solucin cromgeno / sustrato Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, aadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS, agregar 25 l de perxido de hidrgeno al 3%. Nota: esta solucin se prepara inmediatamente antes de usarla. 5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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1. Fundenberg, Hugh, Stites Daniel, Caldwell, Joseph, Wells, Vivian, Manual de Inmunologa clinica, segunda edicin, editorial el Manual Moderno, Mexico, 1980, pp. 5060. 2. Towbin H., Staehelin, Gorgon J.. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Sci USA, 1979, 76:4350. 3. Peferoen M. R., Huybrechts R., De Loof A. Vaccum-blotting: A new simple and efficient transfer of proteins from sodium docedyl sulfate-polyacrylamide gels to nitrocellulose. FEBS Lett. 1982, 145:369.

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