Universidad Mayor de San Andrs

Facultad de Ciencias Farmacuticas Y

Bioqumicas
Qumica Farmacutica

Validacin de Metodologas Analticas

Dra. Mara Luisa Daza Caldern

La Paz- Bolivia

Componentes de calidad de datos

analticos
Verificacin del CC (calibracin,
materiales de referencia)`

Pruebas de aptitud
del sistema

Calificacin de los
instrumentos analticos

Validacin de los
mtodos analticos

DEFINICIN
Es el establecimiento de la evidencia

documental de que un procedimiento

analtico conducir, con un alto grado de
seguridad, a la obtencin de resultados
precisos y exactos, dentro de las
especificaciones y los atributos de calidad
previamente establecidos

Cul es el objetivo de la validacin?

El objetivo de la validacin de un

procedimiento analtico es demostrar que es

apto para el propsito indicado.
ICH Guideline Q2A
Text on Validation of Analytical Procedures

Es el proceso por el cual se establece, por medio de

estudios de laboratorio, que las caractersticas de
desempeo de un procedimiento cumplen con los
requisitos para la aplicacin analtica prevista.
USP armonizado con la ICH

RAZONES PARA VALIDAR

Demostrar que los mtodos son
adecuados a los anlisis propuestos
en las condiciones descritas.
La validacin es la herramienta que
permite obtener las pruebas
documentales al respecto.
Trabajar con mtodos que ofrezcan
confianza y seguridad en los
resultados, minimiza el nmero
de fallas y repeticiones.

RAZONES PARA VALIDAR

Conocimiento del mtodo analtico.
Cumplir con las exigencias legales tanto de

(registros, BPL), con el fin de asegurar la

calidad y eficacia del producto.
La validacin es un requisito previo de los
procesos de transferencia de mtodos
analticos.

METODOLOGIA ANALITICA : JERARQUIA

TECNICA

General
METODO

PROCEDIMIENTO

Particular

PROTOCOLO

TECNICA

Es un principio cientfico que puede

ser til para suministrar informacin
sobre la composicin de una muestra

METODO

Es la adaptacin de una

tcnica para
un propsito especifico

 PROCEDIMIENTO

Un procedimiento consiste en
la informacin escrita necesaria
para
la correcta utilizacin de un
METODO

 PROTOCOLO :
Un PROTOCOLO es una serie de
direcciones precisas y definitivas que
deben seguirse si se quiere que los
resultados analticos se acepten para
un propsito especfico dado

Documentacin de la validacin
Protocolo de validacin

Realizacin de la validacin

Evaluacin de los resultados

analticos

Informe de validacin

Certificado de validacin

Documentacin de la validacin
Protocolo de validacin :

plan experimental que ejecutado

evidencia la validacin realizada

Objetivo
Responsabilidad
Factores crticos
Parmetros a evaluar y metodologa
Muestras
Instrumentos
Mtodos analticos
Criterios de aceptacin

... validacin
tcnica

vlido ?

mtodo
resultado
procedimiento

no vlido ?

protocolo

jr

Requisitos para la validacin de

mtodos analticos
La validacin de procedimientos analticos
requiere:

Instrumentos calificados y calibrados

Mtodos documentados
Patrones de referencia confiables
Analistas calificados
Integridad de la muestra

Documentados

Buenas prcticas de laboratorio

Las buenas prcticas de laboratorio ( BPL) son
indispensables durante todo el proceso analtico y
permiten garantizar la seguridad de los datos
obtenidos as como las decisiones que se puedan
tomar sobre la calidad de un producto

Buenas prcticas de laboratorio

Entorno de trabajo :
Organizacin funcional adecuada
Personal adiestrado suficiente
Instalaciones adecuadas y suficientes
Mtodos escritos disponibles, actualizados y
aprobados
Equipos e instrumentos apropiados, cualificados y en
buen estado de funcionamiento
Procedimientos adecuados de muestreo
Reactivos y soluciones valoradas apropiadas

JR

Buenas prcticas de laboratorio

Entorno de trabajo.

Material auxiliar apropiado en perfectas condiciones

de uso y material de vidrio volumtrico calibrado
Utilizacin de patrones y muestras de referencia correctas
Verificacin y supervisin de los resultados obtenidos
y mantenimiento de registros auditables
Informacin y comunicacin de los resultados obtenidos
Higiene y seguridad
Autoinspeccin

MTODOS ANALTICOS OFICIALES

Los mtodos de farmacopeas se consideran

oficiales.
Mtodos de Anlisis para Materias Primas.
Se consideran vlidos. No es necesario realizar
ninguna revalidacin a la hora de poner el
mtodo en marcha en cualquier laboratorio.
Estos mtodos han sido sometidos a ensayos
inter-laboratorios para confirmar su buen
funcionamiento.

MTODOS ANALTICOS OFICIALES

Mtodos de Anlisis para FF.
FF

de composiciones diferentes a nivel

cualitativo (excipientes) y/o cuantitativo.
El mtodo se considera parcialmente validado
(con el consiguiente ahorro de costes en el
desarrollo del mtodo).
Se evala que parmetros son necesarios validar
(de acuerdo al mtodo), siendo la exactitud y la
selectividad los parmetros ms frecuentemente
afectados.

MTODOS ANALTICOS OFICIALES

Ajustes en mtodos cromatogrficos:

Es posible a la hora de seguir un mtodo cromatogrfico
ajustar algn parmetro. Por Ej:
p H del tampn +/- 0.2 unidades
Concentracin de sal en el tampn +/- 10%
Composicin de la fase mvil: no puede exceder en un 10%
Longitud de onda: no se puede modificar +/- 3 nm
Longitud de la columna: puede ajustarse hasta un 70%
Dimetro interno de la columna : hasta un 25 %
Tamao de partcula: puede reducirse hasta un 50 %
Flujo: puede ajustarse hasta un 50 %
Volumen de inyeccin: +/- 10 %
Temperatura: +/- 10 %
(Farmacopea USP)

MTODOS ANALTICOS NO OFICIALES

Mtodos desarrollados por el laboratorio, usados

por algn tiempo, deben sufrir un proceso de

validacin.
Para validar de manera satisfactoria y sin el uso de
recursos innecesarios, es necesario contar con
mtodos lo suficientemente robustos.
Para lo cual todo mtodo analtico no oficial debe
seguir una secuencia lgica de fases en su
desarrollo, que oriente a una validacin exitosa.

Etapas para desarrollar un mtodo

analtico
1

2 DEFINIR LAS CONDICIONES

El equipo
Los reactivos
El muestreo

3 DESARROLLAR EL METODO

Encontrar las condiciones ptimas

Estandarizar el mtodo
Prctico : tiempo,
recursos
4

VALIDAR

Idneo: preciso, exacto

Fiable

DESARROLLO DE MTODOS ANALTICOS

La secuencia ptima de experimentos necesarios
para el desarrollo de un mtodo, depende del mtodo
en si mismo.
El desarrollo lgico de un mtodo analtico transcurre
con las siguientes fases secunciales:
1. Definicin de las caractersticas de practicabilidad.
2. Estudios de robustez y estabilidad de la muestra
preparada para anlisis.
3. Puesta a punto (aptitud del sistema en HPLC).
Estandarizacin
4. Caractersticas de fiabilidad. Validacin

ESTUDIO DE ESTABILIDAD DE LA MUESTRA

PREPARADA PARA EL ANLISIS
La estabilidad de las disoluciones de la muestra
despus de su preparacin segn el mtodo de anlisis
debe ser evaluada de acuerdo al tiempo requerido para
su realizacin.
Debe demostrarse la estabilidad de la muestra y el
patrn preparados .
En caso de que la estabilidad pueda afectar el resultado
en el perodo de tiempo evaluado, se ha de ser constar
en el mtodo de anlisis.

DETERMINACIN DE ESTABILIDAD DE LA
MUESTRA
Se prepara suficiente cantidad de una muestra homognea

y se almacena en diferentes condiciones ambientales

(mnimo 3 rplicas)
Tiempo

Condiciones
Normales

T emp
40 C

Luz solar
directa

Oscuridad

0 horas
1 hora
2 horas
4 horas
18 horas

Los resultados pueden ser graficados (grfica de control)

IDONEIDAD DEL SISTEMA APTITUD DEL SISTEMA

Consiste en un conjunto de ensayos que permiten

comprobar en el momento de utilizacin del mtodo, que

el sistema, (equipo, sistema electrnico, analista , reactivos,
muestras ) proporcionan seguridad para llevar a cabo la
determinacin.
El test de idoneidad se considera como parte integrante del
procedimiento de anlisis y requisito previo a su
realizacin.
Proporciona la seguridad de que el conjunto del sistema
continua siendo vlido
Las pruebas de idoneidad han de ser entendidas como
parte integrante del procedimiento y su realizacin es un
paso previo a la aplicacin rutinaria del mtodo.
El mbito de aplicacin es en todas la tcnicas analticas

DETERMINACIN IDONEIDAD DEL SISTEMA

Los parmetros de evaluacin de los ensayos de
idoneidad se pueden agrupar en tres categoras:
- Precisin

- Parmetros cromatogrficos:
Factor de capacidad (K)
Nmero de platos tericos (N)
Factor de asimitra o de cola
Resolucin (R)
-Lmites de deteccin o cuantificacin

DETERMINACIN IDONEIDAD DEL SISTEMA

PRECISIN: Se evala mediante la determinacin
del CV de una serie de replicados de la muestra , es el
parmetro de mayor aplicacin para evaluar la
idoneidad . Habitualmente se estudia sobre el rea del
pico

DETERMINACIN IDONEIDAD DEL SISTEMA

PARMETROS CROMATOGRFICOS:
Factor de capacidad: K se interpreta como el nmero
de volmenes de fase mvil necesarios para eluir un
compuesto despus del volumen inicial contenido en
la columna (to)

K = (tr-to) / to
Valores bajos de K indican que el pico eluye puy prximo
al frente de solvente , pudiendo verse comprometida la
selectividad. Son recomendables valores superiores a 1,
lo ptimo son valores mayores a 2

DETERMINACIN IDONEIDAD DEL SISTEMA

Nmero de platos tericos: N es una medida de la
eficacia del sistema cromatogrfico

N 16(tn / wtan )

El N depende del tiempo de elucin , se recomienda

que sea mayor a 2000. Este parmetro tiene especial
inters en la prueba de idoneidad del sistema donde
existe un solo pico de inters dentro del
cromatograma.

DETERMINACIN IDONEIDAD DEL SISTEMA

DETERMINACIN IDONEIDAD DEL SISTEMA

Factor de asimetra o de cola: un pico perfectamente
simtrico tendr un factor de cola de 1,como norma
general el factor de asimetra debera encontrarse entre
0.8 y 1.5 aunque pueden aceptarse valores de 2.

FA= W0.05% / 2 F
Posibles causas de asimetra:
Muestra sobrecargada, disolvente no apropiado o mal

inyectado
Volumen vacio o suciedad en la columna
Envejecimiento de la columna
p H de la fase mvil

DETERMINACIN IDONEIDAD DEL SISTEMA

Factor de asimetra o de cola

DETERMINACIN IDONEIDAD DEL SISTEMA

Resolucin: R es la medida de separacin entre 2
picos, este parmetro resulta muy til para controlar el
comportamiento de posibles interferencias, es
deseable una R mayor a 2

DETERMINACIN IDONEIDAD DEL SISTEMA

Lmites de deteccin o cuantificacin:

Que puede ser til para confirmar la consecucin de

un determinado lmite de cuantificacin o de
deteccin, para comprobar la capacidad de
cumplimiento Por Ej para analizar niveles bajos de
impurezas.
Por la naturaleza de este parmetro su aplicacin ser
de eleccin en cualquier mtodo , cromatogrfico o no,
utilizado para la determinacin de impurezas

TIPOS DE VALIDACION
Prospectiva : proceso de validacin para
metodologas nuevas
Retrospectiva : para mtodos utilizados a
diario no validados anteriormente y de los
cuales se dispone de suficiente documentacin
para probar la bondad del mtodo

TIPOS DE VALIDACION...
Revalidacin : repeticin total o parcial de una
validacin, por la introduccin de algn cambio que
se espera afecte la bondad de un mtodo ya validado
Aplicacin: Demostrar que el mtodo sigue vlido
- Cambios en la muestra
- Cambio de instrumentos o materiales
- Modificaciones de parmetros analticos
Procedimiento: La revalidacin est determinada
por el criterio , experiencia y conocimiento del
mtodo del analista, siendo fundamental que est
justificada y documentada adecuadamente.

Caractersticas de fiabilidad
Especificidad (USP) Selectividad (IUPAC,AOAC)
Linealidad Rango

Precisin:

Repetibilidad Instrumental y del Mtodo

Precisin Intermedia
Reproducibilidad

Exactitud
Lmite de Deteccin

Lmite de cuantificacin
Robustez

Diferentes clases de ensayos analticos

Clase A: Para establecer identidad
Clase B: Para detectar y cuantificar

impurezas
Clase C: Para determinar

cuantitativamente la concentracin
Clase D: Para evaluar las

caractersticas, disolucin,
uniformidad de contenido
Clasificacin OMS (Inf. 32, Anexo 5 Validacin de
mtodos analticos)

Parmetros requeridos para la Validacin OMS

Caracterstica

A
Identificacin

lmite

cuantitativa

lmite
cualitativa

Cuntitativ
as

caractersticas

Exactitud

X*

Precisin

Robustez

Linealidad e intervalo

Especificidad selectividad

Lmite de deteccin

Lmite de cuantificacin

X
X

X
X

Categoras A,B,C,D segn OMS, La USP las clasifica como categora I, II, III, IV

Datos Requeridos para la

Validacin USP 36

Categoras para la Validacin

Categora I-Procedimientos analticos para la
cuantificacin de los componentes principales de
frmacos a granel o ingredientes activos (incluyendo
conservantes) en productos farmacuticas terminados.
Categora II-Procedimientos analticos para la
determinacin de impurezas en frmacos a granel o
productos de degradacin en productos farmacuticos
terminados. Estos procedimientos incluyen anlisis
cuantitativos y pruebas de lmite.

Categoras para la Validacin

Categora III- Procedimientos analticos para la
determinacin de las caractersticas de desempeo
(p.ej., disolucin, liberacin de frmacos, etc.).
Categora IV-Pruebas de identificacin.

Especificidad / Selectividad
La capacidad de un mtodo para determinar el analito
sin interferencias de impurezas, productos de
degradacin, excipientes u otras sustancias presentes
en la muestra, se relaciona con el trmino selectividad.
SELECTIVIDAD: Capacidad de un mtodo analtico
para medir y/o identificar simultnea o
separadamente los analitos de inters, de forma
inequvoca, en presencia de otras sustancias qumicas
que puedan estar presentes en la muestra

Especificidad

Identificacin. Se debe demostrar que el mtodo funciona en

presencia de otras sustancias que puedan interferir y de otros
compuestos relacionados.

Pureza. Se debe demostrar que el mtodo analtico permite

evaluar las impurezas que se pretenden analizar cuali o
cuantitativamente (LOD, LOC).

Cuantificacin. Cuando se determina la pureza de una materia

prima o el contenido de un principio activo u otro componente en
un medicamento, se debe asegurar que la seal observada procede
nicamente del analito sin ninguna interferencia de excipientes,
productos de degradacin y/o impurezas.

Determinacin
En el estudio de la especificidad, se comparan los
resultados del anlisis de muestras con y sin analito, en
presencia o ausencia de impurezas, productos de
degradacin, sustancias relacionadas y/o excipientes.
La eleccin de la concentracin podra ser la terica de
trabajo para el principio activo y las interferencias a su
lmite permitido, puede evaluarse a partir del anlisis
de 6 rplicas y el grado de discrepancia entre las
determinaciones en presencia o ausencia de las
posibles interferencias, mediante la frmula siguiente:

Determinacin
1)

( Di D s )
% discrepancia
*100
Ds

Donde:
Di = respuesta media con interferencia
Ds = respuesta media sin interferencia

2) Tambin seria de aplicacin una prueba t de Student para

comprobar la existencia o no de diferencias significativas
entre los dos grupos. En mtodos muy precisos puede
presentarse diferencias significativas cuando realmente la
influencia de las interferencias es aceptable, en este caso se
determina intervalo de confianza de la diferencia
3 ) Determinacin de espectros de absorcin molecular :

espectrofotometra
Tiempos de retencin estandar y muestra: HPLC
adicionando % de cada posible interferencia (excipiente o
auxiliar de formulacin)

Espectro de Absorcin

A
b
s
o
r
b
a
n
ci
a

ESTANDAR

MUESTRA + EXCP

l Max
Longitud de onda (nm)

Especificidad para Tcnicas

Separativas
HPLC
Resolucin entre Picos
Nmero de Platos
Tericos(Eficiencia)

PARAMETROS CROMATOGRAFICOS

SELECTIVIDAD PARA TECNICAS

SEPARATIVAS (HPLC)

Parmetros de un Cronograma

Parmetros de un Cronograma

Selectividad en Tcnicas Separativas

HPLC,GS, Tecnicas Separativas
Tiempo de Retencion

Tiempo Cero
t0

Pico 1
t1
0,72

Base de Pico

Pico 2
t2
1,788

W1

9,289
W2

0,07
Resolucion entre Picos
R=(tn+1-tn)/(1/2(Wn+1+Wn))
Numero de Platos Teoricos
N=16(ti/Wi)2
Conclusion de la Resolucion
Conclusion de la Eficiencia
Conclusion del Metodo para el Pico

R(1,2)

14,99
W3

0,2397
R(2,3)

48,44042622
N1

Pico 3
t3

0,3498
R(3,4)

19,3418151
N2

-85,70611778
N3

10439,00082
24028,23332
29382,1545
Resolucion Aceptable Resolucion Aceptable Resolucion no Aceptable
Eficiencia Aceptable Eficiencia Aceptable Eficiencia Aceptable
Cafeina
Acido Acetilsalicilico Acido Salicilico

Ejemplo 1 MTODOS NO SEPARATIVOS

Valoracin volumtrica de unos comprimidos, se
preparan 6 muestras de un placebo cargado (principio
activo mas matriz)y 6 de principio activo solo, se
valoran por el procedimiento descrito
Determinacin
Pricipio activo + Excp principio activo
1

16.15

15.90

2
3
4
5
6

16.10
16.00
16.10
16.15
16.10

15.90
15.85
15.90
15.95
15.90

Comprobar el grado de discrepancia y el estadstico t de Student

1. Calcular los siguientes parmetros:

PARAMETRO

P.a+ Excp

P.A

16.1

15.9

DESVIACION
ESTANDAR

0.0547

0.0316

COEFICIENTE
DE VARIACION

0.34%

0.199%

PROMEDIO

2. Calcular porcentaje de Discrepancia:

( Di D s )
%D
*100
Ds

Donde:
Di = respuesta media con interferencia
Ds = respuesta media sin interferencia

Para PFT 2 %
Para impurezas 4 a 5 %

3. Prueba t de student
Para varianzas homogneas.
1. Calcular una estimacin conjunta de la S a partir de las S
individuales

nn 1s 2A nb 1sB2
nA nB 2

2. Calcular t experimental:

x A xB
t
1
1
s

nA
nB
3. Interpretacin de la Hiptesis:

H0: Xa=Xb

Hi: Xa Xb

ts= t calculado o t expresado

tt= valor de tabla de t student
ts> tt: se rechaza la Ho
para una p=0.05 y GL= nA+nB-2 y el resultado es que XaXb
tt= 2.23

4. Cuando se rechaza Ho, se estudia la

Magnitud de la desigualdad y su I.C
DETERMINACION

P.a+ Excp

P.a SOLO

PROMEDIO

16.1

15.9

ESVIACION
ESTANDAR

0.05477

0.03162

NUMERO DE
DETERMINACIONES

1. Calculo de la diferencia entre medias.

2. Error Estndar Combinado:

3. Intervalo de Confianza del 95% para la diferencia entre medias:

ts= t calculado o t expresado

tt= valor de tabla de t student
para una p=0.05 y GL= nA+nB-2
tt= 2.22

Con una confianza del 95% la

solucin valorante del p.a +
excp se sita entre 0.14 y 0.26

Linealidad y Rango
La linealidad es la capacidad del mtodo para
proporcionar resultados que son directamente
proporcionales a la concentracin del analito en la
muestra dentro de un rango establecido.
Siempre que sea posible se buscar una respuesta de
tipo lineal que facilite su trazado, interpolacin e
interpretacin.
El Rango se define como el intervalo entre la
concentracin superior e inferior de analito para el
cual se ha demostrado precisin, exactitud y linealidad
del mtodo descrito

mbito de aplicacin
Se recomienda estudiar la linealidad en todos los
mtodos de tipo cuantitativo :
Valoracin del contenido del principio activo: productos 90110%, materia prima 99-101% las ICH 80-120%
Uniformidad de Contenido: las especificaciones son 85-115%,
se recomienda evaluar entre 70 -130%
Velocidad de Disolucin: se establece un rango de Q+/-20%
Cuantificacin de impurezas: basado en el perfil toxicolgico
de la impureza y la dosis mxima del frmaco en cuestin.
La linealidad debe cubrir el rango desde el lmite de
cuantificacin 50% hasta el 120% del valor nominal de dicho
principio activo

Linealidad
Dos tipos de estudios de linealidad:
Linealidad del Sistema, donde se realizan los

ensayos con la presencia nica del analito.

Linealidad del Mtodo, en la cual los ensayos se

realizan en presencia del analito y la matriz

correspondiente

Determinacin
Se recomienda 5 niveles de concentracin y analizar por

triplicado (n=15) Ej: 80, 90, 100, 110 y 120 % del contenido
terico. Estadsticamente lo correcto es analizar las muestras
de forma aleatoria, pero, se establece como criterio prctico
analizarlas en sentido creciente de concentracin.
Lo ideal es hacer pesadas independientes (para preparar las
diferentes concentraciones), ya que a s se elimina el posible
error sistemtico que se podra arrastrar partiendo de una
sola pesada.
No obstante, se acepta una pesada madre y posteriores
diluciones si se asegura una precisin y exactitud en la
pesada madre y en las posteriores diluciones.

Estimadores de la regresin
1. Coeficiente de correlacin r: evala el ajuste al
modelo lineal propuesto y es una medida de la
cercana de las observaciones a una lnea recta.
2. Ordenada al origen a: evala la proporcionalidad
de la funcin analtica. Es una medida del error
sistemtico potencial del mtodo.
3. Pendiente b: constituye una medida de la
sensibilidad del mtodo
4. Coeficiente de determinacin r2 : relacin entre la
variacin explicada, definida por un modelo de ajuste
y la variacin total

Anlisis de Regresin

y
b

bx

Coeficiente de Determinacin
y

. .

.
.

. .

alto

bajo

y
y

r2= 1
x

.
x

x
y

. .
.
. .
y
r2
x

Valores para r :

principios activos

0.997

impurezas

0.980

productos biolgicos

0.950

I. LINEALIDAD DEL SISTEMA

Se efectu la cuantificacin de acetoaminofeno
estndar secundario puro por duplicado.
CONC. ug/ml

RESPUESTA

3.5

0.278

3.5

0.224

6.5

0.408

6.5

0.406

10.0

0.620

10.0

0.628

11.5

0.711

11.5

0.722

13

0.797

13

0.796

Determinar los siguientes valores:

a= Intercepto
b= Pendiente
r= Coeficiente de correlacin
r= Coeficiente de determinacin.
y= Sumatoria de las Resp. Instrum.
y = Sumatoria del cuadrado
x= Sumatoria de los valores de Conc.
p/c Resp.
x = Sumatoria al cuadrado de los
valores de Conc. p/c Resp.
xy= Sumatoria del producto d los
valores de Conc p/c Resp. Instrumental
por la Resp. Instrumental.
n= N total de respuestas

a= 0.0398
b= 0.0583
r= 0.9975
r= 0.9950
y= 5.59
y =3.53
x= 89

x = 911.5
xy= 56.7165
n= 10

1. Determinar la Ec. de la Recta:

2. Limites de confianza para la pendiente (b):

a. clculo de la varianza de la desviacin alrededor

regresin o error de regresin.

de la

b. Calculo de la desviacin estndar de la pendiente (Sb).

c. Clculo de los limites de confianza de la pendiente (b).

t= valor de tabla de t
student para una
p=0.05 y GL= n-2
t= 2.306

3. Efectuar el test de hiptesis para la pendiente (b):

Demostrar que b es significativamente diferente de cero.

H0: b = 0

ts= t calculado o t expresado

tt= valor de tabla de t
student para una p=0.05 y
GL= n-2
tt= 2.306

Hi: b0

ts> tt: se rechaza la H0

y el resultado es que b0

4. Limites de confianza para el intercepto (a):

a. Clculo de la desviacin estndar del intercepto (Sa).

b. Clculo de limites de confianza para el Intercepto (Sa).

t= valor de tabla de t
student para una p=0.05
y GL= n-2
t= 2.306

5. Efectuar el test de hiptesis para el Intercepto (a):

Demostrar que a no es significativamente diferente de cero.

H0: a = 0

ts= t calculado o t expresado

tt= valor de tabla de t
student para una p=0.05 y
GL= n-2
tt= 2.306

Hi: a0

ts> tt: se rechaza la H0

y el resultado es que a0

6. Efectuar el test de H para la Regresin en

funcin al coeficiente de correlacin (r):
Demostrar que hay correlacin entre x e y

H0: No hay correlacin x e y

Hi: Hay correlacin x e y

tr= tr calculado
tt= valor de tabla de t
student para una p=0.05 y
GL= n-2
tt= 2.306

tr> tt: se rechaza la H0;

existe una correlacin
significativa entre x /y

7. ANALISIS DE VARIANZA (Regresin lineal):

a. Determinar los siguientes valores (Sxy; Sxx).

b. Suma de Cuadrados de la regresin (SCr).

c.

Suma de Cuadrados del Error Puro (SCep).

Determinar los siguientes valores:

yj= Sumatoria de las 2 respuestas

p/c Concentracin.
yj

yj p/c Conc. (yj)

yj 1

0.502

0.2520

yj 2

0.814

0.6626

yj 3

1.248

1.5575

yj 4

1.433

2.0535

yj 5

1.593

2.5376

yj Total

5.59

7.063

m= N de replicas para cada concentracin.

m=2

d.

e.

Suma de Cuadrados entre Concentraciones (SCec).

Suma de Cuadrados para el Desvo de la Linealidad (SCl).

f.

Tabla de Anova.

K= N de Concentraciones. K=5
Fuente De Grados de
Variacin libertad
(gl)
Fv

Suma de
cuadrados
(SC)

Fs= Valor de F calculado

Cuadrado medio
(CM)

Fs

SCr

SCr/gl

CM/Cmep

K-2

SCl

SCl/gl

CM
/CMep

n-k

SCep

SCep/gl

Regresin

Linealidad
Error Puro

Ft

1.
ANOVA PARA LA REGRESION:
Valor de tabla F de Snedecor, para un gl para el numerador y (n-k=5), 5 gl para el
denominador, con una probabilidad p=0.05

Fs>>Ft
2. ANOVA PARA LA LINEALIDAD:
Valor de tabla F de Snedecor, para (k-2=3), 3 gl para el numerador y (n-k=5),5 gl para
el denominador, con una probabilidad p=0.05

Fs<Ft

f.

Tabla de Anova.

K= N de Concentraciones. K=5
Fuente De Grados de
Variacin libertad
(gl)
Fv

Suma de
cuadrados
(SC)

Fs= Valor de F calculado

Cuadrado medio
(CM)

Fs

Ft

Regresin

SCr

0.4064

SCr/gl

0.4064

CM/Cmep

1353.33

6.61

Linealidad

K-2

SCl

1*10

SCl/gl

3.33*10

CM
/CMep

1.11

5.41

Error Puro

n-k

SCep

1.553*10

SCep/gl

3.1*10

1.
ANOVA PARA LA REGRESION:
Valor de tabla F de Snedecor, para un gl para el numerador y (n-k=5), 5 gl para el
denominador, con una probabilidad p=0.05 y Ft=6.61

Fs>>Ft por lo tanto, la regresin es estadsticamente representativa

2. ANOVA PARA LA LINEALIDAD:
Valor de tabla F de Snedecor, para (k-2=3), 3 gl para el numerador y (n-k=5),5 gl para
el denominador, con una probabilidad p=0.05 y Ft=5.41

Fs<Ft por lo tanto, la falta de ajuste no es representativa

8. Lmites de confianza para la recta de Regresin:

a. Determinar el valor de la respuesta encontrada por ajuste por

mnimos cuadrados (y) para cada valor de (x).
Xi Conc.

Yi Resp.

3.5

0.244

6.5

0.419

10.0

0.623

11.5

0.710

13.0

0.798

Calcular Yi con la Ecuacin de

la recta.

b. Determinar la Raz cuadrada de la varianza de la Desviacin

alrededor de la Regresin o error de regresin (Sxy)

c. Determinar el valor de la tabla de T Student para una

probabilidad p=0.05 y GL= (n-1)
GL= 10-1= 9

para un Tt= 2.261

d. Determinar los Lmites de Confianza:

Calcular Y para cada Y (Resp.)

Xi

3.5

0.2607

0.2374

6.5

0.4282

0.4092

10.0

0.6309

0.6147

11.5

0.7199

0.7004

13.0

0.8097

0.7857

Hiprbolas de Confianza

Relacin entre exactitud y precisin

inexacto e
impreciso

Exacto y preciso
preciso
pero
inexacto

Exacto pero
impreciso

Precisin
La precisin expresa el grado de concordancia o grado
de dispersin entre una serie de medidas de tomas
mltiples a partir de una misma muestra homognea .
La procedencia de las muestras pueden ser muestras
reales o preparadas en el laboratorio.
El objetivo del estudio es conocer el mas o menos o la
variabilidad del mtodo de ensayo.

La precisin engloba diferentes tipos de estudios:

Repetibilidad(Instrumental y del mtodo)
Precisin intermedia
Reproducibilidad

Precisin
Repetibilidad: estudia la variabilidad del mtodo

efectuando una serie de anlisis sobre la misma muestra

en las mismas condiciones: un mismo analista, con los
mismos aparatos y reactivos, mismo laboratorio, y
mismo dia.
Precisin intermedia: estudia la variabilidad del
mtodo efectuando una serie de anlisis sobre la misma
muestra pero en condiciones operativas diferentes:
diferentes analistas, aparatos, dias, y en un mismo
laboratorio
Reproducibilidad: estudia la variabilidad del mtodo
bajo condiciones operativas diferentes y en distintos
laboratorios.

Repetibilidad
Repetibilidad Instrumental.
Estudia

la variabilidad debida nicamente al

instrumento.
Se prepara suficiente cantidad de una muestra a
concentracin nominal que contenga slo el analito.
Se realiza por lo menos 6 a 10 medidas consecutivas de
la misma muestra (respuestas del instrumento).
Se determina el coeficiente de variacin (CV) de las 6 a
10 medidas el CV menor a 2 % para especialidades
farmacuticas

EJEMPLO
Anlisis realizado por HPLC
No de inyecciones
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Area media
CV (%)

Areas
3503
3517
3510
3504
3506
3504
3506
3504
3509
3507
3507
0.12

Para
especialidades
farmacuticas y
materia prima
suelen aceptarse
valores inferiores
al 1 2 %

Repetibilidad
Repetibilidad del Mtodo.
Determina la repetibilidad de todo el proceso de

anlisis (desde la pesada y preparacin de la muestra

hasta el resultado final del anlisis).
Se prepara un mnimo de 6 muestras por separado, a la
concentracin nominal, a partir de una muestra
(analito + matriz) , un mnimo de 3 muestras a 3
niveles de concentracin (total 9 muestras)
Se realiza las medidas correspondientes por el mismo
instrumento y el mismo analista, y se determina el
coeficiente de variacin (CV).

Precisin
La precisin de un mtodo analtico se

expresa generalmente como el coeficiente de

variacin (CV) de una serie de medidas y se
calcula matemticamente de la siguiente
manera:

S
CV (%) *100
X

Taller de Repetibilidad del mtodo

concentracin nominal respuesta ( A)
500
0,604
500
0,61
500
0,599
500
0,613
500
0,609
500
0,611
Promedio
Desv Estandar
CV

Taller de Repetibilidad del mtodo

concentracin nominal
500
500
500
500
500
500
Promedio
Desv Estandar
CV

respuesta ( A)
0.604
0.61
0.599
0.613
0.609
0.611
0.607666667
0.004749269
0.781558247

Precisin intermedia
IFAs y PFT
Especificacion Farmacopeica(%) n=1
n=2
99,0-101,0
0,39
98,5-101,5
0,58
98,0-102,0
0,78
95,0-105,0
1,94
90,0-110,0
3,88
85,0-115,0
5,81

Cv(%) Maximo Aceptable

n=3
n=4
0,55
0,67
0,82
1,01
1,1
1,34
2,74
3,36
5,48
6,71
8,22 10,07

n=5
0,78
1,16
1,55
3,88
7,75
11,63

0,87
1,3
1,73
4,33
8,67
13

II. PRECISION INTERMEDIA)

PLACEBO
%C

ANALISTA

ENSAYO

DIA 1

DIA 2

DIA 3

1
2
3

51.59
49.16
47.27

52.27
49.41
53.35

49.86
47.37
48.00

1
2
3

50.51
52.02
51.11

49.07
50.69
50.67

51.48
53.62
50.25

1
2
3

98.82
97.81
97.88

102.92
101.71
101.42

97.96
98.28
101.57

1
2
3

100.40
102.43
100.99

104.52
103.74
103.42

102.28
102.89
101.09

1
2
3

108.25
108.65
107.43

109.98
110.81
111.78

106.60
107.97
107.11

1
2
3

112.59
110.79
110.41

113.31
116.84
113.00

111.57
110.63
107.83

50%

100%

110%

1.Taller P. INTERMEDIA
INSTRUMENTO

ANALISTA

ENSAYO

DIA 1

DIA 2

DIA 3

1
2
3

X= 49.34
DS= 2.16
CV= 4.37

X= 51.67
DS= 2.03
CV= 3.93

X= 48.41
DS= 1.29
CV= 2.67

1
2
3

X= 51.21
DS= 0.76
CV= 1.48

X= 50.14
DS= 0.93
CV= 1.85

X= 51.78
DS= 1.70
CV= 3.29

1
2
3

X= 98.17
DS= 0.56
CV= 0.57

X= 102.01
DS= 0.79
CV= 0.71

X= 99.27
DS= 1.99
CV= 2.01

1
2
3

X= 101.3
DS= 1.02
CV= 1.01

X= 103.9
DS= 0.56
CV= 0.54

X= 102.08
DS= 0.91
CV= 0.89

1
2
3

X= 108.11
DS= 0.57
CV= 0.62

X= 110.85
DS= 0.90
CV= 0.81

X= 107.2
DS= 0.69
CV= 0.64

1
2
3

X= 111.26
DS= 1.16
CV= 1.04

X= 114.38
DS= 2.13
CV= 1.86

X= 110.01
DS= 1.94
CV= 1.77

Precisin
Intermedia

X=
50.43
DS=
1.84
CV=
3.65
X=
101.12
DS=
2.15
CV=
2.13
X=
110.31
DS=
2.65
CV=
2.4

REPETIBILIDAD:
DETERMINAR
COEFICICIENTE
DE VARIANZA DE
CADA TRIPLICADO
EFECTUADO
PARA CADA
CONCENTRACION
P INTERMEDIA:

DETERMINAR
COEFICICIENTE
DE VARIANZA DE
18 DATOS
EFECTUADOS
PARA CADA
CONCENTRACION

EXACTITUD
La exactitud de un procedimiento analtico expresa la
proximidad entre el valor que es aceptado
convencionalmente como valor verdadero y el valor
experimental encontrado.
Concordancia entre el valor determinado y el valor
verdadero.
Generalmente la recuperacin del analito agregado
sobre un intervalo de concentraciones se toma como
medida de exactitud

GENERALIDADES
No deben confundirse exactitud y precisin.
La precisin esta relacionada con la dispersin de una
serie de mediciones pero no da ningn indicativo de lo
cerca que est del valor verdadero.
Se puede tener mediciones muy precisas pero poco
exactas, sin embargo, para que un mtodo sea exacto se
requiere un cierto grado de precisin.
No siempre se obtienen valores de recuperacin
cercanos al 100 %, ya que esta depende de la matriz
de la muestra, de la efectividad del mtodo de
preparacin y extraccin, y de la concentracin del
analito.

GENERALIDADES
Aplicacin.
Valoracin en materia prima
Valoracin en producto acabado
Cuantificacin de impurezas
Determinacin.
La exactitud debe demostrarse en todo el rango
especificado para el mtodo analtico, se debe realizar
como mnimo 9 determinaciones, sobre 3 niveles de
concentracin del analito, por Ej. 3 determinaciones por
3 niveles de concentracin , que podran ser la
concentracin central y las concentraciones en los
extremos del rango.

DETERMINACION
En funcin del tipo de mtodo a validar y de cada caso
concreto se deber tener en cuenta el rango de
concentraciones de trabajo:
Riqueza de un pa en materia prima o en producto
acabado.80-120%
Impurezas: desde el 50% hasta 120%
Ensayo de disolucin: si se trata de un producto de
liberacin inmediata Q +/- 20%, si se trata de un producto
de liberacin controlada sobre cada lmite de disolucin en
cada perodo de tiempo se aplicar +/- 20 %
La exactitud se expresa en % de recuperacin

III. EXACTITUD
%C
terico

C1

C2

C3

PRO

MEDIO

50

50.27

50.91

50.09

50.42

0.43

0.18

100

99.73

102.95

100.68

101.12

1.66

2.75

110

109.69

112.62

108.62

110.31

2.07

4.29

1. Determinacin del % de Recuperacin

Determinar %R para cada
concentracin:
Limites de %R: entre 97% - 103%

2. Test G de Cochran
Gs= G calculado
Gt= valor de tabla para una
p=0.05 ; n=3 ; k=3
Gt= 0.7977

Gs<Gt por lo tanto, los S de las 3

concentraciones son equivalentes; el
factor concentracin no influye en la
variabilidad de los resultados

2. Prueba de T de Student
Expresar los resultados como %R.
%C terorico

C1

C2

C3

50

100.54

101.82

100.18

100

99.73

102.95

100.68

110

99.71

102.38

98.74

Recuperacin media n=9 R=100.75

Desviacin Estndar
S=1.37
Coeficiente de Variacin
CV=1.36
Tt=2.306 para p=0.05 ; GL=n-1

Texp<Tt existe una buena exactitud del mtodo

Lmite de deteccin y lmite de cuantificacin

Lmite de Cuantificacin.
Es la mnima cantidad de analito presente en la
muestra que se puede cuantificar, bajo las condiciones
experimentales descritas con una adecuada precisin y
exactitud. (trmino cuantitativo)

Lmite de Deteccin.
Es la mnima cantidad de analito en la muestra que se
puede detectar aunque no necesariamente cuantificar
bajo las condiciones experimentales. (cualitativo)

APLICACIN
El LD en la evaluacin de impurezas mediante ensayos

lmite.
El LC en mtodos destinados a la determinacin
cuantitativa de impurezas.
Para mtodos de anlisis que se empleen en la
determinacin de impurezas o trazas de p.a.
Permite un mejor conocimiento del mtodo, saber
cuales son los LD y LC es til en el ensayo de
disolucin, determinacin de trazas de p.a. y en la
validaciones de limpieza.

DETERMINACIN
1 Mtodo basado en el examen visual:
La determinacin del LD: CCF aplicado al anlisis de

sustancias relacionadas o impurezas.

Mtodos de valoracin volumtrica con un indicador
visual de color.
2

Mtodo basado en la relacin seal/ruido

Requiere
un
procedimiento
instrumental
que
proporcione una seal, un ruido de fondo o una lnea de
base , es decir una seal residual a concentracin cero
del analito. Mtodos como espectrofotometra uv/vis y
HPLC

Relacin entre seal y ruido

Pico B
LC seal 10
veces superior

Pico A
LD 3 veces sup
Lnea basal

ruido

Cromatograma que muestra el ruido de lnea base

DETERMINACIN
Se prepara un nmero adecuado de muestras,

habitualmente un mnimo de 6 a 10 anlisis consecutivos,

se analizan de forma que puedan obtenerse los datos.
3 Mtodo basado en la extrapolacin de la recta de

calibrado a concentracin cero

Se utiliza la pendiente de una recta de calibrado a niveles
de concentracin cercanos a los lmites esperados.
Experimentalmente consiste en analizar muestras con
concentraciones conocidas al lmite de cuantificacin y
calcular la ecuacin de la recta.

IV. LIMITE DE DETECCION Y LIMITE DE CUANTIFICACION

1. CURVA DE CALIBRACION RANGO NORMAL
CURVA DE CALIBRACION
AREA m*Aus

RANGO: 1-15g/Ml
ECUACION DE LA RECTA :

Y= 200.65x+3.7
Y es la respuesta del equipo
X es la concentracin

200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0

0,2

0,4

0,6
[C]g/mL

2. CURVA DE CALIBRACION A BAJAS CONCENTRACIONES

[C]g/mL
0.3
0.6
0.9

Respuesta rea
66
120
178

59
126
192

63
130
185

rea
Promedio

62.66
125.33
185.00

DS
rea
3.51
5.03
7.00

0,8

3. DETERMINACION DEL INTERCEPTO CON EL EJE Y A

CONCENTRACION CERO:
Determinar la Ec. de la recta para los siguientes datos:
X [C]g/mL

0.3

0.6

0.9

Y AREA PROM.

62.67

125.33

185

ECUACION DE LA RECTA :
CURVA DE CALIBRACION

Y= 203.88x+ 2.0
200

La pendiente de la recta es muy

similar a la de la Ec. 1

160
AREA m*Aus

Para X=0 ; Y=2.00

El intercepto con el eje Y
es 2.00
Ybl=2.00

180
y = 203,88x + 2,00
R = 0,9998

140
120
100
80
60

40
20
0

0,2

0,4

0,6
[C]g/mL

0,8

4. DETERMINACION DESVIACION STANDAR DE LA

RESPUESTA A CONCENTRACION CERO:
Determinar la Ec. de la recta para los siguientes datos:
X [C]g/mL

0.3

0.6

0.9

Y DS AREA

3.51

5.03

7.0

CURVA DE CALIBRACION

ECUACION DE LA RECTA :
8

Y= 5,81x+ 1.69

y = 5,8167x + 1,69
R = 0,9945

Para X=0 ; Y=1.69; r=0.9970

La DS de la pendiente es
1,69

Sbl=1,69.00

DS AREA

6
5
4
3
2

1
0
0

0,2

0,4

0,6
[C]g/ml

0,8

5. CALCULO DEL LIMITE DE DETECCION K=3

6. CALCULO DEL LIMITE DE CUANTIFICACION

K=3

Robustez
Es una medida de la capacidad de un procedimiento
analtico de permanecer inalterado por variaciones
pequeas pero deliberadas del procedimiento y
proporciona una indicacin de su confiabilidad
durante las condiciones normales de uso.
Guias como ICH, USP definen robustez junto con los
parmetros de la validacin, pero no es considerado,
todavia, un requisito necesario para el registro de
especialidades

Robustez
ICH recomienda incluir la robustez en una fase

apropiada del desarrollo del mtodo . Se considera

por tanto que antes de fijar los parmetros
analticos y redactar el mtodo a valorar es
recomendable hacer un estudio de robustez de
forma que una vez fijados los mrgenes en los que
el mtodo es robusto se pueda incluir stos como
parte del mtodo final, dotndole as de una cierta
flexibilidad

Robustez
DETERMINACIN
La forma mas eficaz de estudiar la robustez es el diseo
factorial , de esta forma, sin realizar todas las
combinaciones posibles, se puede concluir con un
nmero asequible y razonable de experimentos qu
variables son las que mas influyen en el resultado y en
qu magnitud.
Normalmente se usan dos tipos de diseos factoriales:

Diseos factoriales completos y fraccionados

Diseos de Placckett-Burman

Idoneidad del Sistema

Consiste en un conjunto de ensayos que permiten
comprobar en el momento de utilizacin del mtodo,
que el sistema, (analista, reactivos e instrumental) es
adecuado para llevar a cabo la determinacin para la
que se ha establecido y validado dicho mtodo.
En la prctica podra equipararse a una cualificacin
del proceso analtico o una revalidacin en continuo,
ya que proporciona la seguridad de que en el momento
de iniciar el ensayo el conjunto del sistema contina
siendo vlido

Revalidacin
Es la verificacin mediante pruebas documentadas de
que un mtodo analtico previamente validado,
contina siendo suficientemente fiable en el tiempo o
tras realizar modificaciones respecto al mtodo inicial
Es la repeticin total o parcial de la validacin de un
procedimiento para asegurar de que es capaz de
alcanzar los resultados previstos

Revalidacin
Se revalida cuando:
Cambio de uno de los componentes crticos de la
formulacin o cambios en el proceso de fabricacin.
Cambio o remplazo de una pieza crtica en un sistema o
equipo.
Cambio en la composicin del producto.
Unidades producidas fuera de especificaciones en lotes
consecutivos.
Cambio importante en el procedimiento, o cambios en
parmetros analticos.

Comentarios y conclusiones
Los mtodos oficiales de Farmacopea no necesitan
validarse, no obstante, puede ser necesaria una
comprobacin o revalidacin de algn parmetro para
confirmar la validez de los mtodos en casos
concretos.
Los mtodos cromatogrficos se deben ajustar para
cumplir el ensayo de idoneidad del sistema , en dicho
caso se debe demostrar que los ajustes realizados son
los adecuados.