Manual de prácticas de inmunología general UAM

POR MI
PIRITV
RAZA HA
ES
B
L
L
E A
RA
FACULTAD DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
SECCIÓN DE BIOLOGÍA
MANUAL DE PRÁCTICAS
LABORATORIO DE
INMUNOLOGÍA GENERAL
Saturnino de León Chapa Magdalena Acosta Segura

Patricia Elvira Berrón Ruíz Rodolfo Pastelín Palacios
Rosana Pelayo Camacho Fernando García Tamayo
Junio de 2003
PRÓLOGO
Inmunología General representa una de las asignaturas teórico-prácticas que

resultan trascendentales para los estudiantes de la carrera de Química
Farmacéutico-Biológica, por cuanto que sienta las bases de una formación sólida
que permite el adecuado desempeño en el campo de la salud, a través del uso y/o
el diseño de metodologías diagnósticas, preventivas y terapéuticas que incluyen
elevados índices de confiabilidad, sensibilidad y especificidad.
Si bien se trata de una disciplina en la que los avances científicos progresan a

ritmos especialmente acelerados, el curso práctico de esta materia cubre con
evidente eficacia su objetivo general de enseñar las técnicas y fundamentos
“claves”. Esto último se refleja claramente en el hecho de que los alumnos
mantienen un creciente interés por conocer y profundizar en relación con los
nuevos hallazgos, aspecto esencial para lograr su permanente actualización.
El presente manual contiene los principales fundamentos y técnicas asociados a

los ejercicios que se realizan hoy en día en el laboratorio de Inmunología General,
lo que sin duda representará un gran apoyo para los estudiantes. Lógicamente,
como cualquier texto sobre Inmunología, éste es perfectible y deberá ser
modificado y ajustado continuamente, tal como lo han afirmado en forma reiterada
los docentes del curso.
Expreso mi mayor reconocimiento a los autores de esta gran obra, los profesores
Saturnino de León Chapa, Patricia E. Barrón Ruiz, Rosana Pelayo Camacho,
Magdalena Acosta Segura, Fernando García Tamayo y Rodolfo Pastelín Palacios,
y dicha manifestación de respeto académico también la hago extensiva a los
profesores Ma. Guadalupe Reyes García, Luisa Constanza del R. Cervantes
Barragán, Marco Velasco Velázquez y Constantino III R. López Macías quienes,
mostrando un ejemplar espíritu de equipo, contribuyeron con los autores
realizando diversas y muy valiosas aportaciones.
Raúl Garza Velasco

Jefe del Departamento de Biología
1
Í N D I C E
UNIDAD 1. INMUNÓGENOS, ANTÍGENOS E INDUCCIÓN DE LA RESPUESTA

INMUNE
1. Preparación de inmunógenos y antígenos. 4

I. Extracto de tejido muscular o proteínas plasmáticas de origen 6
humano, equino, bovino, porcino, de pollo, de perro, etc.
II. Proteínas purificadas. 9
Albúmina y γ-globulina humana
III. Preparación de antígenos e inmunógenos celulares. 11
Glóbulos rojos de carnero.
IV. Preparación de antígenos e inmunógenos bacterianos. 13
Antígenos OK-L de Escherichia coli.
Antígenos de Shigella dysenteriae.
Antígenos totales de B. abortus.
Antígeno somático (O) de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi).
Antígeno flagelar (H) de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi).
2. Inmunización de animales de laboratorio. 21

Sueros antiespecie.
Sueros anti-proteínas purificadas.
Suero anti-eritrocitos de carnero (Amboceptor hemolítico anti-carnero).
Sueros antibacterianos.
UNIDAD 2. INTERACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO (Ag-Ac)

INMUNOPRECIPITACION 28
3. Curva de precipitación cuantitativa en capilar. 33
4. Mezcla de antígeno y anticuerpo. 36

Prueba de Identidad a sueros de uso terapéutico.
Determinación del origen de manchas de sangre.
5. Doble difusión en placa (Ouchterlony) 38

Identificación de fracciones antigénicas presentes en suero humano.
6. Inmunodifusión radial simple (RID). (Mancini, Carbonara y Hermans) 41

Cuantificación de albúmina sérica humana (ASH).
7. Inmunoelectroforesis (IEF). (Grabar y Williams) 44

Análisis de proteínas en Suero Humano.
UNIDAD 3. REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

AGLUTINACIÓN DIRECTA E INDIRECTA 47
2
8. Aglutinación en placa. 49
Titulación de sueros anti-bacterianos
9. Aglutinación en tubo. 52
Tipificación de grupo sanguíneo ABO y Rh.
10. Hemaglutinación Indirecta. 55

Titulación de anticuerpos frente a tiroglobulina.
UNIDAD 4. CITÓLISIS INMUNE

REACCIONES DE CITÓLISIS 60
11. Titulación de Amboceptor Hemolítico Anticarnero. 62
UNIDAD 5. TÉCNICAS CON ANTICUERPOS MARCADOS

INMUNOFLUORESCENCIA, RADIOINMUNOANÁLISIS, 65
INMUNOENZIMÁTICOS
12. Ensayo inmunoenzimático 67
UNIDAD 6. PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS

MÉTODOS DE PURIFICACION DE ANTICUERPOS 70
13. Purificación fraccionada con sales neutras. 73

Purificación de γ-globulinas a partir de plasma humano.
ANEXO I. TÉCNICAS DE APOYO 76
A. Coagulación de plasma
B. Determinación de proteínas. Método de Biuret
C. Curva de Mc Farland
D. Preparación de suspensiones de eritrocitos de carnero
E. Manejo y desecho de material biológico potencialmente infeccioso
ANEXO II. PREPARACIÓN DE REACTIVOS 82
BIBLIOGRAFÍA 86
3
UNIDAD 1
PRÁCTICA No. 1
PREPARACIÓN DE INMUNÓGENOS Y ANTÍGENOS.
GENERALIDADES
Anteriormente el término antígeno era utilizado para denominar a todos aquellos
agentes capaces de estimular una respuesta inmune y además de interaccionar
con los productos de ésta (anticuerpos y linfocitos T sensibilizados).
Actualmente, se ha establecido que una sustancia puede o no tener dos

propiedades diferentes, una la inmunogenicidad y otra la antigenicidad.
Por tanto, se considera inmunógeno a toda sustancia capaz de inducir respuesta

inmune al ser introducido a un individuo inmunocompetente. Estas sustancias
deben reunir ciertos requisitos para actuar como tales, entre estas características
se pueden mencionar:
- Ser reconocidas como extrañas por el animal inmunizado,

- Su peso molecular, que generalmente es mayor a 10 kDa,
- De naturaleza química proteica o polisacárida,
- La rigidez estructural,
- La complejidad molecular,
- El volumen molecular,
- El contenido de grupos cargados y configuración
- Su difusibilidad
El concepto antígeno designa únicamente a aquella sustancia que reacciona con

sus anticuerpos específicos.
Existen ciertas sustancias llamadas haptenos, que no reúnen todas las

condiciones de inmunogenicidad, que por sí solas no inducen la respuesta
inmune, pero si lo hacen cuando son conjugadas a una proteína acarreadora
(complejo hapténico).
La respuesta inmune de un animal a un inmunógeno puede ser un fenómeno

totalmente natural, como sucede en el caso de infecciones causadas por
microorganismos, en estados de hipersensibilidad a distintos elementos del medio
ambiente, en las enfermedades autoinmunes o en aquellas ocasiones en que son
generadas para rechazar a una neoplasia.
Pero también la respuesta inmune puede ser inducida artificialmente en un

individuo mediante la aplicación del inmunógeno, como sucede en las
vacunaciones, en la hipersensibilidad a fármacos, en transplantes o a nivel
laboratorio en animales de experimentación con diferentes fines tanto de
investigación como de producción de sueros inmunes.
4
En muchos de estos casos se requiere contar con los inmunógenos preparados
adecuadamente y un esquema de inmunización ideal para lograr inducir la
respuesta inmune.
Entre los inmunógenos y antígenos de mayor interés están:

• Bacterias
• Virus
• Hongos
• Parásitos
• Proteínas u otros componentes purificados a partir de estos organismos como
las toxinas (toxoides).
• Sueros heterólogos
• Proteínas animales heterólogas purificadas
• Extractos vegetales
• Proteínas vegetales purificadas.
• Células animales o vegetales
• Componentes de células animales o vegetales purificadas
• Complejos hapténicos
Las aplicaciones que tiene el conocimiento de la preparación de estos productos

biológicos es muy variada, de las cuales podemos mencionar:
Como antígenos:
⇒ Antígenos de bacterias, hongos, parásitos y virus para la determinación de
anticuerpos en suero, líquido cefalorraquídeo, etc.; para el diagnóstico de
enfermedades causadas por estos organismos.
⇒ Para el estudio de la composición antigénica de microorganismos.
⇒ En la investigación de reacciones cruzadas entre individuos de diferente
especie.
⇒ En la determinación de estructura, localización de determinantes antigénicos
(epítopos), etc.
Como inmunógenos:
⇒ Producción de vacunas, ya sea constituidas por microorganismos completos o
por fracciones de estos, tanto para uso humano o veterinario.
⇒ Obtención de sueros inmunes para uso diagnóstico.
⇒ Preparación de sueros inmunes para uso terapéutico.
⇒ Producción de sueros inmunes utilizados en control de alimentos y bebidas.
⇒ Obtención de sueros inmunes de uso en Química Legal.
⇒ En investigación para el estudio de la respuesta inmune
El objetivo de esta unidad es que el alumno vea ejemplificada la preparación de

antígenos e inmunógenos de diferente naturaleza.
5
I. EXTRACTO DE TEJIDO MUSCULAR O PROTEINAS PLASMÁTICAS DE
ORIGEN HUMANO, EQUINO, BOVINO, PORCINO, DE POLLO, DE
PERRO, ETC.
MARCO TEÓRICO
Los extractos de tejidos o las proteínas plasmáticas de animales son excelentes
inmunógenos cuando son inyectados en otro individuo taxonómicamente alejado,
por lo que son utilizados en la inmunización de animales de laboratorio para
obtener sueros inmunes denominados antiespecie que pueden ser aplicados en
el campo del control de alimentos para determinar de que especie proceden las
carnes y sus derivados, en Química Forense para establecer el origen de una
mancha de sangre, en diagnóstico para el análisis de proteínas o bien en las
pruebas de identidad de sueros de uso terapéutico.
En el presente ejercicio se van a preparar extractos de tejido muscular o bien

suero, estériles que posteriormente serán utilizados en la inmunización de conejos
para obtener el correspondiente suero antiespecie.
I.1.1 PREPARACIÓN DE UN EXTRACTO DE TEJIDO
MATERIAL
1 Embudo de 6 cm de diámetro con tres capas de gasa.
2 Pipetas de 10 mL (1/10)
1 Disco de papel filtro de poro grueso (10 cm diám.)
1 Tijeras de punta recta.
1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL.
1 Bisturí.
1 Balanza granataria.
1 Licuadora con vaso de 250-500 mL.
40 g Tejido muscular de equino, pollo, perro, bovino, etc.

60 mL Solución salina isotónica (SSI).
TÉCNICA
1. Eliminar toda la grasa y aponeurosis del trozo de tejido muscular y cortarlo
en fragmentos de 0.5 a 1.0 cm.
2. Pesar el tejido y pasarlo al vaso de la licuadora. Agregar SSI a tener una
proporción de 1:2 (p/v) y triturar hasta que el tejido esté perfectamente
homogeneizado.
3. Pasar el tejido triturado al matraz Erlenmeyer y dejarlo en refrigeración
durante toda la noche para extraer la mayor cantidad de proteínas.
4. Filtrar a través de tres capas de gasa para eliminar las partículas gruesas
y en seguida por papel de poro grueso.
5. Determinar la concentración de proteínas por el método de Biuret.
6. Esterilizar por filtración. (Ver I.2, pag. 4).
6
I.1.2 PREPARACIÓN DE UN SUERO HETERÓLOGO
MATERIAL
1 Jeringa de 20 mL estéril.
1 Aguja hipodérmica del No. 17 de 3” estéril.
1 Aplicador de madera
2 Tubos de centrífuga de 50 mL de plástico.
1 Matraz Erlenmeyer de 100 mL.
1 Pipeta de 10 mL (1/10) con bulbo (propipeta).
40 mL Sangre de humano, equino, bovino, porcino, etc.

60 mL Solución salina isotónica (SSI).
TÉCNICA
1. Tomar por punción venosa 40 mL de sangre ya sea de perro, caballo,
burro, cerdo, etc. y colocar 20 mL en cada uno de los tubos de centrífuga.
2. Dejar coagular la sangre y con un aplicador de madera separar el coágulo
de las paredes del tubo. Centrifugar 30 minutos a 3000 r.p.m.
3. Mediante la pipeta con bulbo, separar cuidadosamente el sobrenadante y
pasarlo al matraz Erlenmeyer.
5. Esterilizar por filtración. (Ver I.2, pag. 7).
NOTA: Si en lugar de suero se utiliza plasma, es necesario coagularlo con

CaCl2 como se describe en el anexo I.A, para evitar la formación de redes
de fibrina que interfieran durante la filtración.
I.2 ESTERILIZACIÓN DEL EXTRACTO DE TEJIDO O DEL SUERO
MATERIAL
1 Equipo para filtración estéril. Constituido por: Filtro Seitz, matraz Kitasato
de 500 mL, manguera para vacío de 50 cm, material filtrante EKS-1 y
manguera de látex de 10 cm.
2 Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido.
2 Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados.
2 Pipetas de 10 mL (1/10) estériles.
2 Pipetas de 1.0 mL (1/10) estériles.
2 Frascos tipo “vial” de 10 mL con tapón estériles.
2 Mecheros
9 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril.
TÉCNICA
1. Esterilizar el extracto de tejido o el suero por filtración en filtro Seitz,
aplicando vacío ligero para que no se forme espuma.
2. En condiciones de esterilidad, pasar 1.0 mL del filtrado a uno de los
frascos “vial” y el resto en el segundo frasco.
3. Adicionar al primer frasco 9.0 mL de SSI estéril y mezclar (dilución 1:10).
7
4. Realizar la prueba de esterilidad micótica y bacteriana a cada producto
sembrando 0.1 mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los
primeros a 32-35°C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo
menos una semana.
5. Etiquetar y guardar el extracto o suero diluido y el concentrado en
refrigeración hasta su empleo. Desechar cuando se observe turbidez, ya
que esto indica que hay desarrollo de contaminantes bacterianos.
NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso

seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.
8
II. PREPARACIÓN DE PROTEINAS PURIFICADAS
ALBÚMINA SÉRICA HUMANA Ó γ GLOBULINA HUMANA
MARCO TEÓRICO
La mayoría de las proteínas animales y vegetales cumplen con los requisitos de
inmunogenicidad y por tanto se pueden utilizar como inmunógenos en su forma
nativa, pero si se desea tener mayor especificidad en la respuesta inmunológica,
es necesario purificarlas.
Los métodos de purificación dependen de las propiedades fisicoquímicas de cada

una de las proteínas tales como su solubilidad, peso molecular, tamaño, carga
eléctrica, pI, etc., en la siguiente tabla se ejemplifican algunos de ellos:
BASADOS EN: MÉTODO

• Precipitación con sales neutras
Diferencias de solubilidad: • Precipitación con metales pesados
• Precipitación con solventes orgánicos
• Precipitación con ácidos o bases (pI)
Diferencias en carga • Electroforesis
eléctrica: • Cromatografía de intercambio iónico
Diferencias en PM y • Permeación molecular
tamaño: • Ultracentrifugación en gradiente
Estas prácticas se llevarán a cabo a partir de proteínas purificadas comerciales y

el ejercicio consistirá en la preparación de soluciones estériles de éstas con la
concentración necesaria para la inmunización de conejos, para obtener los
correspondientes anticuerpos.
MATERIAL
2 Tubos de 16 X 150 estériles
2 Pipetas de 10 mL (1/10) estériles
4 Pipetas de 1 mL (1/10) estériles
2 Frascos tipo “vial” de 12 mL c/tapón estériles
2 Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido.
2 Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados.
0.3 mL Albúmina sérica humana (ASH) comercial de 25% ó γ globulina humana

al 1% estériles.
25 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril
TÉCNICA
TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD
1. A partir de una solución comercial estéril de albúmina sérica humana
(ASH) ó de γ globulina humana purificadas cuya concentración es de 25
g/100 mL ó 1 g/100 mL preparar dos diluciones con solución salina
isotónica estéril:
9
Para ASH:
1:50 para tener una concentración de 5 mg/mL
Para γ globulina humana:
3. Realizar la prueba de esterilidad micótica y bacteriana sembrando 0.1
mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 32-
35°C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una
semana.
4. Etiquetar y guardar en refrigeración hasta su empleo. Desechar cuando se
observe turbidez, ya que esto indica que hay desarrollo de contaminantes
bacterianos.

10
III. PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS E INMUNÓGENOS CELULARES
GLÓBULOS ROJOS DE CARNERO
MARCO TEÓRICO
Las células de origen animal o vegetal constituyen verdaderos mosaicos
antigénicos debido a la compleja composición de sus organelos.
La preparación de antígenos e inmunógenos celulares tiene varias aplicaciones,

entre las que se puede mencionar la producción de anticuerpos específicos
usados como reactivos para la identificación de alguna población específica de
células como en el caso de la tipificación sanguínea y la determinación de
moléculas de histocompatibilidad HLA (antígenos de los leucocitos humanos),
pero también se han utilizado para la investigación de marcadores y receptores
celulares. Para estas aplicaciones, la elaboración de anticuerpos monoclonales ha
cobrado mayor importancia.
En esta sección se ejemplifica la preparación de antígenos celulares con la
obtención de eritrocitos de carnero lavados para su utilización inmediata en la
inmunización de conejos para así obtener el correspondiente suero inmune.
MATERIAL
1 Jeringa de 10 mL con aguja No. 20 estéril
2 Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL c/tapón estériles
1 Pipeta de 1 mL (1/10) estéril
1 Equipo de succión constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado
con tapón de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2
tramos de manguera para vacío de 30 cm.
1 Bulbo para pipeta
1 Frasco tipo “vial” de 10 mL con tapón estériles
2 Mecheros
Centrífuga con cabezal para tubos de 15 mL
3 mL Solución de Alsever estéril

100 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril
TÉCNICA
TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD
1. Llenar la jeringa con 3 mL de la solución de Alsever estéril y puncionar la
vena yugular de un carnero y tomar 3 mL de sangre.
2. Quitar la aguja de la jeringa y vaciar la mezcla sangre-Alsever a un tubo
de centrífuga cónico de 15 mL estéril dejándola resbalar por las paredes.
Tapar el tubo.
3. Centrifugar durante 15 min a 2500 rpm.
4. Eliminar el sobrenadante utilizando el equipo de succión y la pipeta de 10
mL estéril.
11
5. Lavar el paquete de eritrocitos 5 veces de la siguiente manera: Agregar 10
mL de SSI estéril, resuspender los glóbulos rojos perfectamente con una
pipeta estéril adaptada con un bulbo. Tapar y centrifugar 10 min a 2500
rpm. Eliminar completamente el sobrenadante mediante el equipo de
succión.
6. Al término de los lavados, tomar 1.5 mL de paquete de eritrocitos con una
pipeta estéril y pasarlos al frasco “vial” estéril.
7. Agregar 13.5 mL de SSI estéril para tener una suspensión al 10%, que es
como se va a utilizar para la inmunización del conejo. Tapar el frasco.
8. Esta suspensión deberá conservarse en refrigeración, entre 4 y 6 °C hasta
el momento de emplearse y solo puede usarse durante 4 días, ya que el
envejecimiento desnaturaliza a los antígenos presentes en los eritrocitos.

12
IV. PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS E INMUNÓGENOS BACTERIANOS
Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Brucella abortus, Salmonella
9,12,d,Vi (serotipo Typhi).
MARCO TEÓRICO
Las bacterias están constituidas por un gran número de fracciones antigénicas
diferentes, de aquí que se pueda utilizar como antígenos o inmunógenos tanto las
células íntegras o sus fracciones aisladas; ya sea componentes somáticos,
flagelares o capsulares, dependiendo del tipo de bacterias. Otras veces se
utilizan los productos del metabolismo de estos microorganismos como son las
toxinas.
No todas las bacterias tienen una estructura antigénica similar. En algunas hay
predominio de componentes proteicos, en otras los carbohidratos constituyen los
Ag que permiten su diferenciación; y en algunos casos particulares son
fosfoglucolípidos complejos.
Para ejemplificar la complejidad del mosaico antigénico de las bacterias se

mencionarán las características de los principales antígenos de las
enterobacterias:
Antígenos somáticos u “O”: Son lipopolisacáridos que se encuentran formando

parte de la pared celular bacteriana, resisten temperaturas de 100°C por tiempos
prolongados y no se destruyen con alcohol, ni con ácidos diluidos. Corresponden a
la endotoxina de muchas enterobacterias entre ellas Salmonella y su especificidad
antigénica reside en la parte oligosacárida.
Antígenos flagelares o “H”: Son componentes de naturaleza proteica localizados

en los flagelos de las bacterias, lábiles a temperaturas mayores de 60°C y al
tratamiento con alcohol o ácido.
Antígeno de virulencia o “Vi”: Es también superficial, de naturaleza glucolipídica

y difiere químicamente del antígeno somático “O”, se encuentra en algunas
especies del género Salmonella y en otras enterobacterias, es termolábil.
Antígenos capsulares o “K”: Se encuentran en las envolturas o cápsulas de

algunas bacterias, generalmente de naturaleza polisacárida que tienen secuencias
repetidas de dos o tres azúcares, son termorresistentes.
Dentro de las aplicaciones más importantes de los antígenos bacterianos está la

determinación cuali y semicuantitativa de anticuerpos en muestras de suero
humano en el diagnóstico de infecciones bacterianas y la titulación de sueros
hiperinmunes de animales inmunizados, mediante reacciones antígeno-anticuerpo.
Como inmunógenos, estas preparaciones son utilizadas en la formulación de

vacunas tanto de uso humano como veterinario, así como en la inoculación de
animales de laboratorio para la obtención de sueros inmunes cuya aplicación es
13
amplia en la identificación de bacterias, tanto en muestras biológicas de origen
humano para diagnóstico, como en el control microbiológico de alimentos y
productos farmacéuticos.
Durante la preparación de antígenos bacterianos es importante conocer el

fenómeno llamado variación antigénica el cual implica la pérdida de antígenos o
cambios en la especificidad debido a envejecimiento del cultivo, infección por
bacteriófagos o a otros factores que son lesivos para las bacterias.
Además, cuando se trabaja con bacterias y en general con microorganismos se

debe tener en cuenta que existe antigenicidad cruzada entre especies diferentes,
hecho que cobra importancia cuando se hace tipificación bacteriana o cuando se
obtienen sueros antibacterianos que obliga a someterlos a procesos de
purificación para aumentar su especificidad.
Brevemente, los procedimientos más relevantes para la obtención de estos

preparados bacterianos involucran:
Contar con una cepa pura de la bacteria, propagarla en medios de cultivo

adecuados, que permitan la expresión de los componentes antigénicos de interés,
atenuarla (disminución de la virulencia) o inactivarla (perdida de viabilidad) según
sea el caso, mediante métodos que eviten la desnaturalización de los
componentes antigénicos y, finalmente ajustar a una concentración determinada,
que está en relación a su uso.
La atenuación de las bacterias puede llevarse a cabo mediante resiembras

sucesivas en condiciones poco favorables, aislamiento de los microorganismos de
casos de infecciones leves, etc.; mientras que para la inactivación se cuenta con
métodos físicos (exposición al calor), químicos (tratamiento con formol o timerosal)
o combinaciones de estos; en el caso de las toxinas, son convertidas a toxoides
(pierden toxicidad pero no su composición antigénica tratándolas con
formaldehído).
Durante la producción de un antígeno o inmunógeno bacteriano se deben llevar a

cabo una serie de controles que son más o menos rigurosos según sea el destino
del biológico preparado, así una vacuna (principalmente de uso humano) requiere
de un mayor número y más estrictas pruebas de control, muchas de ellas
reglamentadas o bien definidas en las farmacopeas.
Estas pruebas de control pueden ser biológicas en donde se incluye: identidad,

pureza, inactivación, toxicidad, atoxicidad, esterilidad bacteriana y micótica,
inocuidad, potencia, etc.; o bien químicas como: pH, determinación de
adyuvantes y conservadores, proteínas totales, cloruros, sólidos totales, humedad
residual, solubilidad, etc.
En los siguientes ejercicios se describe la preparación de inmunógenos a partir de

cepas de, E. coli, Sh. dysenteriae, B. abortus y S. typhi que serán utilizados en
la inoculación de conejos para la obtención de sueros inmunes antibacterianos.
14
E. coli: Tiene Ag “O” que han servido para identificar más de 150 serotipos,
además presenta Ag “K” que de acuerdo con su termorresistencia han sido
clasificados en: Ag “A” (estables a más de 120°C), Ag “B” (a 100°C pierden su
inmunogenicidad pero no su antigenicidad) y Ag “L” (son destruidos a 100 °C).
Sh. dysenteriae: No presenta flagelos, por lo tanto no tiene antígenos “H”, sin
embargo sus antígenos somáticos “O” tienen un alto poder antigénico y en base a
ellos se han descrito varios serotipos de los 4 grupos de Shigella.
Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Inicialmente el género Salmonella fue

clasificado por Kauffman-White en 5 grupos en base a sus antígenos somáticos
“O”, que difieren químicamente en cuanto a su composición de azúcares,
presencia de grupos acetilo sustituidos y enlaces glicosídicos alfa y beta.
Actualmente esta clasificación se ha completado y se describen 9 grupos
denominados A, B, C, D, E, F ,G, H e I en donde se encuentran incluidos más de
1020 serotipos diferentes. Además, algunas cepas de Salmonella son móviles y
presentan flagelos y en base a sus antígenos flagelares o “H” se puede hacer una
clasificación más precisa de estos microorganismos.
B. abortus: Las seis especies del género Brucella son antigénicamente similares,
siendo su lipopolisacárido y sus proteínas de membrana externa (PME) los
antígenos más importantes. Las PME están clasificadas en tres grupos,
considerándose a las del grupo II como porinas.
15
IV.1 PROPAGACIÓN DE LAS CEPAS
CEPAS:
B. abortus
E. coli
Sh. dysenteriae
Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)
Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) de gran movilidad para obtención
de Ag “H”
MEDIOS DE CULTIVO:
1 Medio para el desarrollo de la cepa: Tubo de 16 x 150 mm con 7 mL de
medio.
1 Medio de propagación: matraz Erlenmeyer de 1000 mL conteniendo 350
mL de medio.
CEPA MEDIO PARA EL MEDIO DE

DESARROLLO DE LA PROPAGACION
CEPA
B. abortus Caldo triptosa Agar triptosa
E. coli Agar BHI inclinado Agar BHI
Sh. dysenteriae Agar BHI inclinado Agar BHI
Salmonella 9,12,d,Vi Veal-infusion Agar Veal-infusion
(serotipo Typhi) Ag “O”
Salmonella 9,12,d,Vi Veal-infusion Veal-infusion
(serotipo Typhi) Ag “H”
MATERIAL
1 Asa bacteriológica
2 Mecheros
1 Juego de colorantes para Gram.
2 Portaobjetos.
Microscopio.
15 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril (Exclusivo para E. coli y Sh.
dysenteriae).
500 mL Solución salina isotónica (SSI) formolada al 0.6% estéril. (Exclusivo para
Ag “H” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)).
TÉCNICA
IV.1.1 ANTIGENOS OK-L DE Escherichia coli.
IV.1.2 ANTIGENOS DE Shigella dysenteriae.
1. Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un cultivo puro
de E. coli o de Sh. dysenteriae e incubar 24-48 h a 37°C.
16
2. Con la pipeta adaptada con un bulbo de hule agregar 8 mL de SSI estéril
al cultivo anterior y levantar el desarrollo, expeliendo y absorbiendo varias
veces.
3. Verificar la pureza del cultivo mediante tinción de Gram. Debe observarse
sólo bacilos Gram negativos. Si la prueba es satisfactoria continuar con el
paso No.4, de lo contrario desechar el cultivo.
4. Pasar la suspensión bacteriana al matraz que contiene el medio de
propagación, extender el inóculo por toda la superficie e incubar el
matraz 18-24 horas a 37°C.
5. Adicionar 15 mL de SSI estéril y desprender todo el desarrollo bacteriano
dando al matraz movimientos de rotación suaves.
6. Comprobar la pureza del cultivo realizando una tinción de Gram.
7. Si hay algún tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es
satisfactoria continuar con el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO COMÚN
PARA LA PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS BACTERIANOS, (IV.2, pag.
18).
IV.1.3 ANTÍGENOS TOTALES DE B. abortus.

IV.1.4 ANTÍGENO SOMATICO (O) DE Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi).
IV.1.5 ANTIGENO FLAGELAR (H) DE Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi).
1. Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un inóculo

abundante de la cepa de B. abortus o Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo
Typhi) e incubar 24-48 h ó 18-24 h, respectivamente a 37°C.
2. Verificar la pureza del cultivo mediante una tinción de Gram. Deberán
observarse únicamente cocos Gram negativos en el caso de Brucella y
bacilos Gram negativos en el caso de Salmonella. Si hay algún tipo de
contaminante desechar la cepa y si la prueba es satisfactoria continuar
con el paso No. 3.
3. Pasar 8-10 mL del cultivo al matraz del medio de propagación, extender
el inóculo en toda la superficie en el caso de tratarse de medio sólido, o
agitar el matraz para incorporar perfectamente si el medio es líquido.
Incubar el matraz 18-24 h a 37°C.
4. Comprobar la pureza del cultivo realizando una tinción de Gram. Para los
cultivos en medio sólido primero adicionar 15 mL de SSI estéril y
desprender todo el desarrollo bacteriano dando al matraz movimientos de
rotación suaves.
5. Si hay algún tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es
satisfactoria continuar en el caso de B. abortus y Ag “O” de Salmonella
9,12,d,Vi (serotipo Typhi) desde el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO
COMÚN PARA LA PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS BACTERIANOS,
(IV.2, pag. 18) y para el Ag “H” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)
a partir del paso 1b.
17
IV.2 PROCEDIMIENTO COMUN PARA TODOS LOS ANTIGENOS
BACTERIANOS.
MEDIOS DE CULTIVO:
1 Medios para prueba de esterilidad bacteriana: Tubos de 16 x 150 mm
con 12 mL de tioglicolato fluido.
1 Medios para prueba de esterilidad micótica: Tubos de 16 x 150 mm con
7 mL de agar Sabouraud inclinados.
1 Medios para prueba de viabilidad: Tubos de 16 x 150 mm con 7 mL de
medio.
ANTIGENO MEDIO PARA PRUEBA DE

VIABILIDAD
B. abortus Agar triptosa inclinado
E. coli Agar BHI inclinado
Sh. dysenteriae Agar BHI inclinado
Salmonella 9,12,d,Vi Agar Veal-infusion inclinado
(serotipo Typhi) Ag “O”
Salmonella 9,12,d,Vi Agar Veal-infusion inclinado
(serotipo Typhi) Ag “H”
MATERIAL
1 Equipo de succión estéril. Constituido por: Frasco de centrífuga de 250
mL, tapón del No. 6 bihoradado, tubo de vidrio de 10 cm con filtro de
gasa, tubo de vidrio de 12 cm en ángulo de 90° con trampa de aire, tubo
de vidrio de 35 cm con un extremo angosto, tres perlas de vidrio y tramo
de manguera para vacío de 50 cm.
2 Frascos tipo “vial” de 50 mL con tapón estériles.
1 Bulbo de hule para pipetas de 10 mL (propipeta).
1 Tapón de hule del No. 6 estéril.
1 Asa bacteriológica.
2 Mecheros.
1 Juego de colorantes para Gram.
1 Termómetro de 0 a 100°C.
1 Charola de peltre para desechar material contaminado.
4 Portaobjetos.
Microscopio.
Centrífuga con cabezal para frascos de 250 mL.
Nefelómetro Klett Summerson con filtro verde y celdas.
Incubadora a 37 °C.
Baño de agua de temperatura controlada.
25 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril.
18
100 mL SSI fenolada o SSI formolada: Es SSI estéril, adicionada de fenol al 0.5%
ó de formol al 0.3%.
TÉCNICA
1a. Antígenos de E. coli, Sh. dysenteriae, B. abortus y Ag “O” de
Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi):
Cosecha: Por medio del equipo de succión y empleando un vacío leve
extraer la suspensión bacteriana.
Sustituir el sistema de succión por un tapón de hule sin horadar y proceder
a llevar a cabo la inactivación.
Inactivación: Colocar el frasco de centrífuga en el baño de agua a: 55-

56°C, 2 h para B. abortus, E. coli y Sh. dysenteriae y baño de agua
hirviente, 2.5 h para el antígeno “O” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo
Typhi); agitando de vez en cuando.
Prueba de viabilidad: Sembrar 0.2 mL de la suspensión calentada en el

medio de cultivo indicado para cada bacteria, extendiendo el inóculo
perfectamente en toda la superficie e incubar a 37°C, 48-72 h. Al cabo de
este tiempo no debe haber desarrollo de colonias, en caso contrario
deberá hacerse un tinción de Gram y observar si no se trata de
contaminación y si no es así , calentar por 1 hora más ya que los
microorganismos están todavía vivos. Después del segundo calentamiento
repetir la prueba de viabilidad.
Continuar con el paso No. 2.
1b. Antígeno “H” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi):

Inactivación: Adicionar un volumen igual al que ocupa el cultivo de SSI
formolada al 0.6% y dejar a temperatura ambiente durante varios días.
Prueba de viabilidad: Para el 4° ó 5° día probar si ya se destruyó la

viabilidad de los microorganismos, sembrando 0.2 mL de la suspensión
perfectamente agitada en un tubo con agar Veal-infusion inclinado,
extendiendo el inóculo perfectamente en toda la superficie del medio e
incubar a 37°C, 24-48 h. Si todavía hay crecimiento deberá hacerse un
tinción de Gram y observar si no se trata de contaminación, y si no es así,
se dejar transcurrir 3 a 4 días más y se repite la prueba de viabilidad. La
prueba es satisfactoria cuando ya no se obtiene desarrollo.
Cosecha: dejar reposar la mezcla de un día para otro y evitando que se

resuspenda, eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante utilizando
un sifón estéril y decantar el sedimento a 1 ó 2 frascos de centrífuga de
250 mL, estériles.
2. Centrifugar la suspensión 30 min a 3000 r.p.m., eliminar el sobrenadante y

resuspender el paquete celular en aproximadamente. 20-25 mL de SSI
fenolada al 0.5% estéril (para B. abortus, E. coli y Sh. dysenteriae) ó SSI
19
formolada al 0.3% estéril (para los antígenos “O” y “H” de Salmonella
9,12,d,Vi (serotipo Typhi)).
3. Preparar una dilución 1:10 de la suspensión directamente en la celda del
nefelómetro y determinar las unidades Klett en el aparato, leyendo contra
SSI fenolada o formolada como blanco. Tomando en cuenta el factor de
dilución e interpolando en la curva de Mc Farland (ver anexo I.C)
determinar la concentración de bacterias/mL. La lectura también se puede
realizar en un colorímetro, leyendo a 540 nm, en donde 0.3 unidades de
absorbancia equivalen a 1 X 109 microorganismos/mL.
4. Ajustar la concentración de una alícuota de la suspensión a 109
microorganismos/mL adicionando la cantidad necesaria de SSI fenolada o
formolada, para obtener el volumen suficiente para realizar el esquema de
inmunización (15 mL aprox.). Aplicar la siguiente fórmula:
Concentración que se tiene - 1 = Volumen de diluyente que se debe agregar

Concentración que se desea por cada mL de la suspensión concentrada
5. Envasar en frascos “vial” tanto la suspensión concentrada como la diluida

y rotular adecuadamente.
6. Realizar la prueba de esterilidad micótica y bacteriana a cada producto
sembrando 0.1 mL de las suspensiones en los tubos de tioglicolato y
Sabouraud, incubando los primeros a 32-35°C, 48 h y los segundos a
temperatura ambiente por lo menos una semana. Si el resultado de la
prueba es satisfactorio, las suspensiones se conservan en refrigeración
hasta su uso.

20
PRÁCTICA No. 2
INMUNIZACIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO
GENERALIDADES
Se entiende por inmunización al mecanismo por el cual se estimula a un individuo
inmunocompetente para que genere la respuesta inmune, la cual se caracteriza
por la formación de anticuerpos (respuesta humoral) y linfocitos T sensibilizados
(respuesta celular) específicos para el agente inductor.
La respuesta inmune celular es mediada por la actividad de los linfocitos T

sensibilizados, que mediante la producción de muchos factores llamados citocinas
concertan las actividades de otros tipos celulares como los macrófagos y los
polimorfonucleares.
La respuesta inmune humoral es mediada por los anticuerpos (Ac) o

inmunoglobulinas (Igs), los cuales son glucoproteínas presentes principalmente en
el plasma y en menor cantidad en los demás líquidos corporales tales como saliva,
lágrimas, sudor, líquido seminal, leche, líquido cefalorraquídeo, jugo intestinal,
secreciones respiratorias y genitourinarias.
Los anticuerpos son producidos y secretados por las células plasmáticas, las
cuales son el resultado de la maduración y diferenciación de los linfocitos B que
han sido estimulados por el antígeno.
Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, las cuales
tienen diferentes funciones efectoras durante la respuesta inmune. Su estructura
básica está constituida por cuatro cadenas polipeptídicas unidas por puentes
disulfuro (Fig. 1). Dos de las cadenas se denominan ligeras o L y las otras dos
pesadas o H.
Las inmunoglobulinas se unen específicamente al Ag que estimuló su formación.

Una unidad básica de inmunoglobulina tiene 2 sitios de unión al Ag o paratopo,
que son conformados por ambas cadenas (H y L).
Sitios de unión S
H
al Ag S
S
S
S
(Paratopo) H
S
Figura No. 1.1 Estructura de la Unidad Básica de las Inmunoglobulinas

Los inmunoglobulinas existen como monómeros (IgG, IgA, IgD e IgE) o como
polímeros (IgA secretoria e IgM) de la unidad básica.
21
Como se mencionó anteriormente, la respuesta inmune de un animal puede ser
totalmente un fenómeno natural o puede ser inducida artificialmente mediante la
inoculación del inmunógeno.
Los factores que hay que tomar en cuenta para lograr con éxito una inmunización
son:
• Dosis
• Frecuencia de dosis
• Vía de inoculación
• Condiciones generales del animal inmunizado: edad, sexo, alimentación, estado
de salud, etc.
• Uso de adyuvantes
Estos factores se conjugan e interrelacionan, y en conjunto determinan un

esquema de inmunización.
La dosis y la frecuencia de dosis son factores que hay que tomar en cuenta para
evitar caer en el fenómeno de tolerancia inmunológica. Este se refiere al hecho
de que a dosis subóptimas y supraóptimas del inmunógeno, el animal puede ya no
responder a la estimulación por el inmunógeno aplicado.
La vía de inoculación es determinante para el tipo de respuesta que se obtiene.

Aunque la mayoría de las veces ambos tipos de respuesta (humoral y celular) se
presentan, nosotros podemos favorecer una u otra de las respuestas según la vía
de administración que utilicemos. Así, la vía endovenosa es excelente para
obtener respuesta humoral y pésima para obtener respuesta celular. Y por el
contrario, la vía intradérmica es excelente para obtener respuesta celular y mala
para obtener respuesta de anticuerpos. Dentro de estos extremos, las otras vías
pueden favorecer a una u otra de las respuestas en menor o mayor grado.
También la vía de inmunización utilizada puede influir en la velocidad con la que
se de la respuesta.
Existen diferentes vía de administración de inmunógenos, entre ellas se pueden

mencionar: endovenosa o intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutánea,
intraperitoneal, que son de las más frecuentes en la inmunización de animales de
laboratorio, aunque en estudios especiales también se han usado otras como la
intranasal, intraganglionar, intracerebral, etc.
En el caso de inmunización a humanos solo se utilizan las vías: intramuscular,

intradérmica, subcutánea y oral.
En cuanto a la especie que se inmuniza es importante debido a que un esquema

de inmunización se diseña para una especie dada, no existe un esquema
universal para todas las especies, debido principalmente a que cada una responde
de diferente forma e intensidad, por tanto los factores dosis, frecuencia de dosis,
vía de administración y uso o no de adyuvantes dependerán del animal que se
inmuniza.
22
La edad, sexo, alimentación y estado de salud del animal inmunizado, también
son factores determinantes para lograr la inmunización, debido a que estos
influyen ya sea en la madurez, interrelaciones hormonales, capacidad y
competencia del sistema inmune.
Los adyuvantes se consideran potenciadores de la respuesta inmune, existen los

de uso veterinario como el adyuvante completo e incompleto de Freund, los
liposomas, los lipopolisacáridos bacterianos (LPS), el alumbre, el alginato de
calcio, la tapioca, entre otros.
También los hay que se utilizan en la inmunización de humanos (en las vacunas)
como el AlPO4, Al(OH)3, Mg(OH)2.
La inducción artificial de la respuesta inmune tiene muchas aplicaciones, entre

ellas se pueden mencionar:
• Las vacunaciones, que se practican tanto en el ser humano como en animales.

• Preparación de sueros hiperinmunes de uso terapéutico.
• Preparación de sueros inmunes utilizados como reactivos biológicos para uso
diagnóstico.
• Preparación de sueros inmunes utilizados como reactivos en Química Legal.
• Preparación de sueros inmunes utilizados como reactivos en análisis de
alimentos.
• Preparación de sueros inmunes utilizados en diferentes campos de la
investigación.
En esta unidad se describen los esquemas de inmunización para obtener los

sueros inmunes en conejos:
23
ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN
MATERIAL COMUN PARA TODOS LOS ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN

1 Jeringa hipodérmica de 3 mL con aguja No. 22 estéril
1 Tubo de ensayo de 12 X 100 mm
2 Tubos de centrífuga de 50 mL de plástico
1 Pipeta de 1 mL (1/10)
1 Pipeta de 10 mL (1/10) con bulbo
1 Probeta graduada de 100 mL
1 Frasco tipo “vial” de 30 mL
1 Bulbo de hule
1 Aplicador de madera
Centrífuga con cabezal para tubos de 50 mL
Tabla para sujetar conejos
1 Conejo de por lo menos 2.5 Kg de peso

0.3 mL Solución al 10% de etilmercuritiosalicilato de sodio (timerosal) o azida al
10%.
2.1 SUEROS ANTIESPECIE

Antihumano, anticaballo, antibovino, antiperro, antipollo, etc.
MATERIAL ESPECÍFICO
Extracto de tejido muscular o suero estéril
2 mL Adyuvante completo de Freund
DÍA INÓCULO VÍA DE

ADMINISTRACIÓN
1 0.5 mL de suero o extracto intramuscular
0.5 mL de adyuvante completo de Freund
8 1.0 mL de suero o extracto intramuscular
1.0 mL de adyuvante completo de Freund
15 0.2 mL de suero o extracto diluido 1:10 endovenoso
18 0.2 mL de suero o extracto concentrado endovenoso
25 a 27 SANGRIA DE PRUEBA
24
2.2 SUEROS ANTI-PROTEINAS PURIFICADAS
Anti-albúmina sérica humana y anti-γ globulina humana.
Soluciones de proteínas purificadas estériles
1 mL Adyuvante completo de Freund
1 mL Adyuvante incompleto de Freund

ADMINISTRACIÓN
1 1.0 mL de proteína de 5 mg/mL Intradérmica o subcutánea
1.0 mL de adyuvante completo de Freund en sitios múltiples.
15 1.0 mL de proteína de 5 mg/mL Intradérmica o subcutánea
1.0 mL de adyuvante incompleto de Freund en sitios múltiples.
30 0.25 mL de proteína (1 mg/mL) endovenoso
37 SANGRIA DE PRUEBA
2.3 SUERO ANTI-ERITROCITOS DE CARNERO

(Amboceptor hemolítico anti-carnero):
10 mL Suspensiones de eritrocitos de carnero al 10%.

ADMINISTRACIÓN
1 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso
2.4 SUEROS ANTIBACTERIANOS:
25
Anti-B. abortus, anti-E. coli, anti-Sh. dysenteriae y anti-Salmonella
9,12,d,Vi (serotipo Typhi) (O y H).
6.5 mL Antígenos bacterianos de concentración 1 X 109 µos/mL

ADMINISTRACIÓN
1 0.5 mL de suspensión bacteriana endovenoso
1 X 109 µos/mL
1 X 109 µos/mL
1 X 109 µos/mL
1 X 109 µos/mL
Las inyecciones intramusculares se hacen en el cojincillo plantar o en el músculo y

las endovenosas en las venas marginales de las orejas, comenzando a inyectar
por la punta de las orejas y avanzando hacia la base.
SANGRÍA DE PRUEBA
1. Al término del esquema de inmunización, dejar descansar al animal
durante 5 a 7 días y proceder a realizar la sangría de prueba.
2. Tomar unos 2 mL de sangre por punción de una de las venas marginales
de la oreja.
3. Colocar la sangre en un tubo de ensayo de 12 X 100 mm y dejar coagular.
4. Separar el suero y en él se investiga la presencia de anticuerpos.
Sueros anti-especie y anti-proteínas purificadas: Por el método de la
doble difusión de Ouchterlony. Título deseado ≥ 1:8.
Sueros antibacterianos: Por el método de aglutinación en placa. Título
deseado: ≥ 1:3200.
Sueros anti-eritrocitos de carnero (hemolisina): Por el método de
citólisis. Título deseado: ≥ 5 000 Unidades hemolíticas /mL.
SANGRÍA DE COSECHA
1. Si el resultado de la prueba es satisfactorio, proceder a la sangría de
cosecha, para ello se extraer de 50 a 60 mL de sangre por punción
cardiaca.
2. Colocar la sangre en tubos de centrífuga de 50 mL y dejar coagular.
3. Separar el coagulo de las paredes del tubo mediante un aplicador de
madera y centrifugara 300 rpm durante 30 min.
4. Mediante una pipeta con bulbo, separar cuidadosamente el suero y
colocar en una probeta para determinar el volumen obtenido. NOTA: Si es
necesario, volver a centrifugar para clarificar completamente el suero.
26
5. Adicionar el conservador:
Para sueros antiespecie, anti-proteínas purificadas y antibacterianos:
Solución de timerosal al 10%, a tener una concentración final de 1:10,000
(0.1 mL por cada 100 mL de suero) o azida de sodio al 10% (1.0 mL por
cada 100 mL de suero).
Para sueros anti-eritrocitos de carnero: Glicerina Q.P. vol/vol. (Considerar
que el título final queda diluido 1:2).
6. Envasar en frasco tipo vial y rotular con:
Nombre del producto

Fecha de obtención
Título de Ac obtenido
Volumen
Conservador utilizado
REFUERZOS
1. Si los resultados de la titulación de Ac son negativos o no satisfactorios, es
necesario aplicar refuerzos.
Para sueros anti-especie: Administrar 2 dosis más de suero o extracto
concentrado, de 3 mL cada uno, por vía intraperitoneal a intervalos de 1
semana entre la primera y la segunda.
Para sueros anti-proteínas purificadas: Inocular 2 dosis de 1.0 mL de la
solución de proteína de 1 mg/mL vía intraperitoneal a intervalos de 1
semana entre la primera y la segunda.
Para sueros antibacterianos: Aplicar 1 dosis de 3.0 mL de antígeno por
vía endovenosa.
Para sueros anti-eritrocitos de carnero: Aplicar 2 dosis más de 1.0 mL
de eritrocitos al 10% por Kg de peso con intervalo de 3 días, o bien dos
dosis de 1.0 mL de una suspensión de Pasteurella cuniculicida de 1 X 109
microorganismos/mL inactivados por calentamiento a 56º C durante 60
min o mejor aún en autoclave a vapor fluyente ya que se trata de una
antígeno termoresistente.
2. Dejar transcurrir de 4 a 5 días y se repite la sangría de prueba.
3. Si el título de anticuerpos ya es satisfactorio se procede a la sangría de
cosecha, pero si no se observa ningún aumento en el título el animal se
desecha.

27
UNIDAD 2
INTERACCIONES ANTÍGENO - ANTICUERPO (Ag-Ac).
INMUNOPRECIPITACIÓN
GENERALIDADES
Los antígenos (Ag) pueden reaccionar tanto in vivo como in vitro con los
anticuerpos (Ac) específicos. No toda la molécula de antígeno reacciona con toda
la molécula de anticuerpo, sino que estas interacciones se dan entre los sitios
activos de ambas moléculas. Para el antígeno, estos sitios activos se denominan
determinantes antigénicos o epítopos y para el anticuerpo se llaman sitios
activos de anticuerpo o paratopos. Por tanto, una reacción Ag-Ac implica la
interacción epítopos-paratopos.
El número de epítopos presentes en los antígenos es variable, y éste determina la

valencia del Ag. Generalmente una molécula de Ag tiene varios epítopos por lo
que es multivalente.
En el caso de los anticuerpos, los de clase IgG, IgA, IgD e IgE tienen solo 2
paratopos (bivalentes) y la IgM e IgAs (IgA secretoria) tienen 10 y 4 paratopos
respectivamente (deca y tetravalentes).
Debido a la multivalencia del Ag y a la por lo menos bivalencia del Ac, cuando se

da la reacción Ag-Ac se forman agregados moleculares.
El tipo de enlaces o fuerzas que participan en la unión de los epítopos y paratopos

son débiles no covalentes y entre ellas están: Puentes de hidrógeno,
electrostáticas débiles (no iónicas), de van der Waals e hidrofóbicas. Por tanto la
reacción es reversible y por tanto es fácil disociar un complejo ya formado.
En la interacción “in vitro” de un antígeno con un anticuerpo se distinguen dos

etapas: la reacción primaria, no observable, y la reacción secundaria,
caracterizada por la aparición de un fenómeno visible.
“In vivo” la reacción Ag-Ac puede generar reacciones terciarias, como es el caso
de la necrosis en la reacción de Arthus, los fenómenos vasógenos de la anafilaxia
por la liberación de histamina, etc, los cuales son fenómenos biológicos
colaterales.
En la reacción primaria se unen el Ag y el Ac dando lugar a la formación de

complejos iniciales que posteriormente, en la reacción secundaria, se agregan
para dar lugar a fenómenos visibles cuyas características dependen en gran parte
de las características físicas del antígeno, pero también de la clase de
inmunoglobulina que participa en la reacción y de la concentración de Ag y Ac.
De acuerdo a la naturaleza de los diferentes fenómenos que se pueden presentar

como consecuencia de la reacción permite clasificar a las interacciones Ag-Ac en:
28
• Reacciones de precipitación.
• Reacciones de aglutinación.
• Reacciones de floculación.
• Reacciones de neutralización.
• Reacciones de opsonización.
• Reacciones de citólisis.
• Reacciones de fijación de complemento.
• Reacciones con reactivos marcados.
En este bloque de prácticas nos referiremos a las reacciones de precipitación y a

las metodologías que se han diseñado para llevarlas a cabo.
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN
Cuando se utiliza un antígeno en solución, como lisados bacterianos, toxinas,

extractos de tejidos heterólogos, extractos vegetales, etc, al estar en presencia de
sus Ac específicos forman complejos Ag-Ac que posteriormente se insolubilizan,
dando como resultado una reacción de PRECIPITACIÓN. Esta propiedad tiene
muchas aplicaciones para la investigación y valoración de Ag y Ac.
Ag + Ac Ag - Ac (PRECIPITADO)
Figura 2.1 Formación del inmunoprecipitado.
DEFINICIÓN: Cuando se mezclan en cantidades adecuadas un Ag soluble con

su Ac correspondiente (principalmente de clase IgG) se forma un
inmunoprecipitado.
MECANISMO: La formación del inmunoprecipitado se lleva a cabo en dos etapas:

1ª. ETAPA: Reconocimiento y recombinación de Ag y Ac.- en ella los Ag y Ac
se unen rápidamente (casi instantáneamente) formando complejos primarios, que
aún siguen siendo solubles. Dentro de ciertos límites, esta 1ª. etapa casi no se ve
influenciada por factores tales como la temperatura, pH, fuerza iónica y la
concentración de los reactantes.
29
COMPLEJOS PRIMARIOS
Figura 2.2 1ª. Etapa: Reconocimiento y recombinación
2ª. Etapa: AGREGACIÓN: Los complejos primarios se van agregando, aumenta el

peso molecular y entonces precipitan, formándose un enrejado tipo cristal en
donde cada molécula de Ag y Ac ocupa un lugar determinado. Esta 2ª etapa es
mas tardada puede durar de minutos a horas y es muy dependiente de la
temperatura, pH, fuerza iónica y concentración de Ag y Ac.
COMPLEJOS PRIMARIOS PRECIPITADO
Figura 2.3 2ª. Etapa: Agregación
Puede ocurrir solo la fase 1ª y no la 2ª, debido a variaciones cuantitativas. La fase

2ª solo se presenta cuando la concentración de Ag y Ac son equivalentes.
FACTORES QUE AFECTAN LA REACCIÓN:

• TEMPERATURA: Acelera la reacción debido a un incremento de la difusión y el
movimiento de las moléculas. Se considera que esto es válido hasta los 56°C,
ya que a mayor temperatura comienza a haber desnaturalización. La mayoría
de las reacciones Ag-Ac se trabajan a temperatura ambiente, pero también se
tienen algunas técnicas que usan 37°C para igualar condiciones fisiológicas y
otras a 45°C o 56°C como es el caso de la titulación de toxinas. Las
temperaturas frías (4-6°C) se han utilizado en investigación en estudios
inmunoquímicos, cuando se requiere minimizar lo más posible la
desnaturalización y que los resultados sean más estequiométricos y
cuantitativos.
• pH: De este factor depende el estado iónico de grupos importantes que

participan en la interacción, como son los radicales amino (-NH3) y carboxilo
(-COO). Aunque la reacción Ag-Ac la podemos observar en un intervalo amplio
de pH, se considera que el óptimo está entre 6.8 a 8.6.
• Fuerza iónica (µ): Corresponde a la concentración de iones presentes en el

medio de reacción (electrolitos) los cuales son necesarios para disminuir las
cargas de repulsión que impiden que se formen los agregados. Se requieren µ
bajas (intervalo óptimo 0.01 – 0.1) para que el máximo número de grupos
30
iónicos se aprovechen para el enlace del Ag y el Ac, a altas µ los grupos iónicos
son neutralizados y por tanto se reduce la afinidad.
• Concentración de Ag y Ac: La concentración de Ag y Ac deben ser

equivalentes para que la precipitación pueda llevarse a cabo. Si hay exceso de
uno de ellos se presenta el EFECTO O FENÓMENO DE ZONA:
Exceso de Ac:
En ambos casos
solo se forman
complejos primarios
No hay precipitación
Exceso de Ag:
Concentración Formación de precipitado

equivalente de Ag y Ac
Figura 2.4 Fenómeno de Zona: Inhibición de la formación del precipitado

por efecto de la concentración de Ag y Ac.
El efecto de la concentración puede ser observado si se hacen reaccionar

cantidades variables del Ag con una concentración constante de Ac y graficando:
[Ac = cte]
pp
Exceso de Ac Zona de Exceso de Ag

PREZONA EQUIVALENCIA POSTZONA
31
Figura 2.5 Curva de precipitación cuantitativa
Debe considerarse que la formación de agregados es una consecuencia de la

bivalencia de los Ac y de la multivalencia de los Ag, por lo tanto, los Ag o haptenos
simples que sólo tengan un determinante antigénico NO dan reacciones de
precipitación; así mismo, el Ag y el Ac deben estar en proporciones adecuadas, ya
que el exceso de cualquiera de ellos lleva a la solubilidad del agregado y la no
formación del precipitado.
El efecto de “no precipitación” producido por falta de concentraciones equivalentes

de antígeno o anticuerpo (fenómeno de zona) puede ser disminuido o evitado
haciendo diluciones seriadas del reactivo desconocido (generalmente el Ag), o
realizando la reacción en el seno de un gel de agar por difusión del Ag y/o el Ac.
Las reacciones de precipitación pueden ser cualitativas, semicuantitativas o

cuantitativas y se pueden realizar en medio líquido y semisólido.
Hay varias técnicas para realizar este tipo de reacciones:

• La simple mezcla del Ag y del Ac en tubo de ensayo o capilar
• La formación de capas estratificadas (técnica del anillo de interfase o Ascoli)
• La difusión simple unidimensional en gel de agar (técnica de Oudin)
• La doble difusión unidimensional en agar (modificación a la técnica de Oudin)
• La difusión radial simple en agar (RID) (técnica de Mancini, Carbonara y
Hermans)
• La doble difusión radial en gel de agar (DDR) (técnica de Ouchterlony)
Y las técnicas que combinan difusión en geles de agar con procedimientos

electroforéticos como:
• La inmunoelectroforesis (IEF) (técnica de Grabar y Williams)
• La electroinmunodifusión (EID) (técnica de Laurell).
• La electroforesis bidimensional
32
PRÁCTICA No. 3
CURVA DE PRECIPITACIÓN CUANTITATIVA EN CAPILAR
MARCO TEÓRICO
La precipitación en medio líquido se puede realizar en tubos de ensayo o
capilares, mezclando el Ag soluble con su Ac específico y la cantidad de
precipitado formado varía según la proporción de los reactivos. Si se dispone una
serie de tubos conteniendo una cantidad constante de anticuerpo y cantidades
crecientes del Ag soluble, se puede observarse que al ir aumentando la cantidad
de éste el precipitado formado alcanza un máximo y posteriormente comienza a
disminuir aunque la cantidad de Ag aumente.
De manera semicuantitativa se puede estimar la cantidad de precipitado formado
expresándolo en milímetros lineales. Si los resultados se grafican, colocando en el
eje de las abscisas la cantidad de Ag agregado y en el de las ordenadas la
cantidad de precipitado (en mm), se obtiene una curva, generalmente en forma de
campana, que se puede dividir en tres zonas:
A. Zona de exceso de anticuerpo: Las moléculas de Ag están saturadas y no
hay agregación, en esta zona el sobrenadante contiene Ac libre.
B. Zona de equivalencia: el precipitado es máximo, el sobrenadante no
contiene ni Ag ni Ac libres.
C. Zona de exceso de antígeno: Solo hay formación de complejos primarios
pero no agregados por falta de Ac; el sobrenadante contiene Ag libre.
[Ac] = cte
pp
A. PREZONA (Exceso de Ac)

B
B. ZONA DE EQUIVALENCIA
A C
C. POSTZONA (Exceso de Ag)
[Ag]
Un análisis cuantitativo se puede realizar determinando el N proteico en el

precipitado cuando el Ag es un polisacárido. Si el antígeno es proteico pero tiene
un grupo químico que sirve como marca, como el DNP-ASB (dinitrofenol-albúmina
sérica bovina) se puede determinar la cantidad de Ac en el precipitado por lectura
espectrofotométrica a 360 nm para el Ag y a 280 nm para la cantidad total de
proteína. La cantidad de Ac se obtiene mediante la siguiente operación:
Cant. de proteína – Cant. de Ag = Cant. de Ac.
Sí el Ag es proteico y no tiene alguna marca, por ejemplo ovoalbúmina, la cantidad
de Ac en el precipitado se puede determinar haciendo los cálculos con valores
obtenidos en la zona de equivalencia:
Proteína en pp – Ag añadido = Ac en pp.
MATERIAL
12 Tubos capilares de 100 x 1.6 mm
33
10 Tubos de ensayo de 12 x 75 mm
1 Gradilla par tubos de ensaye
1 Gradilla de plastilina para capilares
Papel absorbente
Lápiz graso o marcador indeleble
1 mL Solución de Ag de concentración conocida: Albúmina sérica humana

(ASH) 1 000 mg/dl
0.6 mL Ac específico: Suero anti-ASH
5 mL Solución salina isotónica (SSI)
TÉCNICA
1. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador.
2. En los tubos de ensayo debidamente rotulados (2 a 10), realizar diluciones
seriadas (2X) de la solución de antígeno (ASH) con SSI: 1:2, 1:4, 1:8,
1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 y 1:512. Para ello:
• Colocar 0.5 mL de SSI en cada uno de los tubos
• Al tubo 2 agregar 0.5 mL de la solución de ASH, mezclar con la misma
pipeta (dilución 1:2).
• Pasar 0.5 mL del tubo al tubo 3. Mezclar. (dilución 1:4).
• Repetir el procedimiento hasta el tubo 10 (diluciones 1:8 a 1:512)
3. Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de antisuero
(anti-ASH) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y
manteniendo el dedo índice en el extremo del capilar, limpiar la parte
externa con papel absorbente.
4. Quitando el dedo índice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad
la solución de antígeno sin diluir (1:1) de tal manera que el volumen total
llegue hasta la segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte
externa del capilar con papel absorbente.
5. Tapando con el dedo índice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las
soluciones por inversiones repetidas o moviendo el líquido de un lado al
otro y rotando el capilar simultáneamente varias veces.
6. Con el dedo índice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el
líquido dentro del capilar, colocando el dedo índice en un extremo.
7. Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos
mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalización de
los reactivos por contacto con ésta.
8. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para cada uno de los
capilares correspondientes a las otras diluciones de Ag (de 1:2 a 1:512).
9. Incluir los siguientes testigos:
a) Un capilar llenado hasta la segunda marca con solución de Ag sin diluir.
b) Un capilar llenado hasta la segunda marca con antisuero.
10. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente ó 48 h en refrigeración.
11. Medir la cantidad de precipitado en milímetros en cada capilar. Si el
precipitado es difuso o está fraccionado, centrifugar los capilares 1 min a
34
1000 rpm colocándolos dentro de los tubos de ensayo de 13 X 100 mm o
en una centrífuga para hematocrito.
NOTA: Cuidar que al sacar cada uno de los capilares de la plastilina
queden tapados con la misma en su parte inferior.
RESULTADOS
Con los datos obtenidos complementar la siguiente tabla y construir la curva de
precipitación, graficando concentración de Ag (abscisas) contra la cantidad de
precipitado formado, expresado en mm (ordenadas).
CAPILAR DILUCION DEL Ag [Ag] mg/dl PRECIPITACIÓN

(mm)
1 1:1
2 1:2
3 1:4
4 1:8
5 1:16
6 1:32
7 1:64
8 1:128
9 1:256
10 1:512
11 Control de Ag 1.1
12 Control de Ac 0
[ASH] = 1000 mg/dl

35
PRÁCTICA No. 4
MEZCLA DE ANTÍGENO Y ANTICUERPO
Prueba de Identidad a Sueros de Uso Terapéutico
Determinación del Origen de Manchas de Sangre
MARCO TEÓRICO
La precipitación por simple mezcla de Ag y Ac puede llevarse a cabo en capilar o
en tubos de ensayo, cuando se utilizan estos últimos suele acelerarse la reacción
con temperatura (50 – 55° C). Las ventajas que ofrece la metodología es la
economía, la facilidad de interpretación y el poco equipo requerido, y la desventaja
principal es el riesgo de caer fácilmente en fenómeno de zona cuando no se
prueban diluciones.
Entre las aplicaciones de esta técnica se pueden mencionar las pruebas de

peritaje para la identificación de manchas de sangre y de semen, así como en
alimentos en la determinación de la especie de que proceden las carnes y
derivados, así como en la investigación del origen de sueros inmunes y para
estudiar las relaciones filogenéticas de las especies y la zoofilia y antropofilia de
vectores.
Esta técnica será ejemplificada con la investigación del origen de muestras de

antitoxinas, determinación que se realiza como prueba de identidad a sueros
inmunes, o con la identificación del origen de manchas de sangre.
MATERIAL:
2ó4 Tubos capilares 1 x 9 mm
1 Gradilla de plastilina
Papel absorbente
100 µl Muestras de antitoxina tetánica o papel filtro con manchas de sangre.

50 µl De cada suero antiespecie: anti-equino, anti-humano, anti-bovino, etc.
TÉCNICA:
Para la prueba de identidad de sueros de uso terapéutico llevar a cabo todos los
pasos incluyendo los incisos (a) del paso 1 y 8. Para la identificación de manchas
de sangre también realizar todos los pasos pero ahora incluir los incisos (b) del
paso 1 y 8.
1a. Si es necesario, eliminar partículas en suspensión de los sueros y las
muestras por centrifugación a 2000 rpm, 2 min.
1b. Colocar pequeños fragmentos de la mancha de sangre en un tubo de
ensayo y extraer con 2 mL de solución salina isotónica.
2. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador.
3. Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de suero
(anti-humano) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y
manteniendo el dedo índice en el extremo del capilar, limpiar la parte
externa con papel absorbente para no contaminar la muestra problema.
36
4. Quitando el dedo índice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad
un volumen igual de la muestra de antitoxina problema o del extracto de la
mancha de sangre, de tal manera que el volumen total llegue hasta la
segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte externa del
capilar con papel absorbente.
5. Tapando con el dedo índice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las
soluciones por inversiones repetidas o moviendo el líquido de un lado al
otro y rotando el capilar simultáneamente varias veces.
6. Con el dedo índice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el
líquido dentro del capilar y, colocando el dedo índice en un extremo.
7. Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos
mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalización de
los reactivos por contacto con ésta.
8a. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para el otro capilar pero
ahora utilizar como Ac el suero anti-equino.
8b. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para los otros capilares pero
ahora utilizando los otros sueros antiespecie.
9. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente ó 48 h en refrigeración.
RESULTADOS
Leer los resultados observando en cual de los capilares se observa precipitación.
Determinar el origen de la muestra de antitoxina utilizada o la especie de donde
procede la mancha de sangre.

37
PRÁCTICA No. 5
DOBLE DIFUSIÓN EN PLACA (OUCHTERLONY)
Identificación de fracciones antigénicas presentes en suero humano
MARCO TEÓRICO
Las macromoléculas pueden difundir libremente a través de geles. Esta difusión
está limitada por la concentración del gel, así como por el peso molecular y
tamaño de las moléculas de Ag y Ac. Empleando soportes que tienen como base
agar disuelto en una solución amortiguadora, los antígenos y/o anticuerpos
pueden migrar y al encontrarse en concentraciones equivalentes, formar el
inmunoprecipitado, evitando así el efecto indeseable del fenómeno de zona. La
velocidad de la difusión de ambas moléculas es directamente proporcional a la
concentración e inversamente proporcional al peso molecular (Ley de Fick). Otros
soportes que pueden ser utilizados son: pectinas, alginatos, poliacrilamida y tiras
de acetato de celulosa gelatinizado.
En la técnica de Ouchterlony, el Ag y el Ac se colocan en pozos hechos en una

placa de gel de agar, a partir de ellos ambos reactivos difunden radialmente y al
encontrase en concentraciones equivalentes forman una o varias bandas de
precipitación dependiendo del número de sistemas Ag-Ac presentes.
Cuando se prueba un Ag constituido por una mezcla de fracciones antigénicas

frente a una mezcla de Ac, se forman varias bandas y cada una corresponde a
una fracción antigénica diferente.
Aumentando el número de perforaciones se pueden probar varios sistemas

simultáneamente y según las formas de las bandas obtenidas se puede
determinar si los antígenos analizados son idénticos (cuando las líneas de
precipitación confluyen), diferentes (cuando las líneas se cruzan) ó relacionados
(cuando las líneas se unen parcialmente) (ver esquema).
Ag Ag Ag Ag Ag Ag
Ac Ac Ac
IDENTIDAD IDENTIDAD NO IDENTIDAD

PARCIAL
Figura 2.6 Patrones de bandas obtenidos en el Ouchterlony
Esta técnica es muy útil para determinar la homogeneidad de antígenos y

anticuerpos purificados, así como para buscar impurezas en un sistema.
MATERIAL
1 Portaobjetos
38
1 Hisopo
1 Nivelador de gota
1 Placa de vidrio
1 Cámara húmeda (caja Petri con papel filtro húmedo)
1 Vaso de precipitado de 250 mL
1 Tripié con tela de alambre
1 Mechero
1 Horadador de 2 mm de diámetro
1 Plantilla de una horadación central y seis periféricas.
5 Capilares
Equipo de succión constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado
tramos de manguera para vacío de 30 cm.
3.5 mL Solución de agar noble al 1.5% en PBS 0.075 M, pH 7.2

2 mL Solución de agar noble al 0.3% en PBS 0.075 M, pH 7.2, para sellar
5 µL Antígenos: Suero humano (SH), Albúmina sérica humana (ASH), IgG

humana purificada, suero bovino (SB), suero murino.
5 µL Anticuerpo: Suero antihumano,
TÉCNICA
1. Barnizar los portaobjetos lavados y desengrasados con agar al 0.3%
fundido con ayuda del hisopo.
2. Colocar los portaobjetos barnizados sobre una superficie perfectamente
nivelada y verter sobre cada uno el contenido del tubo con agar al 1.5%
fundido (3 mL).
3. Permitir que solidifique el agar a temperatura ambiente.
4. Con el horadador practicar 7 cortes en forma de roseta: uno central y 6
periféricos, usando la plantilla o un papel con el esquema de las
perforaciones debajo del portaobjetos. (ver Fig. 2.7)
1 2
6 3
5 4
Figura 2.7 Disposición de pozos para el Ouchterlony
5. Extraer el gel de agar de los cortes mediante el equipo de succión

haciendo un ligero vacío o con la aguja de una jeringa.
6. Colocar con un capilar en la horadación central suero antihumano hasta
llenar el pocito, sin derramar su contenido.
7. Con capilares individuales tomar cada reactivo biológico, colocar en los
pozos de la periferia ordenados en el sentido de las manecillas del reloj:
en los pozos 1 y 6 suero humano; en el 2 ASH, en el 3 suero bovino, en el
4 suero murino, en el 5 IgG humana purificada.
39
8. Introducir el portaobjetos en la cámara húmeda, cerrarla e incubar de 18 a
24 h a temperatura ambiente ó 48 h a 4° C.
RESULTADOS
Leer los resultados, identificando bandas de identidad, no identidad e identidad
parcial.

40
PRÁCTICA No. 6
INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (RID)
(Mancini, Carbonara y Hermans)
Cuantificación de Albúmina Sérica Humana
MARCO TEÓRICO
Este método se aplica rutinariamente en Inmunología Clínica para la cuantificación
de antígenos, fundamentalmente de las fracciones plasmáticas humanas, como
son la albúmina sérica humana (ASH), las inmunoglobulinas G, A y M, los
componentes C3 Y C4 del complemento, factores de coagulación, etc.
Para llevarlo a cabo se emplea una placa de gel de agar purificado al que se
incorpora el suero específico monovalente para la fracción que se desea
cuantificar. En esta placa se practican horadaciones y en ellas se coloca un
volumen medido con exactitud tanto de un estándar en tres diluciones de
concentración conocida, como de los sueros problema. Al difundirse de manera
radial el Ag en el seno del agar que contiene el anticuerpo se va formando un halo
de precipitación alrededor del pozo donde se colocó el Ag. El diámetro de la zona
de precipitación es directamente proporcional a la concentración del Ag y por lo
tanto los datos obtenidos en las reacciones de precipitación de los estándares
sirven para trazar la curva de calibración de la placa de donde se obtiene la
concentración del Ag presente en los sueros problema. El anticuerpo incorporado
determina la sensibilidad de la placa.
Esta técnica ofrece las ventajas de utilizar poca cantidad de reactivos, sencillez de
manipulación e interpretación, alta sensibilidad y la opción de usar placas
disponibles comercialmente; aunque tiene como desventaja que el tiempo para dar
por terminada la prueba es largo.
MATERIAL
1 Gradilla
1 Matraz Erlenmeyer de 100 mL
1 Tubo de 16 x 100 mm con tapón de hule
1 Pipeta graduada de 1 mL
1 Nivelador de gota
1 Placa de vidrio de 20 x 20 cm
1 Placa de plástico con tapa para RID
1 Horadador de 2 mm de diámetro
1 Micropipeta de 20 µl o capilares calibrados de 5 µl
1 Plantilla de 12 horadaciones para RID
1 Regleta para medición de halos para RID
Puntas para micropipeta
Platina calentadora con agitación
Baño de agua a 56° C.
tramos de manguera para vacío de 30 cm
41
5.0 mL Solución de agar noble al 2.0 % en PBS 0.075 M, pH 7.2
1.0 mL Suero anti-ASH
0.2 mL Suero problema diluido 1:10
10 µl Soluciones estándares de ASH
TÉCNICA
1. Preparar una solución de agar noble al 2% en amortiguador PBS pH 7.2,
fuerza iónica 0.075. Fundir a ebullición en la platina de calentamiento.
2. Pipetear 5 mL de la solución anterior en un tubo de ensayo previamente
calentado en baño de agua a 56° C y mantener el tubo con gel a esa
temperatura un tiempo, hasta que se estabilice.
3. Manteniendo el tubo dentro del baño de agua a 56º C, incorporar al gel de
agar 1.0 mL de suero anti-ASH.
4. Tapar el tubo, sacarlo del baño y mezclar por inversión rápida, pero
suavemente para evitar que se forme espuma.
5. Secar el tubo y verter el agar sobre la placa de plástico para RID, la cual
ha sido previamente calentada “al vapor” sobre la platina caliente cubierta
con un trapo húmedo (para no dañar la placa).
6. Homogeneizar con movimientos de rotación suave y en seguida dejar
solidificar sobre la placa de vidrio perfectamente nivelada.
7. Haciendo uso de una plantilla, practicar 12 horadaciones en el gel con un
perforador de 2 mm de diámetro interno.
8. Depositar en cada pozo 5 µl de las soluciones estándares y problemas. Es
conveniente que los 3 primeros pozos se ocupen con estándares y los
demás con problemas (ver fig. 2.8).
12
11 1
10 2
9 3
8 4 Figura 2.8 Disposición de pozos en la

7
6
5 placa de RID
9. Permitir que difunda el antígeno 48 h.

10. Medir con la regleta para RID el diámetro del halo formado, esta regleta
tiene marcadas líneas convergentes-divergentes, las cuales deben quedar
dispuestas en forma tangente al halo y las marcas en líneas en cruz al
centro. La línea vertical del centro del pozo da la medida del diámetro
elevado al cuadrado (ver figura 2.9).
Lectura: 54.75 mm2

49 64
42
Figura 2.9 Medición de los diámetros de los halos de precipitación.
RESULTADOS
Construir una curva de calibración con los resultados de los estándares de
concentración conocida, graficando concentración (abscisas) vs diámetro al
cuadrado (ordenadas), e interpolar los valores de diámetro al cuadrado de las
muestras problemas. La recta formada no tiene origen en cero. Y el punto en que
corta al eje de las ordenadas es una constante para la placa y depende de tres
factores: el diámetro del pozo en que se colocaron los reactivos, la concentración
del Ac incorporado y la altura del gel.
Obtener la concentración de albúmina de las muestras problema. Es importante

considerar el factor de dilución de los sueros problema al momento de calcular la
concentración de éstos.
Comparar los cantidades obtenidos con los valores de referencia para albúmina en
suero y determinar si se encuentran alterados.

43
Práctica No. 7
INMUNOELECTROFORESIS
Análisis de Proteínas en Suero Humano.
MARCO TEÓRICO
Este método combina la precipitación antígeno-anticuerpo por difusión en gel con
la electroforesis o separación de los antígenos de acuerdo a su carga. En un
primer paso se hace la electroforesis del antígeno en un gel de agarosa purificada
sometiéndolo al paso de una corriente eléctrica, en un pH en el que las proteínas
cargadas positivamente migran hacia el polo negativo y las negativas hacia el
electrodo positivo. Una vez hecha la separación, se corta un canal a lo largo del
gel y se llena con el anticuerpo, dejándolo difundir. En la zona de equivalencia de
cada antígeno se forman líneas de precipitación que aparecen como un patrón de
bandas que permiten analizar cualitativamente las proteínas presentes. En la
clínica, este procedimiento es de gran valor diagnóstico en la identificación de
paraproteinemias, de inmunoglobulinas monoclonales que aparecen en el mieloma
y algunos linfomas, de complejos Ag-Ac, etc. La IEF se usa básicamente como un
método cualitativo, pero puede ser cuantitativo si se corre paralelamente un suero
estándar, o cuantitativo si en estas mismas condiciones se lee en un integrador.
Para tener un grado de resolución mayor de las líneas de precipitación es muy
recomendable teñirlas con cualquier colorante para proteínas.
Es trascendente conocer que el efecto electroendosmótico influye de manera

importante en un corrimiento inmunoelectroforético: como el agar no es una
sustancia absolutamente neutra, el fenómeno secundario de electroendósmosis
acompaña a la electroforesis, y consiste en un movimiento regular de cargas del
líquido que embebe el gel en el sentido opuesto a la corriente eléctrica. Si estas
dos migraciones son iguales la impresión dada es que la sustancia no se ha
movido, en cambio su movilidad será en sentido de la corriente, aunque más
reducida, si sus moléculas están fuertemente cargadas. Las sustancias poco
cargadas son desplazadas por electroendósmosis en sentido contrario al de sus
migración electroforética real. Este efecto es minimizado en un corrimiento
electroforético si se iguala la fuerza iónica del amortiguador del gel y de la cámara
electroforética.
MATERIAL
4 Portaobjetos
2 Caja Petri
1 Hisopo
8 Tiras de papel filtro
1 Horadador de 3 mm
1 Bisturí
tramos de manguera para vacío de 30 cm
Cámara de electroforesis
Fuente de poder
44
10 µl Suero humano
10 µl ASH
10 µl IgG purificada
100 µl Suero anti-humano polivalente
100 µl Suero anti-ASH
100 µl Suero anti-IgG humana
3.5 mL Solución de agarosa al 1.5% en amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2
2.0 mL Solución de agar noble al 0.3% en amortiguador de Veronal-acetato pH
8.2 para sellar
500 mL Amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2
2 µl Solución de azul de bromofenol
TÉCNICA
1. Barnizar los portaobjetos limpios y libres de grasa con la solución de agar
al 0.3% caliente y dejar secar.
2. Colocar los portaobjetos en una superficie completamente horizontal y
vaciar sobre ella con un movimiento rápido aproximadamente 3.5 mL de
agar al 1.5% fundido y caliente, a quedar una capa de agar homogénea de
3 mm de espesor.
3. Dejar solidificar perfectamente el gel de agar sobre la superficie nivelada.
Colocar en el refrigerador 15 min para facilitar la ejecución de los cortes.
4. Perforar el agar de las placas (cortes circulares y canales) utilizando las
plantillas adecuadas al sistema que se va aprobar (ver esquema).
5. Extraer ÚNICAMENTE el agar de las perforaciones circulares mediante un
aplicador con punta rota o una aguja. NO RETIRAR EL AGAR DE LOS
CANALES.
6. Llenar con una micropipeta los pozos circulares de los portaobjetos con 5
µl de los reactivos biológicos correspondientes, según el sistema de
estudio (ver fig. 2.10), evitando derramamientos. Colocar en los pozos en
donde se coloco suero humano 1 a 2 µl de solución de azul de bromofenol
para que sirva como indicador del desplazamiento.
7. Vaciar a los reservorios de la cámara de electroforesis una cantidad de
amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2 que no llegue a tocar el soporte
en donde se colocarán los portaobjetos.
8. Colocar la placa en la cámara de electroforesis con los pozos hacia le polo
negativo. El contacto con el amortiguador se establece mediante tiras de
papel filtro colocadas de manera que quede aproximadamente 1 cm sobre
el gel de agar y 1 cm dentro del amortiguador, evitando las burbujas entre
el papel y el gel, ya que afectaría al paso de la corriente.
9. Conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder y ajustar la
corriente a 90 volts. Cuando la muestra teñida haya avanzado 3 cm
aproximadamente se desconecta la cámara.
10. Retirar los portaobjetos, remover cuidadosamente el agar de los canales y
colocar ahí 80 µl del Ac correspondiente, según el sistema trabajado (ver
fig. 2.10).
45
SISTEMA 1
Pozo 1: Suero humano 1

Canal: Suero anti-humano polivalente
Pozo 2: ASH 2
SISTEMA 2
Pozo 1: Suero humano. 1

Canal: Suero anti-humano polivalente
Pozo 2: IgG purificada 2
SISTEMA 3
Canal A: Suero anti-humano polivalente A
Pozo: Suero humano

Canal B: Suero anti-ASH B
SISTEMA 4
Canal A: Suero anti-humano polivalente A

Pozo: Suero humano
Canal B: Suero anti-IgG B
Figura 2.10 Sistemas utilizados para la IEF
11. Colocar el portaobjetos dentro de una cámara húmeda (caja de Petri con
algodón mojado), taparla e incubar a temperatura ambiente de 18 a 24 h
para que se lleve a cabo la difusión e inmunoprecipitación.
RESULTADOS
Interpretar y reportar los resultados obtenidos, basándose en los patrones de
precipitación reportados en la literatura.

46
UNIDAD 3
REACCIONES DE AGLUTINACIÓN.
GENERALIDADES
Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antígeno especifico y este se
encuentra en estado particulado o forme (p.ej. bacterias, eritrocitos, levaduras,
células) reaccionan formando grumos o aglutinados. Los principios que regulan
esta reacción son los mismos de la reacción de precipitación.
Por lo tanto la aglutinación ocurre en dos fases:

La primera fase es conocida como sensibilización. Proceso mediante el cual el
anticuerpo se une al antígeno de la superficie de la partícula. En esta fase puede
haber activación del complemento, donde se observa lisis. Esta unión del
anticuerpo y el antígeno se logra por la formación de múltiples uniones no
covalentes, como puentes de hidrogeno, electrostáticas, van der Waals e
hidrofóbicas.
La segunda fase es el resultado de la unión de las partículas mediante puentes de

anticuerpo, formando grumos o aglutinados que pueden ser visibles a simple vista
o en microscopio. Para que tenga lugar este fenómeno visible, se deben vencer
las fuerzas de repulsión que mantienen normalmente separadas a las partículas,
lo que se denomina potencial zeta.
Por lo tanto se requieren un numero razonable de enlaces con el anticuerpo entre

las células antes de superar la repulsión mutua.
La IgM es superior a la IgG como aglutinante, debido a su enlace multivalente,

superando la distancia entre partículas, en un medio salino. Mientras que la IgG
requiere de medios proteicos como albúmina, o la utilización de enzimas
proteolíticas como la bromelina para disminuir el potencial zeta y llegar a la
segunda fase de la reacción.
Otro medio para que la IgG pueda aglutinar es la utilización de una

antigammaglobulina humana denominada suero de Coombs, la cual se une a la
IgG unida al Ag formando puentes para poder vencer la distancia entre dos
partículas y aglutinarlas.
Esta reacción se ha utilizado ampliamente debido a la facilidad con que se lleva a

cabo y su alta sensibilidad, comparada con las reacciones de precipitación.
Sin embargo no permite la cuantificación exacta de anticuerpos y los resultados

solo pueden expresarse en función de la dilución mayor del suero donde se
observa el aglutinado, que corresponde al título de anticuerpos en el suero.
Las reacciones de aglutinación pueden ser:

Aglutinación directa o activa, donde los antígenos que intervienen son
componentes naturales de la partícula.
47
Y la aglutinación indirecta o pasiva, en donde los antígenos solubles se adsorben
en forma artificial a partículas que funcionan como soporte, por ejemplo eritrocitos
de carnero, eritrocitos humanos tipo “O”, bacterias como M. tuberculosis,
levaduras como S. cervicieae, S. marcenses o partículas inertes como látex. , Esto
les da la característica de ser particulados y poder aglutinar.
Las reacciones de aglutinación en el laboratorio se pueden realizar de tres

formas: en placa, tubo y en placa de microtitulación.
En la reacción en placa se utiliza un portaobjetos o vidrio plano donde una gota del
anticuerpo y otra del antígeno se mezclan y se observa aglutinación en los 3
minutos siguientes.
En la técnica en tubo también se ponen una gota de anticuerpo y una de antígeno,
se mezclan y centrifugan alrededor de 15-20 segundos y se lee aglutinación.
En la de placa de microtitulación se utiliza una placa con pozas en las que se
depositan de 25 a 50 µl de Ag y Ac, se mezclan y se requiere hasta de dos horas
para leer los resultados.
48
PRÁCTICA No. 8
AGLUTINACIÓN EN PLACA
Titulación de sueros anti-bacterianos
MARCO TEÓRICO
La aglutinación de una bacteria por un suero inmune específico resulta de la
presencia de anticuerpos dirigidos contra los antígenos de la superficie bacteriana,
presentes en la cápsula, flagelos o pared .
Estas reacciones son usadas para estudios de composición de antígenos

bacterianos, para diagnosticar enfermedades infecciosas buscando al agente
causal, y para taxonomía en la clasificación de microorganismos aislados de
diversas fuentes, como exudados, heridas, alimentos, aguas negras, etc.
También el diagnóstico de cuadros infecciosos se puede realizar mediante el

hallazgo de anticuerpos específicos en el suero de los pacientes contra una
determinada bacteria, así como seguir la evolución del proceso en casos en que
tenga correlación el título de anticuerpos con el cuadro clínico; las mejores
aplicaciones de este caso son las reacciones febriles, utilizadas para el
diagnóstico y pronóstico de enfermedades causadas por bacterias de diversas
especies en donde el proceso infeccioso cursa con una elevación marcada en la
temperatura, entre otros síntomas inespecíficos. Estos gérmenes inducen una
respuesta humoral con la producción de anticuerpos que fácilmente se identifican
en el laboratorio utilizando los antígenos específicos, como sucede en la fiebre
tifoidea causada por Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) “O” y “H” (reacción de
Widal), la fiebre paratifoidea causada por S. paratyphi A y B, la fiebre de malta
causada por B. melitensis (reacción de Huddlesson) y la fiebre de tifo causada por
Rickettsia prowaseki (reacción de Weil-Félix), en esta última se utiliza como Ag a
Proteus OX-19, OX-2 u OX-K ya que poseen determinantes antigénicos
glucolípidos comunes con Rickettsia.
Otra aplicación es la titulación de anticuerpos en el suero de animales

inmunizados con antígenos de bacterias (sueros antibacterianos).
Al finalizar la práctica el alumno será capaz de titular sueros inmunes obtenidos de

conejos inmunizados contra antígenos bacterianos como “O” y “H” de Salmonella
9,12,d,Vi (serotipo Typhi), antígenos totales de E. coli, B. abortus o Sh.
dysenteriae.
MATERIAL
4 Tubos de 12 por 100 mm
1 Pipeta de 0.2 mL
1 Pipeta de 1 mL
1 Placa de vidrio de 25 por 20 cm
1 Lámpara de iluminación indirecta
Aplicadores de madera o plástico
Solución salina isotónica
49
1 mL Suero de conejos inmunizados
0.3 mL Suspensiones bacterianas de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) “O” y
“H”, E. coli, B. abortus o Sh. dysenteriae, ajustadas a 15 x 109 /mL
TÉCNICA
1. Dividir la placa de vidrio en cuadros de 4 columnas por 5 filas, con un lápiz
de cera para evitar que las reacciones se mezclen (ver fig. 31).
2. Utilizando la pipeta de 0.2 mL en la primera columna de 5 cuadros
adicionar 0.08 mL en el primer cuadro, en el segundo 0.04 mL, en el
tercero 0.02 mL, en el cuarto 0.01 mL y en el quinto 0.005 mL del suero
problema.
3. Agregar inmediatamente para evitar desecación, una gota de la
suspensión bacteriana previamente homogeneizada a cada cuadro donde
se puso antisuero y mezclar utilizando un aplicador de madera o plástico
perfectamente formando un círculo.
4. Dar a las reacciones movimientos de rotación suave durante 2 minutos y
leer el resultado con iluminación indirecta y sobre fondo obscuro. Las
reacciones positivas dan acúmulos gruesos de bacterias sobre un fondo
claro, mientras que las negativas quedan homogéneas.
Trabajando con los volúmenes anteriores se tienen las siguientes títulos:
0.08 mL de 1:20, 0.04 mL de 1:40, 0.02 mL de 1:80, 0.01 mL de 1:160 y
de 0.005 mL de 1:320.
5. Si con las diluciones anteriores se obtuvieron reacciones positivas significa
que el título de anticuerpos es igual o mayor de 1:320, por lo que se
procede a diluir el suero 1:10 con SSI (0.1 mL de antisuero y 0.9 de SSI) y
en la segunda columna se agregan los volúmenes 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005
mL en los cuadros correspondientes, y se repiten los pasos 3 y 4.
Los títulos correspondientes serían: 0.04 de 1:400, 0.02 de 1:800, 0.01 de
1:1600 y 0.005 de 1:3200. Si todas las reacciones son positivas tendremos
que el título es igual o mayor a1:3200.
7. Se procede a realizar una dilución 1:50 del suero (0.1 mL de antisuero
diluído 1:10 y 0.4 mL de SSI) y se agregan a los cuadros de la tercera
columna 0.02 mL, 0.01 mL y 0.005 mL; dando títulos de 1:4000, 1:8000 y
1:16000 respectivamente, si dan reacciones positivas con la suspensión
bacteriana repitiendo los pasos 3 y 4.
8. Si todas las reacciones anteriores fueron positivas significa que el título de
anticuerpos es igual o mayor de 1:16000 y por tanto procedemos a realizar
la última dilución del suero 1:100 (haciendo una dilución 1:2 de la dilución
1:50 o si se prefiere hacer una dilución 1:10 de la de 1:10 para obtener en
cualquier caso 1:100). Agregando de esta solamente en un cuadro de la
cuarta columna la cantidad de 0.005 que corresponde a un título ≥
1:32,0000, si después de repetir los pasas 3 y 4 da positiva.
9. El título del antisuero será la máxima dilución del suero en donde se
observe aglutinación franca (ver fig. 3.1)
SUERO CONC. SUERO 1:10 SUERO 1:50 SUERO 1:100
50
0.08 1:20
0.04 1:40 0.04 1:400
0.02 1:80 0.02 1:800 0.02 1:4000
0.01 1:160 0.01 1:1600 0.01 1:8000
0.005 1:320 0.005 1:3200 0.005 1:16000 0.005 1:32000
Figura 3.1 Interpretación de la reacción de aglutinación en placa.

Título: Máxima dilución del suero que presenta reacción
de aglutinación visible.

51
Práctica No. 9
AGLUTINACIÓN EN TUBO
Tipificación de Grupo Sanguíneo ABO Y Rh.
MARCO TEÓRICO
Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antigénicas determinadas
genéticamente las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos específicos.
SISTEMA ABO:
El primer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, que
se conoce como sistema ABO, el cual consta de tres antígenos denominados A, B
y H que dan los cuatro diferentes grupos de este sistema : A , B, AB y O.
Estos antígenos son glucoproteínas que se forman por acción de diferentes

enzimas codificadas por los genes A, B y H y modifican una sustancia precursora.
La sustancia precursora es una cadena de N-acetilglucosamina, D-galactosa, N-
acetilglucosamina y D-galactosa, que es modificada por la enzima 1,2 fucosil-
transferasa codificada por el gen H y que adiciona una fucosa en la parte terminal
de la sustancia precursora que es la D-galactosa terminal con lo que se convierte
en la sustancia H.
La sustancia H es modificada por las enzimas codificadas por el gen A y/o el gen
B que son una 1-3 N-acetilgalactosaminil-transferasa y 1-3 galactosidil-transferasa
respectivamente.
Si la sustancia H es modificada por 1-3 N-acetilgalactosaminil-transferasa esta le

adiciona una N-acetilgalatosamina en su parte terminal donde esta la D-galactosa
dando lugar a la sustancia A.
Si lo que modifica la sustancia H es la 1-3 galacosidiltransferasa esta le adiciona

una galactosa en la parte terminal donde esta la D-galactosa dando lugar a la
sustancia B.
El denominado grupo O, no es otra cosa que la sustancia H, por lo tanto no heredo

los genes A y B , y su sustancia H no es modificada.
Si se heredan los dos genes A y B estos son codominantes por lo tanto tendrán
sustancia A y sustancia B en sus eritrocitos y se les denomina grupos AB.
Como las sustancias del sistema ABO son químicamente similares a antígenos
bacterianos y de alimentos, los que estimulan al sistema inmune a producir
anticuerpos a partir del nacimiento y siendo detectables a los 6 meses de vida, a
estos anticuerpos así formados se les denomina naturales.
Por tanto, la tipificación del sistema ABO se realiza de dos maneras:
52
Tipificación directa: Se pone de manifiesto los antígenos presentes en la
membrana del eritrocito, cuando se les hace reaccionar con anticuerpos
específicos.
Tipificación inversa: Se ponen de manifiesto los anticuerpos presentes en el

suero del individuo cuando se les hace reaccionar con eritrocitos tipificados para el
sistema ABO.
SISTEMA Rh:
Por otro lado el sistema Rh esta constituido por mas de 40 antígenos proteicos
distintos, cinco de los cuales son importantes por su inmunogenicidad y
frecuencia.
Los genes que codifican a este sistema se designan con símbolos: D y d, C y c , E

y e, cada gen (con excepción de d) codifica para un antígeno específico, que
puede ser detectado en la membrana del hematie.
La presencia o ausencia del antígeno D es lo que determina que un individuo sea

Rh positivo o negativo.
Los anticuerpos del sistema Rh son de clase IgG, siendo estimulados por
transfusión o por embarazo, ya que el individuo Rh negativo esta recibiendo
hematíes Rh positivos, no son naturales.
Los anticuerpos que se forman después de recibir sangre o sus derivados se

denominas aloanticuerpos inmunes o adquiridos.
En esta práctica se llevará a cabo la tipificación directa e inversa del sistema ABO,
así como la determinación del Rh, logrando la identificación de estos grupos
sanguíneos y se analizará la importancia de esta técnica en la práctica
transfusional y médico-legal.
MATERIAL
2 Pipetas Pasteur con bulbo
1 Gradilla
8 Tubos de 12 x 75 mm
3 mL Sangre total
3 mL Solución salina isotónica (SSI)
2 gotas Suero anti-A
2 gotas Suero anti-B
2 gotas Suero anti-AB
2 gotas Suero anti-D
1 gota Suspensión de GR A al 5%
1 gota Suspensión de GR B al 5%
53
TÉCNICA
1. Centrifugar la muestra sanguínea 5 min a 2000 rpm y separar el plasma
(para la prueba inversa) y el paquete celular (para la prueba directa) en
diferentes tubos, previamente marcados.
2. Preparar una suspensión al 5% del paquete celular de la muestra,
adicionando a un tubo una gota de pipeta Pasteur del paquete celular y
adicionando 19 gotas de SSI.
3. Rotular cuatro tubos con A, B, AB y D respectivamente, a los cuales se
les agrega una gota de suspensión al 5% del paquete celular a cada tubo.
4. Adicionar al tubo A dos gotas de suero anti-A, al tubo B dos gotas de
suero anti-B, al tubo AB dos gotas de suero anti-AB y por último al tubo
rotulado D agregar dos gotas de suero anti-D.
5. Mezclar el contenido de los tubos y centrifugar 30 seg a 2000 rpm.
6. Realizar la lectura agitando suavemente el tubo para resuspender el botón
formado. La presencia de cúmulos celulares indica la presencia del
antígeno en la superficie del eritrocito.
7. Para la prueba inversa se toma el plasma de la muestra y se agregan dos
gotas a cada tubo rotulado previamente con anti-A y anti-B, mas una gota
de suspensión de G.R. A al 5% al tubo rotulado anti-A y una gota de
suspensión de G.R. B al 5% al tubo marcado anti-B.
8. Centrifugar 30 seg a 2000 rpm.
9. Resuspender el botón agitando suavemente, la reacción de aglutinación
positiva indicara la presencia de los anticuerpos contra los antígenos de
los G.R. utilizados como reactivo.
RESULTADOS
Con las observaciones realizadas complete el siguiente cuadro y determine el
grupo sanguíneo de la muestra problema
TIPIFICACION DIRECTA TIPIFICACION GRUPO

INVERSA SANGUINEO
A B AB D ANTI-A ANTI-B ABO D

54
PRÁCTICA No. 10
HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
Titulación de Anticuerpos frente a Tiroglobulina
MARCO TEÓRICO
En la hemaglutinación indirecta o pasiva, los eritrocitos de carnero o humano tipo
“O”, se utilizan como soporte de antígenos debido a que son fáciles de obtener y
de conservar en el laboratorio bajo ciertas condiciones durante 15 a 30 días. Fijan
espontáneamente a su superficie casi todos los polisacáridos y ciertas proteínas,
cualidad que se incrementa cuando los eritrocitos son tratados con sustancias
tales como el ácido tánico que favorece la unión por atracción electrostática.
También se les puede unir covalentemente el antígeno proteico, usando reactivos
como el glutaraldehído. Una vez que los eritrocitos han sido “sensibilizados”
(recubiertos) con el antígeno producen aglutinación cuando se ponen en contacto
con anticuerpos específicos.
La técnica de Boyden es altamente sensible y fácil de realizar, por lo que se

emplea para la cuantificación de anticuerpos presentes aún en cantidades
pequeñas en el diagnóstico de un gran número de enfermedades.
Para conocer la cantidad de Ac presentes, se hacen reaccionar dilaciones

seriadas del suero, con cantidades constantes de una suspensión de eritrocitos
sensibilizados con un Ag específico, la dilución más alta del suero que determina
una clara hemaglutinación, se considera como punto final de la reacción y
representa el título de anticuerpos. La prueba puede realizarse mediante una
macrotécnica (en tubo) o una microtécnica (placa).
Así, por ejemplo proteínas tales como la tiroglobulina son adsorbidas rápidamente
a la superficie de glóbulos rojos tratados previamente con ácido tánico.
La tiroglobulina, extraída de glándula tiroides humana por las técnicas de

precipitación con sales neutras y adsorbida a eritrocitos de carnero tanados,
proveen una prueba de hemaglutinación indirecta para la detección de anticuerpos
frente a tiroglobulina.
La estabilidad durante el almacenamiento de las células tanadas y recubiertas con

el antígeno (sensibilizadas), se logra por tratamiento de la suspensión final con
formalina.
Como algunos sueros humanos contienen anticuerpos heterófilos capaces de

aglutinar eritrocitos de carnero, se debe incluir un control de eritrocitos tanados sin
sensibilizar (testigo negativo). Si en éste existe aglutinación, la prueba se repite
con el suero previamente adsorbido con eritrocitos de carnero tanados.
La prueba de hemaglutinación fue inicialmente usada por Witebsky y Rose para la

cuantificación de autoanticuerpos frente a tiroglobulina.
55
La glándula tiroides tiene ciertas propiedades funcionales y estructurales
exclusivas que la predisponen para el desarrollo de respuestas autoinmunes. El
constituyente principal de los folículos tiroideos es la tiroglobulina (glucoproteína
de PM 660 Kd), que representa la forma de almacenamiento de las hormonas
tiroideas, tiroxina y triyodotironina, que afectan la velocidad del metabolismo en
todas las células del cuerpo.
El diagnóstico de patología autoinmune de la glándula tiroides, consiste

principalmente en la demostración de autoanticuerpos contra la tiroglobulina, y en
menor grado frente al antígeno microsomal. Se pueden encontrar autoanticuerpos
frente a estos constituyentes en: tiroiditis aguda, subaguda, fibrótica, crónica
(enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo primario (mixedema en el adulto),
hipertiroidismo (tirotoxicosis o enfermedad de Graves), y en carcinoma de tiroides;
la diferencia de estos padecimientos se hace de acuerdo a su manifestación
clínica, el estudio histológico y algunas otras pruebas de laboratorio.
Los autoanticuerpos anti-tiroglobulina también pueden presentarse en otros

padecimientos como: anemia perniciosa, gastroenteritis atrófica, insuficiencia
suprarrenal idiopática, insuficiencia paratiroidea y en el síndrome de Sjogren.
Además de la hemaglutinación pasiva, se han utilizado otras pruebas para la
detección de estos autoanticuerpos como la fijación de complemento, la
inmunofluorescencia y el radioinmunoensayo.
PRIMERA PARTE
TANADO Y SENSIBILIZACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS
MATERIAL
1 Gradilla
2 Pipetas capilares con bulbo
Baño de agua a 370c
Centrifuga clínica
Papel Parafilm
4 mL Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH = 7.2, µ = 0.15

6 mL Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH= 6.4 µ = 0.15
15 mL Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH = 7.2, µ = 0.15, adicionado de
suero normal de conejo al 1%.
4 mL Acido tánico diluido 1:20 000
0.4 mL Formaldehído al 40%
2 mL Antígeno: Solución de tiroglobulina humana purificada (HTG) (dil. óptima)
4 mL Suspensión de G.R. de carnero al 2.5% en PBS 7.2 0.15 M, pH 7.2.
TÉCNICA
TANADO DE LOS GLÓBULOS ROJOS:
56
1. Rotular 2 tubos de ensayo, uno “S” (sensibilizados) y otro “NS” (no
sensibilizados).
2. En cada tubo, pipetear 2 mL de la suspensión de eritrocitos de carnero al
2.5% (procurando que la suspensión este perfectamente homogeneizada).
3. Agregar un volumen igual de ácido tánico 1:20 000 a cada tubo.
Inmediatamente tapar con papel parafilm y mezclar por inversión.
4. Incubar ambos tubos en baño María a 37 °C durante 15 min. Agitar
eventualmente.
5. Centrifugar los dos tubos a 2 000 rpm durante 5 min, retirarles el
sobrenadante con pipeta Pasteur o por decantación cuidadosa y
resuspender los paquetes de G.R. en 2 mL de PBS pH = 7.2 y volver a
centrifugar 5 min.
6. Retirar el sobrenadante y resuspender el paquete de G.R. de cada tubo en
2 mL de PBS pH= 6.4 para tener nuevamente la suspensión al 2.5%.
SENSIBILIZACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS CON ANTÍGENO:

1. Los G.R. tanados se sensibilizan agregando un volumen igual de la
dilución óptima de antígeno en PBS pH= 6.4. Para ello al tubo rotulado “S”
agregarle 2 mL de la dilución óptima de antígeno (tiroglobulina humana).
2. Tapar con papel parafilm e incubar la mezcla en baño de agua a 37 °C
durante 15 min. Agitar eventualmente.
4. Retirar las células del baño de agua y centrifugar 5 min a 2000 rpm.
5. Decantar el sobrenadante y lavar las células dos veces por centrifugación
a 2000 rpm por 5 min con PBS pH = 7.2, adicionado de suero normal de
conejo al 1%.
6. Ajustar el paquete de células al 1.5% resuspendiendo en 3.3 mL de PBS
pH= 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%.
7. Al tubo rotulado “NS” que contiene los 2 mL de eritrocitos tanados sin
sensibilizar, ajustarlos al 1.5% en el mismo amortiguador. Para ello
centrifugar, retirar el sobrenadante y agregar 3.3 mL de PBS pH = 7.2
adicionado de suero normal de conejo al 1%.
FORMALINIZACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS:

Este procedimiento se realiza para preservar los GR cuando se preparan grandes
cantidades, para utilizarse durante mucho tiempo (duran hasta 6 meses sin
disminuir su actividad antigénica).
1. A los G.R. sensibilizados y sin sensibilizar se les adiciona lentamente 1 mL
gota a gota de formaldehído al 40% por cada 10 mL de suspensión (a
cada tubo agregar 0.2 mL de formaldehído al 40%).
2. Dejar reposar 18 h a 4 ºC.
3. Agregar otros 0.2 mL de formaldehído al 40% a cada uno de los tubos.
4. Cuando las células han sedimentado (después de 2 ó 3 días) se retira el
sobrenadante y se resuspenden las células en su volumen original de PBS
pH = 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%.
5. Se agitan nuevamente las células y se añade 1 gota (0.05 mL) de
formaldehído al 4%.
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA DE ANTÍGENO:
57
1. Preparar 4 diluciones del antígeno HTG en PBS pH= 6.4: por ejemplo
1:20, 1:40, 1:80 y 1:160.
2. Sensibilizar los G.R. con cada dilución de antígeno como se indicó
anteriormente.
3. Probar con un suero positivo y otro negativo, cada una de las diluciones.
La mas baja dilución de antígeno, que de el título más elevado con el
suero inmune y no reaccione con el suero negativo se considerará el
óptimo.
SEGUNDA PARTE:
DESARROLLO DE LA PRUEBA
MATERIAL
1 Micropipeta de 25 µl
1 Placa de microtitulación fondo en “U”
1 Microdilutor
Baño de agua a 56oc.
Rotor
3.3 mL Suspensión de G.R. al 1.5% sensibilizados con el Ag

3.3 mL Suspensión de G.R. al 1.5% no sensibilizados
25 µL Suero control positivo
25 µL Suero control negativo
50 µL Suero problema diluído 1:8
3 mL Amortiguador de fosfatos PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de
conejo al 1%.
TÉCNICA
1. Inactivar los sueros problema a 56 ºC durante 30 min o a 63 ºC por 3 min.
2. A todas los pozos de las filas A, B, C, D y E de la placa de microtitulación
agregar con una micropipeta 25 µl de suero normal de conejo al 1% diluido
en PBS pH= 7.2.
3. Cargar el microdilutor con 25 µl de suero problema y colocarlos en la
primera poza de la fila A; mezclar completamente y transferir 25 µl a la
poza siguiente, repitiendo este proceso hasta la ultima poza de la hilera de
donde se descartan 25 µl.
4. A cada dilación del suero, agregar con una micropipeta 25 µl de la
suspensión de glóbulos rojos al 1.5% sensibilizados.
5. Colocar la placa en el rotor y agitar de 1 min.
6. Dejar reposar la placa a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas
cubriéndola; hacer la lectura.
Al mismo tiempo se corren los siguientes controles:

Control para Ac heterófilos: Probar las mismas diluciones del suero problema con
eritrocitos sin sensibilizar (fila B).
58
Control positivo: Hacer las mismas diluciones del suero control positivo y agregar
25 µl de eritrocitos sensibilizados a cada una de las pozas (fila C).
Control negativo: Realizar la misma operación con un suero negativo conocido (fila
D).
Control del diluyente: Depositar 25 µl de PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal
de conejo al 1% en una hilera de pozas (fila E) y agregar 25 µl de la suspensión
de células sensibilizadas al 1.5%. Esta reacción deberá ser negativa.

59
UNIDAD 4
REACCIONES DE CITÓLISIS
GENERALIDADES
Una de las funciones efectoras de los anticuerpos producidos en la respuesta
inmune humoral, es la activación del sistema complemento.
El complemento es un complejo multienzimático presente en el suero de todos los

vertebrados, cuyos componentes que en su mayoría son glucoproteínas se
encuentran como precursores inactivos (zimógenos), y por tanto requieren de ser
activados. También participan de forma importante iónes Ca++ y Mg++ durante la
activación.
La activación del sistema complemento se lleva a cabo en forma de cascada, es

decir, los componentes se van activando secuencialmente uno a uno y derivado
de su activación se generan varías actividades, entre ellas: quimiotaxis,
opsonización, degranulación de basófilos y células cebadas (con la consecuente
vasodilatación y contracción de músculo liso) y la lísis celular.
La activación del complemento se puede llevar a cabo por dos vías principales, la
clásica y la alterna. La vía clásica es activada por una reacción Ag-Ac, en la cual el
Ac participante es de clase IgG o IgM, mientras que la vía alterna se activa por
factores no inmunológicos como son los lipopolisacáridos bacterianos (LPS), el
zimosan, la inulina y algunos policationes y polianiones. Recientemente se ha
descrito una tercera vía de activación denominada vía de la lectina que involucra a
la proteína que une manosa (MBL) que se une a residuos de manosa, y otros
azúcares (N-acetilgalactosamina, manosamina, fucosa, galactosa y
galactosamina), presentes en proteínas y polisacáridos microbianos.
Cuando la activación del complemento se lleva a cabo sobre una superficie celular
por cualquiera de estas vías, en las últimas etapas se forma el complejo de ataque
a la membrana (MAC), que causa la lisis de dicha célula. En la figura 4.1 se
describe la vía clásica de activación del complemento.
Debido a que las actividades que se generan durante la activación del

complemento pueden causar daño a los propias células y tejidos del huésped,
existen factores que actúa en la regulación del sistema.
En las reacciones de citólisis, en donde se utiliza el Complemento como reactivo

(titulación de hemolisinas, y reacción de fijación de complemento) en donde se
utiliza el suero de algún animal como fuente de complemento (cobayo), o cuando
se cuantifica el complemento en el suero de un paciente, debe tomarse en cuenta
que algunos de los componentes son termolábiles, y pierden rápidamente su
actividad, por lo que se debe utilizar el suero recientemente obtenido y conservado
en refrigeración o en su caso usar productos comerciales liofilizados.
VIA CLASICA
C1q,r,s 60
C4 C2
C3 CONVERTASA
Ag - Ac Ag-Ac-C1 Ag-Ac-C1; C4b 2+ Ag-Ac-C1; C4b2b
Ca
2+
Mg
C3
Fig. 41 Activación del Complemento por la Vía Clásica.
61
PRÁCTICA No. 11
TITULACIÓN DE AMBOCEPTOR HEMOLÍTICO ANTICARNERO
MARCO TEÓRICO
Las hemolisinas son anticuerpos producidos frente a los antígenos que se
encuentran en la superficie de los eritrocitos. Estos anticuerpos, también llamados
amboceptores hemolíticos, al estar en presencia del antígeno que estimuló su
formación y del complemento desencadenan una reacción que causa la lisis de los
eritrocitos. Este fenómeno es el resultado de la acción enzimática del
complemento, el cual es activado por la vía clásica, formándose el complejo de
ataque a la membrana (MAC) el cual causa daño a la membrana del eritrocito que
a su vez va a producir cambios en su permeabilidad y al cambiar las propiedades
osmóticas de ésta, penetran líquidos y se produce el estallamiento de los
eritrocitos.
Para medir la actividad del amboceptor hemolítico se prueban diferentes

diluciones del suero de conejo inmunizado con G.R. de carnero, frente a una
cantidad constante de complemento (suero de cobayo) y de G.R. de carnero
lavados y ajustados a una suspensión del 2%.
La máxima dilución del suero de conejo que produce hemólisis total indica el título
del amboceptor hemolítico anticarnero. Para algunas técnicas no se toma como
punto final la hemólisis total, sino el 50% de hemólisis y para esto se hace la
medición colorimétrica de la hemoglobina liberada.
MATERIAL
1 Gradilla
Centrifuga clínica
Papel Parafilm
0.2 mL Amboceptor hemolítico anticarnero obtenido en la práctica No. 1.V

2.0 mL Suspensión de G.R. de carnero lavados y ajustados al 2%.
4.0 mL Suero de cobayo diluído 1:30 (fuente de complemento).
Nota: El suero debe ser de cobayo macho, de más de 500 g de peso,
recientemente obtenido o liofilizado
TÉCNICA
1. Preparar en 10 tubos de 12 X 75 mm las diluciones del amboceptor
hemolítico anticarnero en amortiguador de de acuerdo al siguiente
esquema:
Tubo Amortiguador Amboceptor Hemolítico anticarnero Dilución
62
No. Veronal (mL) (o sus diluciones) (mL) Final
1 0.9 0.1 Mezclar 1:10
2 0.9 0.1 (del tubo 1) Mezclar 1:100
3 2.7 0.3 (del tubo 2) Mezclar 1:1 000
4 0.5 0.5 (del tubo 3) Mezclar 1:2 000
5 1.0 0.5 (del tubo 3) Mezclar y pasar 0.5 al No. 8 1:3 000
8 0.5 Mezclar 1:6 000
9 0.5 Mezclar 1:8 000
10 0.5 Mezclar 1:10 000
2. En otros 9 tubos de ensayo transferir 0.2 mL de cada una de las diluciones

a partir de la de 1:1 000, en el último tubo no se coloca hemolisina.
3. Adicionar a los tubos del 1 al 8 un volumen de 0.4 mL de complemento
diluído 1:30 y mezclar perfectamente.
4. Agregar a todos los tubos, incluyendo el No. 9, 0.2 mL de la suspensión de
glóbulos rojos al 2% y mezclar perfectamente.
5. Agregar a los tubos del 1 al 8 un volumen de 0.4 mL de amortiguador de
veronal y al No. 9 un volumen de 1.0 mL. Mezclar perfectamente. (Ver
esquema de la reacción)
ESQUEMA DE LA REACCIÓN:
Tubo mL de dilución de Complemento Suspensión de Amortiguador
No. amboceptor diluído 1:30 G.R. carnero Veronal
1 0.2 (1:1 000) 0.4 0.2 0.4
2 0.2 (1:2 000) 0.4 0.2 0.4
3 0.2 (1:3 000) 0.4 0.2 0.4
4 0.2 (1:4 000) 0.4 0.2 0.4
5 0.2 (1:5 000) 0.4 0.2 0.4
6 0.2 (1:6 000) 0.4 0.2 0.4
7 0.2 (1:8 000) 0.4 0.2 0.4
8 0.2 (1:10 000) 0.4 0.2 0.4
9 ------- ------- 0.2 1.0
(Control)
6. Colocar la gradilla con los tubos en un baño de agua a 37°C y observar

después de transcurrida una hora.
7. Al término del periodo de incubación, centrifugar los tubos a 3 000 rpm
durante 5 minutos para facilitar la lectura, ya que los eritrocitos que no
fuero lisados se acumulan en el fondo y se puede apreciar perfectamente
en que tubos no hay hemólisis o en su caso hemólisis parcial o total.
RESULTADOS
La unidad de amboceptor hemolítico está dada por la máxima dilución del suero
que es capaz de causar hemólisis total.
63
Título obtenido: _____________________

64
Unidad 5
TÉCNICAS CON ANTICUERPOS O ANTÍGENOS MARCADOS
GENERALIDADES
Las reacciones Ag-Ac, pueden ser utilizadas para revelar la presencia de uno u
otro de estos reactantes. Es decir, se pueden utilizar Ac para demostrar la
presencia de Ag en una muestra problema y, viceversa, se pueden utilizar Ag para
revelar la presencia de Ac. La especificidad de la reacción Ag-Ac le da a estas
reacciones in vitro una elevada confiabilidad. La sensibilidad de estas pruebas ha
sido aumentada significativamente al utilizar “marcas” que al estar unidas a los Ag
o a los Ac, según sea el caso, permiten demostrar la presencia de cantidades
sumamente pequeñas de los reactantes. Las principales sustancias utilizadas
como marcas son: isótopos, enzimas y fluorocromos.
Los isótopos se comenzaron a usar en 1966 por la Dra. Yallow , cuando realizó el
primer Radioinmunoanálisis (RIA), que se trataba de un ensayo competitivo en
donde se permitía la competencia entre moléculas de Ag no-marcadas y marcadas
con radiosótopo por los sitios de unión con anticuerpos específicos. La marca en
este caso se denomina trazador y tiene el objeto de permitir la identificación y la
cuantificación del analito en la fracción libre y unida de la reacción.
Al término de la reacción se separan las moléculas de Ag que quedan unidas al Ac

de las que no lo están, mediante métodos de separación que pueden ser
fisicoquímicos como adsorción, intercambio iónico, filtración molecular, o bien,
inmunológicos utilizando un segundo Ac anti-gammaglobulina para precipitar al
complejo Ag-Ac previamente formado, a este método se la conoce como método
del segundo anticuerpo. Actualmente este segundo Ac anti-gammaglobulina se
adsorbe a una fase sólida para capturar a los complejos Ag-Ac, que después de
un periodo de incubación y procesos de lavado se separa el sobrenadante.
Finalmente mediante un contador de centelleo se determina la radioactividad

presente. Generalmente basta con contar solo una de las fracciones (unida o
libre), pero preferentemente se determina la fracción unida, que estará en relación
a la cantidad de Ag marcado, con lo cual: “La cantidad de radioactividad es
inversamente proporcional a la cantidad de antígeno no marcado”.
Para 1971 Engall y Perlman, desarrollan el RIST (radio immunosorbent assay), en

donde las moléculas de Ag marcado radioactivamente interaccionan con Ac
inmovilizados en celulosa o sephadex.
Posteriormente estos autores describen la aplicabilidad de conjugar a los Ac a

enzimas en lugar de radioisótopos, con lo que nacen los inmunoensayos
enzimáticos (EIA); de estos existen dos variedades, los homogéneos y los
heterogéneos.
En un EIA homogéneo la reacción se lleva a cabo en fase líquida y no se
requieren de etapas o medios para separar los complejos Ag-Ac formados de los
Ac o Ag (según sea el caso) que permanecen libres en el sistema y que no han
65
intervenido en la reacción. Estos EIA se basan en la inhibición o activación de la
función de la enzima por la interacción Ag-Ac. Generalmente las enzimas que se
utilizan son de bajo peso molecular que puedan ser conjugadas a un hapteno,
como ejemplo esta la lisozima.
En los sistemas heterogéneos se utiliza una fase líquida en donde se encuentran

inicialmente disueltos algunos de los reactivos y una fase sólida en donde se lleva
a cabo la reacción. A diferencia de los homogéneos, la actividad enzimática del
conjugado no se ve influida por la reacción inmunológica y además requieren
medios físicos para separar las fracciones libres de las unidas, ya que después de
que se lleva a cabo la reacción Ag-Ac, los complejos se retienen en la fase sólida,
y mediante lavados se eliminan los Ac o Ag que no intervienen en la reacción. El
EIA heterogéneo por excelencia es el ELISA (Enzyme linked immuno sorbent
assay).
En ambos casos, el paso final es la adición del sustrato específico para demostrar
cualitativa o cuantitativamente la actividad enzimática, que estará en relación a la
presencia o ausencia del Ag o Ac buscado. La lectura del resultado puede ser
visual (cualitativa) o mediante un colorímetro o fluorómetro (cuantitativa).
La tercera marca utilizada son los fluorocromos como el isotiocianato de

fluoreceína y la rodamina que se conjugan a los Ac, para identificar o localizar Ag
en la superficie y dentro de la célula lo que da origen a los métodos de
inmunofluorescencia, de los cuales existen dos principales modalidades la directa
y la indirecta.
En la inmunofluoresencia directa, los Ac marcados con el fluorocromo están

dirigidos al Ag buscado y la demostración se hace en un solo paso, mientras que
en la indirecta se lleva a cabo en dos pasos, en el primero se utiliza un Ac no
marcado que se une al Ag celular el cual es demostrado en el segundo paso
mediante una antiglobulina marcada con el fluorocromo. La fluorescencia se hará
visible amarilla verde o roja según sea el caso, cuando se examina en un
microscopio de fluorescencia.
Cabe mencionar que adicional a estos tres principales marcadores (radioisótopos,

enzimas y fluorocromos) se han utilizado otros como la ferritina, compuestos
quimioluminiscentes y existen diferentes modalidades que utilizan amplificadores
como en el sistema avidina-biotina que también es utilizado ampliamente.
66
Práctica No.12
ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
MARCO TEÓRICO
Se trata de un EIA heretogéneo que utiliza como marca enzimas, es una prueba
cuantitativa o cualitativa.. En el primer caso sirve para medir la concentración
(nanogramos o picogramos/mL) de antígenos o anticuerpos presentes en una
muestra. En el segundo caso solo revela la presencia de ellos en una muestra
problema y la reacción resulta simplemente positiva o negativa. Los reactivos de
ELISA cuentan con una vida media larga, pueden automatizarse y no hay
contaminación radiactiva, dándole con esto ventajas sobre el RIA.
Para realizar una técnica de ELISA se requiere contar con:

Fase sólida: Es donde el Ag o Ac pueden estar adsorbidos en su superficie
mediante interacciones hidrofóbicas. Los materiales más usados son: poliestireno,
cloruro de polivinilo (PVC), nylon, polipropileno, nitrocelulosa, goma de silicona y
vidrio; que pueden encontrarse comercialmente como microplacas de fondo plano,
tubos o perlas.
Cuando a una fase sólida se le adsorben los Ac, se esta buscando al Ag en la
muestra problema, por ejemplo en la detección del Ag de superficie de hepatitis B
(HBsAg), en cambio cuando se han adherido los Ag a la fase sólida se va ha
detectar la presencia de Ac en la muestra problema, por ejemplo en la búsqueda
de Ac contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).
Bloqueador: Se utiliza para bloquear los sitios libres de la fase sólida para evitar
que durante la reacción algunas moléculas de reactivo se unan inespecíficamente
a la fase sólida, en lugar de hacerlo por medio de la reacción Ag-Ac, dando lugar a
resultados falsos y se observe un exceso de actividad enzimática que no es real.
Para ello, se puede usar un exceso (0.1 al 1%) de una proteína inerte. Entre los
bloqueadores más usados esta la caseína, seroalbúmina bovina, gelatina, suero
entero y leche entera (sveltex).
Conjugado: Es la unión de una enzima a un Ac o Ag en forma covalente, dando

como resultado complejos Ag-enzima o Ac-enzima sin que se pierda la actividad
inmunológica o enzimática. La técnica más usada para conjugar es la de
Avrameas o del gluteraldehído.
Enzima y sustrato: Son los indicadores de que la reacción Ag-Ac ha ocurrido, de

ellos depende la sensibilidad total del ensayo, logrando esta cuando se conocen
todos los requerimientos de la enzima. La enzima debe conservar toda su
actividad enzimática al ser conjugada y tener un alto número de recambio (las
moles de sustrato convertido en producto por unidad de tiempo). Las enzimas más
usadas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.
El sustrato generalmente es incoloro y el producto de la reacción enzimática debe
ser fácil y sensiblemente detectable., debido a que desarrolle color, sea
fluorescente o que emita luz.
67
La presencia del producto indica la prueba positiva desde el punto de vista
cualitativo. Para hacer el ensayo cuantitativo, se determina la cantidad de enzima
adsorbida (por su actividad sobre el sustrato para dar un producto colorido,
fluorescente o luminoso) la cual es proporcional a la cantidad de Ag o Ac en la
muestra, entonces su concentración se puede medir mediante una curva de
calibración utilizando estándares de concentración conocida.
Las técnicas de ELISA se pueden realizar de 4 maneras diferentes: (1) directo, (2)
indirecto, (3) sandwich y (4) por competencia.
ELISA directo consiste en la adsorción pasiva de un Ag (o un Ac) sobre la

superficie de la placa y luego la adición de un Ac (o Ag) que lleva conjugada la
enzima.
ELISA indirecto (para detección de Ac) consiste en adsorber pasivamente el Ag

sobre la placa, adicionar el suero donde se buscan los Ac específicos contra el Ag
y posteriormente añadir un segundo anticuerpo anti-gamma globulina que lleva
conjugada la enzima.
ELISA tipo sandwich (para detección de Ag) puede ser directo o indirecto. El
primero consiste en adsorber los Ac específicos a la placa, después añadir la
muestra que contiene el Ag y finalmente un segundo Ac (dirigido contra el mismo
Ag) que tiene la enzima conjugada. El indirecto, utiliza un segundo Ac (contra el
mismo Ag) no conjugado y en un paso siguiente un tercer Ac anti-gamma
globulina conjugado a la enzima.
ELISA por competencia puede ser directo o indirecto. La prueba se basa en que
se tratan de unir dos reactivos a un tercero. La competencia apropiada exige la
adición simultánea de los dos reactivos que van ha competir, uno de ellos
marcado y el otro sin marca.
En esta práctica se utilizará un juego de reactivos comercial, y el sistema utilizado

y su aplicación variará de acuerdo a su disponibilidad, pero de cualquier forma a
continuación se describen los pasos generales para la realización de un ELISA.
PROCEDIMIENTO GENERAL DE UN ELISA:
1. Adsorber los Ag o Ac, según sea el caso a una fase sólida.

2. Bloquear la fase sólida.
3. Proceder a la “captura”, del Ag o Ac presente en la muestra problema a la
fase sólida (al reaccionar con el Ac o Ag) e incubar.
4. Lavar la placa para separar lo que reacciono de lo que NO reacciono.
5. Adicionar el conjugado e incubar.
6. Lavar la placa para separar lo que reacciono de lo que NO reacciono.
7. Adicionar el sustrato específico de la enzima usada. Para revelar la
reacción.
8. Detener la reacción enzimática por un cambio drástico de pH.
68
9. Interpretar los resultados visualmente si es un estudio cualitativo o en caso
de ser cuantitativo leer el desarrollo de color en un colorímetro.

69
UNIDAD 6
PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS
GENERALIDADES
Los anticuerpos (Ac) son glicoproteínas que pertenecen a la parte efectora de la
respuesta inmune humoral. Se sintetizan por las células plasmáticas y se localizan
en la mayoría de los fluidos biológicos.
La purificación de los Ac ha sido una práctica muy importante, debido a que los
productos purificados son utilizados como herramientas de uso terapéutico,
preventivo, diagnóstico y de investigación. Como uso terapéutico o preventivo en
humanos, se utilizan sueros homólogos (de la misma especie) y heterólogos (de
especie diferente) cuyo grado de pureza y efectividad deben de ser factores
importantes que considerar. En el caso de su uso como reactivos para diagnóstico
e investigación se requieren anticuerpos purificados que presenten gran
especificidad.
Existe una gran variedad de métodos usados para purificar anticuerpos. La

elección correcta del método de purificación depende de una serie de variables,
como son el uso que se les dará a los anticuerpos, las especies filogenéticas en
las cuales se generaron, la clase o subclase si es un anticuerpo monoclonal, etc. A
menudo es necesario combinar varias técnicas para llevar a cabo la purificación
con éxito.
Los métodos de separación y purificación de anticuerpos pueden ser

“inespecíficos”, cuando se desea separar la fracción de las γ-globulinas del resto
de las proteínas que constituyen el plasma, o “específicos” cuando se desea
separar del suero o plasma anticuerpos con una especificidad determinada.
Purificación Inespecífica
Los métodos de purificación inespecífica de los anticuerpos se basan en
aprovechar algunas de las propiedades fisicoquímicas de proteínas como son:
diferencias en solubilidad, carga eléctrica neta, tamaño y peso molecular (PM);
pero también aquí se incluye un método basado en una propiedad biológica de las
bacterias Staphylococcus aureus y Streptococcus sp. que unen a través de su
proteína A y G respectivamente, la región Fc de los anticuerpos de clase IgG.
Algunas consideraciones sobre estas propiedades son:

Solubilidad: la solubilidad de las proteínas depende no solo de la variedad de
grupos residuales de aminoácidos y de la manera en que se pliega la cadena
peptídica, sino también de las propiedades del sistema en el cuál se encuentra la
proteína. Los cuatro factores que afectan la solubilidad son: fuerza iónica, pH,
temperatura y la constante dieléctrica del disolvente. Así, los siguientes métodos
se basan en diferencias de la solubilidad de los anticuerpos con respecto a las
demás proteínas:
• Precipitación fraccionada con sales neutras.
70
• Precipitación fraccionada con sales neutras combinada con hidrólisis
enzimática con pepsina.
• Método de Cohn o precipitación fraccionada con disolventes orgánicos
miscibles con el agua (etanol, rivanol, acetona).
Carga: la carga neta de las proteínas la determina en general los grupos de

aminoácidos presentes y el pH del medio en que se encuentre. Los métodos
basados en esta propiedad son:
• Electroforesis
• Cromatografía de Intercambio iónico
PM-Tamaño: bajo el principio de que una molécula de mayor peso molecular

tiende a ocupar mayor espacio y por lo tanto la resistencia que le ponga el medio
va a ser fundamental para determinar sí fluye o sedimenta con mayor o menor
rapidez. Esto sucede en métodos como:
• Exclusión molecular.
• Ultracentrifugación en gradiente de densidad.
• Electroforesis-SDS-Poliacrilamida.
Afinidad por proteínas A y G: la región Fc de los anticuerpos IgG tiene una gran
afinidad por la proteína A de Staphylococcus aureus y la proteína G de
Streptococcus sp., siendo esto de utilidad para separar a los anticuerpos de esta
clase. El método basado en esta propiedad es:
• Purificación de Ac de clase IgG por cromatografía de afinidad.
Purificación específica
Como se mencionó anteriormente la purificación específica tiene como finalidad
separar del suero o plasma Ac con una especificidad determinada y para ello es
necesario utilizar reacciones Ag-Ac, es decir se basa en las propiedades
inmunológicas de estas moléculas. Básicamente pueden ser llevados a cabo por:
Adsorción: consiste en hacer interaccionar a los Ac indeseables con sus

correspondientes antígenos y separar de la mezcla los complejos Ag-Ac.
• Eliminar los Ac indeseables.
Adsorción-Elución: se basa en utilizar antígenos puros que al interaccionar con

el suero inmune se combinan específicamente con sus anticuerpos específicos, se
separa el complejo Ag-Ac de la mezcla, y bajo el principio de que la reacción es
reversible modificando el pH, la fuerza iónica, la temperatura o la concentración
del Ag, se disocia el complejo para obtener el Ac deseado.
• Obtener los anticuerpos que se desean.
Cromatografía de Afinidad: es una técnica que conjunta el principio de

adsorción-elución y la cromatografía. Se basa en hacer pasar la mezcla de Ac a
través de una columna cromatográfica empacada con un soporte (Sepharosa), el
cual tiene unido covalentemente (utilizando bromuro de cianógeno) un Ag puro.
Los Ac específicos se unirán al Ag. Posteriormente, se lava la columna para
71
separar las proteínas no enlazadas y el Ac deseado es separado de la columna
por elución, disociando la reacción Ag-Ac modificando el pH y/o la fuerza iónica.
También esta disociación se puede lograr agregando una concentración elevada
de antígeno en forma soluble. Además de la reacción Ag-Ac, este método aplica a
otros sistemas en donde se encuentre un ligando bioespecífico como enzima-
sustrato, carbohidratos-lectinas, etc.
72
PRÁCTICA No. 13
PURIFICACIÓN FRACCIONADA CON SALES NEUTRAS
Purificación de γ-globulinas a partir de plasma humano
MARCO TEÓRICO
La precipitación con sulfato de amonio es uno de los métodos más comúnmente
usados para extraer proteínas de una solución. Las proteínas en solución forman
uniones de hidrógeno con el agua a través de sus grupos polares y iónicos
expuestos. Cuando se adicionan altas concentraciones de pequeños iones muy
cargados, estos hacen que disminuya la solubilidad de las proteínas y precipiten.
Los factores que pueden afectar la concentración a la cual una proteína particular
precipite incluyen el número y posición de los grupos polares, el peso molecular de
la proteína, el pH de la solución y la temperatura a la cual se lleva a cabo el
proceso.
En este método se precipita a la γ-globulina mediante la adición de solución

saturada a temperatura ambiente de sulfato de amonio a tener una concentración
en la mezcla de 1/3 de saturación. Esta precipitación se realiza varias veces. El
sulfato de amonio que queda “atrapado” en el precipitado se elimina mediante
diálisis contra solución salina amortiguada con boratos. El producto resultante de
este método no se encuentra totalmente puro, estará contaminado con otras
proteínas de alto peso molecular y con proteínas que quedan atrapadas en el
precipitado. Por esta razón, la técnica se usa para concentrar y purificar
parcialmente Acs de todas las fuentes y especies y se recomienda combinarla con
otra como cromatografía de intercambio iónico o exclusión molecular, para mayor
eficiencia en la purificación; es barata, fácil y conveniente para grandes
volúmenes.
MATERIAL
1 Vaso de precipitado de 100 mL
1 Agitador magnético
1 Magneto
1 Pipeta de 10 mL
2 Tubos para centrífuga de plástico de 50 mL
1 Pipeta Pasteur
1 Bulbo.
1 Propipeta.
1 Centrífuga con cabezal para tubos de 50 mL
1 Frasco de 500 mL.
1 Probeta de 100 mL
10 cm Bolsa de diálisis.
Hilo cáñamo.
Papel tornasol, papel pH o potenciómetro.
30 mL Plasma o suero humano

45 mL Sulfato de amonio saturado
90 mL Solución salina isotónica (SSI) 0.85%
73
0.5 mL NaOH al 2N
0.2 mL BaCl2 al 10%
750 mL Solución salina isotónica amortiguada con boratos pH 7.8
TÉCNICA
1. En un vaso de precipitado de 100 mL con un magneto, colocar un volumen
medido de plasma o suero humano. Poner en agitación constante a baja
velocidad, evitando la formación de espuma.
2. Adicionar gota a gota la cantidad adecuada de solución saturada de
sulfato de amonio al plasma para tener 1/3 de saturación de la sal neutra
(para 30 mL de plasma, adicionar 15 mL de solución saturada de sulfato
de amonio). La adición debe de ser lenta para evitar que precipiten
proteínas indeseables. Al principio el precipitado se redisuelve
inmediatamente y no se debe agregar otra gota hasta que esto haya
sucedido, de lo contrario quedan englobadas en el precipitado otras
proteínas.
3. Una vez que se ha adicionado todo el sulfato de amonio, ajustar el pH a
7.8 con NaOH 2N. Si se trabaja con volúmenes menores de suero, usar
NaOH 0.5 –1 N, y si se trabaja con un volumen mayor usar NaOH 4–5 N.
4. Continuar con la agitación durante 2 a 3 h a temperatura ambiente para
eliminar mecánicamente las proteínas que hayan quedado englobadas en
el precipitado de γ-globulina.
5. Adicionar toda la solución y precipitado obtenido en una tubo para
centrífuga.
6. Centrifugar durante 30 min a 3000 rpm. Este precipitado contiene toda la
γ-globulina, pero impurificada con trazas de albúmina.
7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido con SSI
hasta tener el volumen inicial de plasma (si se inició con 50 mL de plasma,
aforar el precipitado a 50 mL con SSI).
8. Después de haber resuspendido la proteína, repetir la precipitación dos
veces más: para la segunda repetir los pasos 1-7 y para la tercera del 1-6.
En total se debe precipitar la proteína 3 veces.
9. Después de la 3ª precipitación y una vez centrifugado, resuspender el
precipitado con amortiguador salino de boratos en cantidad igual a la
mitad del volumen inicial de plasma (si se inició con 30 mL, se aforar a 15
mL).
10. Eliminar el sulfato de amonio mediante diálisis contra amortiguador salino
de boratos, cambiando esta solución cada 12 a 24 h y manteniendo a 4 ºC
durante este proceso.
11. Continuar con el proceso de diálisis hasta que el dializado de negativa la
reacción para sulfatos, la cual consiste en agregar unas gotas de BaCl2 ó
Ba(OH)2 al 10% a una muestra del dializado, si se forma un precipitado
blanco de BaSO4 la diálisis aún no ha terminado.
12. Recuperar la solución de γ-globulinas purificadas de la bolsa de diálisis
cuando ya no contenga sulfato de amonio, y pasarla a un tubo de
centrífuga de 50 mL.
74
13. Centrifugar en frío (colocar hielo en la camisa de la centrífuga) durante 30
min a 3000 rpm para eliminar partículas insolubles que se forman durante
la diálisis. La solución final debe presentar sólo una ligera opalescencia.
14. Envasar la γ-globulina purificada en un frasco vial. Para su conservación
puede filtrarse por Seitz, liofilizarse o adicionarle un conservador como
timerosal a concentración final de 1:10 000, glicerina a concentración final
de 50% ó azida de sodio 1 mg/mL.
15. Etiquetar con los siguientes datos: Nombre del producto, fecha de
obtención, volumen, conservador empleado y nombre de quien(es)
elaboraron.

75
ANEXO I
TÉCNICAS DE APOYO
A. COAGULACION DE PLASMA
Se utiliza para eliminar los factores de la coagulación del plasma y así evitar que
interfieran en algunas técnicas, por ejemplo durante los pasos de esterilización por
filtración.
MATERIAL
1 Matraz Erlenmeyer de 500 mL
Congelador de –20°C
Baño de temperatura controlada a 37 °C
50 mL Plasma humano
1.0 mL CaCl2 1M
0.1 mL Trombina bovina
TÉCNICA
1. Congelar el plasma a –20°C durante 3 días.
2. Descongelar en baño María a 37°C.
3. Agregar 2 mL de CaCl2 1M por cada 100 mL de plasma y se deja en el
baño María por 1 hora con agitación.
4. Si no coagula agregar 1 gota de trombina bovina. Se continúa agregando
gotas de trombina hasta lograr la coagulación.
5. Una vez ocurrida la coagulación, mantener el plasma coagulado 24 horas
a 4°C.
6. Se separa el coagulo y se exprime para obtener la mayor cantidad de
suero.
7. Si el suero se va a guardar, se conserva en congelación.

B. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS. MÉTODO DE BIURET
Se utiliza para la cuantificación de proteínas en preparados biológicos que van a

ser empleados como inmunógenos, para poder ajustar a la concentración deseada
para la inmunización. La técnica descrita es útil en un intervalo de 0.1 a 2.5 mg de
proteína.
MATERIAL
10 Tubos de 13 X 100 mm
76
1 Gradilla
2 Pipeta de 1.0 mL (1/10)
1 Pipeta de 5.0 mL (1/10)
Colorímetro
3.5 mL Estándar de proteínas de 2.5 mg/mL

10 mL Solución salina isotónica 0.85%
15 mL Reactivo de Biuret
Muestra Problema
TÉCNICA
1. En una serie de tubos preparar la curva estándar de acuerdo al siguiente
cuadro:
Tubo Estándar de Muestra SSI Reactivo de Biuret Concentración

proteína (2.5mg/ml) (ml) (ml) (mg/dl)
1 ----- ----- 1.0 1.5 0.00
2 0.05 ----- 0.95 1.5 0.125
3 0.10 ----- 0.90 1.5 0.25
4 0.20 ----- 0.80 1.5 0.50
5 0.40 ----- 0.60 1.5 1.00
6 0.60 ----- 0.40 1.5 1.50
7 0.80 ----- 0.20 1.5 2.00
8 1.00 ----- 0.00 1.5 2.50
9 ----- 0.10 0.90 1.5
10 ----- 1.00 0.00 1.5
2. Agitar los tubos.

3. Reposar 30 min a temperatura ambiente.
4. Leer la D.O. a 555 nm contra blanco de agua destilada.
5. Restar la D.O. del blanco de reactivo (tubo 1).
6. Graficar D.O. contra Concentración de proteínas.

C. CURVA DE Mc FARLAND
Se utiliza para determinar la concentración de suspensiones de bacterias. Para

ello se compara la turbidez de la suspensión problema con la de suspensiones
estándar de sulfato de bario (resultado de la mezcla de BaCl2 al 1% y H2SO4 al
1%), que equivalen a cierto número de microorganismos.
La construcción de la escala de Mc Farland y su equivalencia se dá en la siguiente

tabla:
Escala de BaCl2 al 1% H2SO4 al 1% Bacterias X 106
77
Mc Farland mL ML
1 0.1 9.9 300
2 0.2 9.8 600
3 0.3 9.7 900
4 0.4 9.6 1200
5 0.5 9.5 1500
6 0.6 9.4 1800
7 0.7 9.3 2100
8 0.8 9.2 2400
9 0.9 9.1 2700
10 1.0 9.0 3000
La suspensiones se pueden guardar de manera permanente en tubos con cierre

hermético, para utilizarse cada vez que se desee previa agitación.
La escala se puede utilizar de manera visual por simple comparación de la

suspensión de bacterias problema y obtener así un estimado de su concentración.
Pero también se puede hacer la lectura de la turbidez en un nefelómetro Klett
Summerson y determinar la concentración exacta, interpolando el valor en una
curva estándar construida a partir de los siguientes datos:
Unidades Klett Micoorganismos X 106/mL

53 300
97 600
150 900
195 1200
228 1500
262 1800

D. PREPARACION DE SUSPENSIONES DE ERITROCITOS DE CARNERO
Se describe la preparación de las suspensiones de eritrocitos de carnero que son

utilizadas en las técnicas de hemaglutinación indirecta y en la titulación de
amboceptor hemolítico anticarnero.
MATERIAL
1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL con tapón de rosca.
2 Tubos de centrífuga de plástico de 50 mL.
1 Probeta graduada de 100 mL.
1 Pipeta de 5.0 mL (1/10).
78
1 Pipeta de 10.0 mL (1/10).
1 Bulbo o propipeta.
1 Frasco tipo Vial de 100 mL
Refrigerador
23 mL Sangre de carnero.
27 mL Solución de Alsever estéril.
100 mL Solución salina isotónica 0.85%
150 mL Amortiguador:
Fosfatos 0.15 M pH = 7.2, para hemaglutinación indirecta
Veronal pH = 7.3-7.4, para titulación de amboceptor hemolítico
anticarnero
1. Tomar 23 mL de la sangre del carnero por punción de la yugular.

2. Recibir la sangre en un matraz Erlenmeyer conteniendo 27 mL de solución
de Alsever estéril y agitar suavemente.
3a. Para preparar una suspensión de eritrocitos de carnero para
hemaglutinación indirecta dejar que la sangre se estabilice en el Alsever
durante 3 ó 4 días, conservando el matraz en refrigeración a 4°C.
3b. Para preparar una suspensión de eritrocitos de carnero para titulación de
hemolisina (amboceptor hemolítico anticarnero), la sangre debe ser
fresca, cuando mucho de un día de tomados, de lo contrario las
reacciones pueden verse falseadas por la desnaturalización de los Ag de
los G.R.
4. Pasar la mezcla sangre-Alsever a tubos de centrífuga de 50 mL y
centrifugar a 3000 rpm durante 15 min.
5. Quitar el plasma sobrenadante por succión, evitando que el paquete de
G.R. se resuspenda.
6. Lavar los G.R. agregando 2 ó 3 veces su volumen de SSI, resuspender el
paquete perfectamente pero gentilmente con una pipeta con bulbo y
centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. Eliminar el sobrenadante por
succión.
7. Repetir el paso 6 dos veces más, pero en el último lavado utilizar el
amortiguador indicado para cada técnica, fosfatos 0.15 M pH = 7.2 para
hemaglutinación indirecta o veronal pH = 7.3-7.4 para titulación de
amboceptor hemolítico.
8a. Para hemaglutinación indirecta, preparar la suspensión de G.R. al 2.5%,
para ello, tomar 2.5 mL del paquete de G.R. lavados y llevar a un volumen
final de 100 mL con amortiguador de fosfatos 0.15 M pH = 7.2.
8b. Para titulación de amboceptor hemolítico , preparar la suspensión de G.R.
al 2%, para ello, tomar 2.0 mL del paquete de G.R. lavados y llevar a un
volumen final de 100 mL con amortiguador de veronal pH = 7.3-7.4.

79
E. MANEJO Y DESECHO DE MATERIAL BIOLÓGICO POTENCIALMENTE
INFECCIOSO
Se consideran materiales biológicos potencialmente infecciosos a aquellos que

puedan contener microorganismos o sus productos que sean capaces de causar
efectos nocivos a la salud y al ambiente. Entre ellos tenemos:
• Sangre y sus fracciones (plasma, suero y paquete globular)
• Cepas y cultivos de agentes infecciosos (bacterias, virus, parásitos, hongos)
• Productos biológicos: vacunas, sueros, reactivos biológicos de diagnóstico.
• Cadáveres, tejidos, órganos y fluidos corporales de origen animal.
• Equipo, material y objetos contaminados durante las prácticas.
• Equipos y dispositivos desechables utilizados en las prácticas: vendas,
gasas, algodones, guantes, cubre-bocas, hisopos, abate-lenguas, etc.
• Objetos punzo cortantes y materiales con sangre, así como recipientes de
muestras biológicas para análisis. Aquí se incluye: agujas hipodérmicas,
navajas, jeringas, bisturís, pipetas Pasteur, cubreobjetos y portaobjetos,
cajas Petri, tubos de ensaye y otro tipo de cristalería.
Para evitar que este tipo de materiales constituyan un riesgo para la salud y el
ambiente, se deberán tener las siguientes precauciones durante el desarrollo de
las prácticas.
1. Al iniciar la práctica limpiar la mesa de trabajo con una solución de hipoclorito

de sodio al 0.1%.
2. Utilizar bata, guantes y cubre-boca siempre que se maneje material
potencialmente infeccioso.
3. No comer, beber o fumar en el laboratorio.
4. No colocar mochilas, ropa, útiles escolares y otros artículos personales sobre
las mesas de trabajo cuando se esté utilizando material potencialmente
infeccioso.
5. No pipetear con la boca.
6. Esterilizar en autoclave a 121º C durante 15 min todo material no desechable
y equipo que haya estado en contacto con material potencialmente
infeccioso.
7. Cuando se trate de material o equipo que no sea esterilizable, aplicar
hipoclorito de sodio al 2% por lo menos durante 10 min.
8. Cuando sucedan derrames de material infeccioso sobre mesas de trabajo u
otras superficies aplicar hipoclorito de sodio al 2% durante 10 min.
9. Cuando se trate de material desechable contaminado desechar en los
recipientes destinados para tal efecto (ver tabla).
10. En el caso de desechos biológicos como tejidos, sangre, sueros, orina y
cualquier otro líquido corporal de origen animal, desechar en los
contenedores destinados para dicho fin (ver tabla). No tirar en las tarjas.
11. No almacenar por mucho tiempo en la gaveta material biológico
potencialmente infeccioso como cepas, cultivos, sangre, suero, etc.
12. Al finalizar la práctica limpiar la mesa de trabajo con la solución de hipoclorito
de sodio al 0.1%.
80
13. Lavarse las manos perfectamente con jabón y desinfectárselas al término del
ejercicio de laboratorio.
TIPO DE EJEMPLOS ESTADO ENVASADO COLOR

RESIDUO FÍSICO
Sangre y sus Líquido Recipientes Rojo
derivados Herméticos
Cultivos y Sólido Bolsas de Rojo
cepas de Polietileno
agentes
infecciosos
Patológicos Tejidos, órganos, muestras Sólido Bolsas de Amarillo
biológicas, cadáveres y partes polietileno
animales
Líquido Recipientes Rojo
Herméticos
Residuos Recipientes con sangre, Sólido Bolsas de Rojo
no anatómicos materiales de curación Polietileno
materiales deshechables,
materiales absorbentes Recipientes Rojo
utilizados en jaulas Herméticos
Objetos Tubos capilares, navajas, Sólido Recipientes Rojo
punzocortantes lancetas, agujas de jeringa rígidos de
deshechable e hipodérmica, polipropileno
de sutura, acupuntura,
tatuaje, bisturís, estiletes de
catéter
81
ANEXO II
PREPARACION DE REACTIVOS
1. SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA (SSI) 0.85%:

NaCl 8.5 g
Agua destilada 1 000 mL
2. SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA FORMOLADA AL 0.3% ESTÉRIL:

Solución salina isotónica 0.85% 992.5 mL
Formaldehído al 40% 7.5 mL
Esterilizar la SSI a 121°C durante 15 min. En condiciones de esterilidad

agregar el formaldehído.
3. SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA FORMOLADA AL 0.6% ESTÉRIL:

Solución salina isotónica 0.85% estéril 985 mL
Formaldehído al 40% 15 mL

agregar el formaldehído.
4. SOLUCION SALINA ISOTÓNICA FENOLDA AL 0.5 % ESTÉRIL:

Solución salina isotónica 0.85% estéril 995 mL
Fenol fundido 5 mL

agregar el fenol fundido.
5. ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND:

Aceite mineral (Nujol) 8.5 mL
Arlacel A 1.5 mL
Esterilizar la mezcla en autoclave 15 min a 15 lb de presión.
6. ADYUVANTE COMPLETO DE FREUND:

Aceite mineral (Nujol) 8.5 mL
Arlacel A 1.5 mL
M. smegmatis 5.0 mg
Esterilizar la mezcla de aceite mineral y Arlacel A en autoclave 15 min a

15 lb de presión. Agregar la micobacteria en condiciones de esterilidad.
82
7. SOLUCIÓN DE ALSEVER:
Glucosa 20.5 g
Citrato de sodio 8.0 g
Ácido cítrico 0.55 g
Cloruro de sodio 4.2 g
Agua destilada 1000 mL
Esterilizar a 10 lb de presión a temperatura de 121 °C por 10 min o por

filtración.
Se utiliza como anticoagulante y estabilizador de sangre de carnero.
8. SOLUCIÓN DE TIMEROSAL AL 10%:

Etilmercuritiosalicilato de sodio 10 g
Se usa como conservador en proporción de 0.1 mL por cada 100 mL de

suero.
9. SOLUCIÓN DE AZIDA DE SODIO AL 10%:

Azida de sodio 10 g
Se usa como conservador en proporción de 1.0 mL por cada 100 mL de

suero.
10. AMORTIGUADORES DE FOSFATOS (PBS):

SOLUCIONES STOCK:
Solución I: Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) 0.15 M:
Na2HPO4 21.3 g
Agua destilada c.b.p. 1000 mL
Solución II: Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) 0.15 M:

KH2PO4 20.4 g
Solución III: Cloruro de sodio (NaCl) 0.15 M:

NaCl 8.8 g
10.1 AMORTIGUADOR DE FOSFATOS SALINO (PBS) pH = 7.2, 0.15 M:

Solución I 76.0 mL
Solución II 24.0 mL
Solución III 100.0 mL
83
Se utiliza para la técnica de hemaglutinación indirecta, pero también
puede ser utilizado en las técnicas de inmunoprecipitación como el
Ouchterlony y el RID diluído 1:2 con agua destilada.
10.2 AMORTIGUADOR DE FOSFATOS SALINO (PBS) pH = 6.4, 0.15 M:

Solución I 32.3 mL
Solución II 67.7 mL
Solución III 100.0 mL
Se utiliza en la técnica de hemaglutinación indirecta.
11. AMORTIGUADOR DE VERONAL-ACETATO pH = 8.2 (MICHAELIS):

SOLUCIÓN CONCENTRADA µ = 0.15 pH = 8.2:
Barbital sódico 88.26 g
Acetato de sodio.3H2O 58.26 g
(ó Acetato de sodio anhidro 35.21 g)
Solución de timerosal al 10% 3.0 mL
Agua desionizada c.b.p 3 000 mL
Mezclar 800 mL de la solución de barbital-acetato con 960 mL de agua
destilada y ajustar el pH a 8.2 con solución 0.1N de HCl. La µ final es 0.15.
Solución de trabajo: Para tener una fuerza iónica de 0.05 y pH = 8.2 diluir
una parte de la solución concentrada con 2 partes de agua desionizada.
Se utiliza en la técnica de inmunoelectroforesis.
12. AMORTIGUADOR PARA COMPLEMENTO (VERONAL pH = 7.3-7.4):

SOLUCIÓN CONCENTRADA 5X:
NaCl 41.5 g
Barbiturato de sodio 5.095 g
HCl 17.29 mL
2+ 2+
* Solución de Mg y Ca 2.5 mL
* Solución de MgCl2 y CaCl2:
MgCl2.6H20 1.0 M 20.3 g
.
CaCl2 2H20 0.3 M 4.4 g
Para preparar la solución de trabajo diluir 1:5 y el pH debe ser 7.3-7.4

13. SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA AMORTIGUADA CON BORATOS:
Amortiguador de boratos pH 8.4-8.5
Ácido bórico 6.184 g
.
Bárax (Na2B407 10H2O) 9.536 g
NaCl 4.384 g
Agua destilada c.b.p 1000 mL
84
Para preparar la solución salina isotónica amortiguada, mezclar 400 mL de
este amortiguador de boratos con 8,000 mL de solución salina isotónica.
14. REACTIVO DE BIURET:

.
Tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6 4H2O) 9.0 g
.
Sulfato de cobre (CuSO4 5H2O) 3.0 g
Yoduro de potasio (KI) 5.0 g
Hidróxido de sodio (NaOH) 0.2 N libre
de carbonato c.b.p. 1000 mL
Colocar el tartrato en un matraz volumétrico de 1000 mL y disolver en

aproximadamente 400 mL de NaOH 0.2 N. Posteriormente disolver
sucesivamente el sulfato de cobre y el yoduro de potasio. Aforar con
NaOH 0.2 N y almacenar en una botella de polipropileno. El reactivo es
estable por un periodo indefinido de tiempo.
85
BIBLIOGRAFÍA
• Boyden, S.U. The adsorption of proteins on erithrocytes treated with tannic

acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera.
J. Exp. Med. 93:107-120 (1951).
• Coligan J. E., Kruisbeek A. M., Margulies D. H., Shevach E. M., Strober W.

Current Protocols in Immunology.
John Wiley and Sons. (1992).
• Figueredo M. A., Alvarez R., Puch C. Antígenos, Anticuerpos y sus

Interacciones.
Medicine 47:2999, 1988.
• Garvey, J.S., Cremer N.E. and Sussdorf D.H. Methods in Immunology.

3th. Ed., W.a. Benjamin, Inc. U.S.A. (1977).
• Harlow E., Lane D. Antibodies, a Laboratory Manual.

Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
• Hudson L. and Hay F.C. Practical Immunology.

3rd Ed. Blackwell Scientific Publications. Oxford, London (1992).
• Margni, R.A. Inmunología e Inmunoquímica.

4a. Ed., Editorial Médica Panamericana. Argentina (1989).
• Miller L., Ludke H., Peacock J., Tomar, R. Manual of Laboratory Immunology.
2nd Ed. Lea Febiger (1991).
• Paul W. E. Fundamental Immunology.

3rd Ed. Raven Press (1993).
• Rose, N.R. and Friedman H. El Laboratorio en Inmunología Clínica.

2a Ed., Editorial Médica Panamericana. Argentina (1984).
• Rowther Jr. ELISA, Theory and Practice. Methods in Molecular Biology,

volume 42, Human Press, Totowa, New Jersey, (1995).
• Schneider W., Berndt H. Inmunoelectroforesis.

Editorial Médica Panamericana. Argentina (1973).
• Stites, D.P. and Terr A.I. Inmunología Básica y Clínica.

9a. Ed., Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. México, (1998).
• Weir D.M. Handbook of Experimental Immunology.

3th. Ed. Blackwell Scientific Publications. Oxford, London (1986).
86

Manual de prácticas de inmunología general UAM

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual de prácticas de inmunología general UAM

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

POR MI

Saturnino de León Chapa Magdalena Acosta Segura

Inmunología General representa una de las asignaturas teórico-prácticas que

Si bien se trata de una disciplina en la que los avances científicos progresan a

El presente manual contiene los principales fundamentos y técnicas asociados a

Raúl Garza Velasco

UNIDAD 1. INMUNÓGENOS, ANTÍGENOS E INDUCCIÓN DE LA RESPUESTA

1. Preparación de inmunógenos y antígenos. 4

2. Inmunización de animales de laboratorio. 21

UNIDAD 2. INTERACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO (Ag-Ac)

3. Curva de precipitación cuantitativa en capilar. 33

4. Mezcla de antígeno y anticuerpo. 36

5. Doble difusión en placa (Ouchterlony) 38

6. Inmunodifusión radial simple (RID). (Mancini, Carbonara y Hermans) 41

7. Inmunoelectroforesis (IEF). (Grabar y Williams) 44

UNIDAD 3. REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

10. Hemaglutinación Indirecta. 55

UNIDAD 4. CITÓLISIS INMUNE

11. Titulación de Amboceptor Hemolítico Anticarnero. 62

UNIDAD 5. TÉCNICAS CON ANTICUERPOS MARCADOS

12. Ensayo inmunoenzimático 67

UNIDAD 6. PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS

13. Purificación fraccionada con sales neutras. 73

ANEXO I. TÉCNICAS DE APOYO 76

ANEXO II. PREPARACIÓN DE REACTIVOS 82

Actualmente, se ha establecido que una sustancia puede o no tener dos

Por tanto, se considera inmunógeno a toda sustancia capaz de inducir respuesta

- Ser reconocidas como extrañas por el animal inmunizado,

El concepto antígeno designa únicamente a aquella sustancia que reacciona con

Existen ciertas sustancias llamadas haptenos, que no reúnen todas las

La respuesta inmune de un animal a un inmunógeno puede ser un fenómeno

Pero también la respuesta inmune puede ser inducida artificialmente en un

Entre los inmunógenos y antígenos de mayor interés están:

Las aplicaciones que tiene el conocimiento de la preparación de estos productos

El objetivo de esta unidad es que el alumno vea ejemplificada la preparación de

En el presente ejercicio se van a preparar extractos de tejido muscular o bien

I.1.1 PREPARACIÓN DE UN EXTRACTO DE TEJIDO

40 g Tejido muscular de equino, pollo, perro, bovino, etc.

40 mL Sangre de humano, equino, bovino, porcino, etc.

NOTA: Si en lugar de suero se utiliza plasma, es necesario coagularlo con

I.2 ESTERILIZACIÓN DEL EXTRACTO DE TEJIDO O DEL SUERO

9 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso

Los métodos de purificación dependen de las propiedades fisicoquímicas de cada

BASADOS EN: MÉTODO

Estas prácticas se llevarán a cabo a partir de proteínas purificadas comerciales y

0.3 mL Albúmina sérica humana (ASH) comercial de 25% ó γ globulina humana

NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso

La preparación de antígenos e inmunógenos celulares tiene varias aplicaciones,

3 mL Solución de Alsever estéril

NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso

Para ejemplificar la complejidad del mosaico antigénico de las bacterias se

Antígenos somáticos u “O”: Son lipopolisacáridos que se encuentran formando

Antígenos flagelares o “H”: Son componentes de naturaleza proteica localizados

Antígeno de virulencia o “Vi”: Es también superficial, de naturaleza glucolipídica

Antígenos capsulares o “K”: Se encuentran en las envolturas o cápsulas de

Dentro de las aplicaciones más importantes de los antígenos bacterianos está la

Como inmunógenos, estas preparaciones son utilizadas en la formulación de

Durante la preparación de antígenos bacterianos es importante conocer el

Además, cuando se trabaja con bacterias y en general con microorganismos se

Brevemente, los procedimientos más relevantes para la obtención de estos

Contar con una cepa pura de la bacteria, propagarla en medios de cultivo