CROMATOGRAFÍA

Entre los métodos de análisis de trazas, se destaca la cromatografía, por su sencillez, rapidez y
sensibilidad, por eso es una excelente técnica usada en el análisis de productos provenientes de la
síntesis orgánica, análisis de elementos y trazas de sustancias orgánicas e inorgánicas, así también
en la clasificación taxonómica de especies botánicas, análisis químico, farmacológico, etc.

Esta técnica nace, como consecuencia de los procesos de investigación sobre fenómenos de
adsorción, allá en los años 1900-1906, fue el investigador botánico Mijail Tvest (1872 – 1919)
quien logró separar algunos pigmentos de los cloroplastos, utilizando una columna de carbonato
de calcio, estos pigmentos fueron: α clorofila, β clorofila, noexantina, violaxantina y luteia.

Para los químicos, antes de nuestro tiempo, los métodos de separaciones y purificaciones eran
muy complejos, especialmente con aquellos compuestos con propiedades físicas y químicas
semejantes, después de desarrollar la técnica de la cromatografía, esto se hizo más fácil, la
separación y purificación de los compuestos de una mezcla compleja, nos permitió conocer
diferentes clases de moléculas , ésta técnica hoy ayuda a resolver mezclas tan complejas, que
antes de la cromatografía no hubieran sido posibles las separaciones o resoluciones de estas
mezclas.

La cromatografía creada por M. Tvest está estructuradas básicamente por tres componentes: la
muestra (pigmentos coloreados), el soporte (carbonato de calcio) y el eluyente (éter de petróleo).

La muestra puede estar constituida por sustancias orgánicas o inorgánicas provenientes de una
reacción de síntesis o de un recurso natural.

El soporte puede ser un sólido con características propias, que le permite al químico usar la
técnica de la cromatografía.

El eluyente puede ser un líquido o mezcla de líquidos y/o sólidos en líquidos constituidos por
cantidades definidas experimentalmente.

El soporte y el eluyente generalmente esta formado por los siguientes compuestos químicos,
aunque pueden usarse otros sólidos y líquidos, estos son los sólidos y líquidos más usados para las
cromatografías están citados en la siguiente tabla.
 SOPORTES Y SOLVENTES (304)

Adsorbentes por orden de menor a mayor Solventes por orden de menor a mayor poder
poder de adsorción. de elución.
- Azúcar, almidón - Hexanos, éteres de petróleo.
- Inulina. - Heptano.
- Talco. - Ciclohexano.
- Carbonato de sodio - Tetracloruro de carbono.
- Carbonato de potasio. - Benceno.
- Carbonato de calcio. - Tolueno.
- Magnesia - Cloroformo.
- Gel de sílice activa. - Eter etílico.
- Alúmina activa. - Acetato de etilo.
- Piridina.
- Acetona.
- Propanol. Etanol.
- Metanol.
- Agua.
- Mezclas de ácidos , bases con agua,
alcoholes o piridina.

Con el método desarrollado por M. Tvest usada en la separación de los pigmentos vegetales nace
la CROMATOGRAFÍA. Palabra que viene del griego chrōma = color y graphō = escribir y
registrar, por los tanto cromatografía significa escribir o registrar en color, así nace lo que hoy se
denomina, CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.

La técnica nos permite la separación parcial o total de los componentes de una muestra, esto
depende de las interacciones que ocurren entre la muestra con el soporte y el eluyente.

La cromatografía por la forma de empaquetamiento y expansión del soporte se clasifica en:

cromatografía en columna y cromatografía plana.

La cromatografía en columna.- Esta definida, como una columna generalmente de vidrio, la cual
contiene como relleno, un sólido, conocida con el nombre fase estacionaria, la función de éste
sólido es detener el avance de la muestra y el eluyente que es el otro componente de la técnica,
con capacidad de arrastrar la muestra, por disolución, a través de la fase estacionaria, con ayuda
de la fuerza de la gravedad o la aplicación de una fuerza externa en la parte superior de la
columna (presión) que obliga al eluyente atravesar toda la longitud de la fase estacionaría.

La cromatografía en columna se divide en tres clases, dependiendo de la fase móvil o sustancia

que arrastra la muestra, éste puede ser un líquido, un gas o fluido supercrítico.

Cromatografía de gases.- Esta técnica tiene como fase móvil (gas portador) que puede ser:
Hidrógeno, helio, argón nitrógeno o dióxido de carbono, gases que deben ser inertes con la
muestra y el detector específico del equipo llamado cromatógrafo de gases.

La cromatografía de gases se divide en dos clases: Cromatografía gas – líquido (CGL) y

Cromatografía gas – sólido (CGS).

Cromatografía gas – líquido (CGL).- Se caracteriza por tener un sólido (tierras de diatomeas)*
recubierto de un líquido de elevada temperatura de ebullición, la cual limita el uso de
temperaturas mayores a las definidas y especificadas por los datos técnicos detallados en la
columna. Esta cromatografía esta basada en la separación de los componentes de la muestra,
basada en la propiedad de distribución del soluto entre la fase gaseosa y el líquido.
 Columna empaquetadas o rellenas (1) Columnas capilares. (2)
* Son rocas sedimentarias constituidas por algas microscópicas unicelulares y microorganismos
fósiles.
(1) Columna cromatográfica empaquetadas o rellenas con fase estacionaria líquida sobre un
soporte sólido.

(2) Columna cromatográfica capilar por su longitud y diámetro de la columna es más eficiente
que las columnas preparadas. La longitud es variable va desde las unidades, decenas o mayores
de longitud de la columna en metros.

Esquema de un cromatógrafo de gases.

El siguiente gráfico, muestra la interacción de la muestra con el líquido o gas portador que
ocurre durante un proceso cromatográfico.

Gas portador (Eluyente) con la muestra

muy concentrada
. Fase líquida
Soporte sólido
Eluyente con la muestra menos concentrada.
Eluyente con la muestra diluida.

La cantidad de muestra es de aproximadamente de 5 -250 μl y suministrada con jeringas

especiales como la de la figura.
Cromatografía gas – sólido (CGS).- En este tipo de cromatografía, donde la fase estacionaria es
un sólido, sobre la cual ocurren fenómenos de adsorción, es ahí donde los componentes de la
muestra se adhieren de manera selectiva, esto debido a las diferentes fuerzas de atracción entre
la muestra y el soporte.

Cromatografía líquida.- En ésta clase de cromatografía el portador de la muestra (eluyente) es un

líquido puro o una mezcla de líquidos, existen cinco tipos de esta clase de cromatografía.

Cromatografía líquido-líquido o de reparto.- Cuya fase estacionaria es un líquido adherida a un

sólido, donde éste líquido es inmiscible en la líquido transportador (eluyente) y la muestra se
distribuye entre ambos líquido de esa manera se va separando los componentes de la muestra.

Liquido adherido al sólido

Sólido
Líquido transportador (eluyente)

Cromatografía líquido – sólido o de adsorción.- Es ésta cromatografía el soporte o fase

estacionaría es un sólido, en la superficie de éste se produce la separación de los componentes de
la muestra, debido a las fuerzas de interacción entre las moléculas disueltas en el líquido y el
sólido, ésta diferencia de atracción entre soporte y moléculas disueltas en el líquido provoca la
separación de cada una de ellas.

Superficie del sólido.

Eluyente con la muestra

Cromatografía líquido de intercambio iónico.- En ésta clase de cromatografía, la fase

estacionaria está constituida, por una resina (estireno o divinilbenceno con grupos ácido o
básicos) de intercambio iónico, como su nombre indica existe un intercambio de iones entre la
soporte y la muestra a ser separada. Esta a la vez se clasifica en cromatografía de intercambio
catiónica o aniónico.

Cargas negativas.

Cargas positivas.

Intercambio aniónico Intercambio catiónico.

Las resinas de intercambio catiónico están conformados por grupos ácido como: el ácido
sulfónico ( R –SO3H) que es un ácido fuerte o ácidos carboxílicos (R – COOH) que es un ácido
débil. Ejemplos

O
║
- O - C4H8 – S – O – Na + - O –CH2 – COO – Na+
║
O

R- A─ C+ + M+ B─ R- A─ M+ + C+ B ─

Las resinas (celulosa o agarosa) de intercambio aniónico están constituidas por grupos aminos
terciarios (muy básicos) o grupos aminos primarios (bases débiles). Ejemplo.

CH3
│
- R – CH2 – N +– CH3 Cl -
│
CH3

R- C+ A─ + M+ B ─ R- C+ B─ + M+ A─

Esta técnica es muy usada para el ablandamiento del agua, purificación de productos
farmacéuticos, aislamiento de iones y moléculas polares, también en la separación de proteínas
ácidos nucleicos, aminoácidos, determinación de pesos moleculares y en el control de calidad.

Elución de la muestra.- las muestras deben ser solubles en agua o solventes polares, la elución se
realiza algunas veces en función al pH o a la fuerza ionica de los solventes.

Recuperación de las resinas.- Para la recuperación de las resinas se usan compuestos químicos
baratos como: NaCl, KCl, NH4Cl, HCl, H2SO4, HNO3 no es aconsejable por problemas de tipo
químico, ácido cítrico, NaOH, KOH, NH4OH, Na2CO3, Ca(OH)2, etc.
Cromatografía líquida de exclusión.- El soporte o fase estacionaria está constituida por un
polímero poroso, las cavidades del polímero están recubiertas de un líquido, donde se produce un
reparto de las moléculas a ser separadas entre el líquido en la superficie del soporte y el líquido
que contiene las moléculas, en los poros se deposita las molécula pequeñas y pasan las grandes.

Cromatografía líquida de afinidad.- El soporte está recubierta por un líquido constituido por
grupos orgánicos específicos, entre ambas fases se produce un reparto de las moléculas
constituidas de la muestra.

+
+

Cromatografía de Fluidos Supercríticos (SFC).- Otra técnica de separaciones de moléculas de

moderado y bajo peso molecular muy utilizado en el análisis de compuestos quirales, aquérales,
productos farmacéuticos, hidrocarburos, éteres, ésteres, alcoholes, amidas, aminas, anfóteros,
péptidos, proteínas, ácido nucleicos, y iones metálicos.

Cuyo gas portador es el dióxido de carbono, algunas veces mezclas de solventes orgánicos
especialmente metanol, es un proceso similar al HPLC.
Esta cromatografía usa la temperatura mayor a la temperatura crítica de las sustancias donde la
misma no puede estar en forma líquida y esta no depende la presión. Cuando la sustancia alcanza
la temperatura y presión crítica.

La sustancia cuando se encuentra por encima de la Tc y su Pc critica se dice o define como

PUNTO CRITICO o llamado fluido supercrítico, el gas portador es el anhídrido carbónico.

El PC indica que a partir de este punto localizado en el diagrama de fases, la sustancia no puede
licuarse y tampoco evaporarse al cambio de presión y temperatura, no es un sistema en equilibrio
entre el líquido y gas, sino que es una fase de comportamiento como si fuera líquido y gas.

Un fluido supercrítico es el estado físico superior a su punto crítico en la que se encuentra una
sustancia, donde la sustancia se comporta como híbrido (gas-líquido), donde sustancia por
efusión se mezcla con el gas portador y también disuelve como si fuera un líquido.

Difusión Mezcla gradual de gases con otro gas debido a su movimiento cinético.

Efusión, proceso mediante el cual un gas bajo presión escapa del compartimiento de un
contenedor a otro atravesando un pequeño orificio.

Cromatografía líquida de alta eficiencia o High performance liquid chromatography ( HPLC).-

Como todas las cromatografías mesta constituida de tres componentes: la muestra, el soporte y el
eluyente. Con ésta técnica se pueden separar macromoléculas, iones, productos naturales lábiles,
polímeros. Posee también una variedad de soportes.

Puede aplicarse también a la cromatografía preparativa desde 1 μg hasta tratar 100g de muestra.
Es muy amplia su aplicación con en las áreas de: Fármacos (Antibióticos, sedantesn esteroles,
analgésicos), Bioquímica (Aminoácidos, proteinas, carbohidratos, lípidos), Productos de
alimentación (edulcorantes artificiales, antioxidant6es, aditivos), productoas de la industria
química (Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes), contaminantes (fenoles,
pesttoicidas, herbisidas, química forense (drogas, venenos, alcohol en la sangre, narcóticos),
medicina clínica (ácidos biliares metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos).

Cromatografía plana.- Esta es muy útil y usa con frecuencia dos clases de soportes: la celulosa y
la sílica gel.

Cromatografía en celulosa o papel.- Esta técnica usa la celulosa o papel ( Whatman Nº1.), cuyas
moléculas pueden estar unidas a otras, como, moléculas de agua, por el fenómeno de adsorción,
sobre la que interactúan las moléculas de la muestra, separándolas de acuerdo a sus afinidades
con el soporte.

Por la forma del recorrido se la clasifica en: ascendente, descendente, radial.

Cromatografía ascendente.- Definida así por la forma como el eluyente se desplaza a los largo del
soporte, de la parte inferior hacia la parte superior.
Se arma el sistema de acuerdo al siguiente esquema.
• Cortar de una tira de papel Whatman Nº 1., de 1 cm de ancho x 10 cm de largo.
• Marcar con un lápiz un punto, aproximadamente a 1,5 cm de del borde de la tira de papel.
• Disolver la muestra en el solvente adecuado.
• Absorben la muestra con un tubo capilar la cantidad suficiente de muestra.
• Depositar la muestra sobre el punto marcado con lápiz.
• Secar completamente la muestra depositada sobre el punto marcado con lápiz.
• Preparar el eluyente. (puede ser un solo líquido o mezcla de líquidos).
• Preparar un recipiente de vidrio de acuerdo al tamaño de la tira de papel.
• Depositar el eluyente en la cubeta, el líquido no debe ser mayor a 1 cm de altura.
• Preparar un gancho sostenido en un soporte para colgar la tira de papel.
• Sembrar la muestra en la tira de papel con el tubo capilar, cantidad suficiente.
• Corta la zona donde se encuentra la muestra en bisel.
• Sostener en el gancho.
• Introducir la tira de papel con la muestra en la cubeta que contiene el eluyente.
• El líquido empieza a humedecer y con ello el eluyente arrastra la muestra produciendo la
separación de los componentes de la muestra.
• Una vez que el eluyente alcance la altura máxima adecuada de la tira de papel se saca el
papel (cromatograma).
• Se deja secar al medio ambiente.
• Se observa y marca con un circulo las zonas donde se encuentran individualmente cada
uno de los componentes de la muestra.
• Se mide la distancia recorrida por el eluyente y también de los componentes de la muestra
de manera individual.
• Con las distancias de recorrido de la muestra y del disolvente se determina las constantes
de recorrido de cada componente. Puede calcular con la siguiente fórmula. (Rf es una
constante característica de cada sustancia bajo las mismas condiciones de temperatura y
presión).
rm
Rf =
Rd
 •

También se puede hacer cromatografía descendente y circular.

Esta técnica es usada para la separación de sustancias muy polares como son los azucares,
aminoácidos, etc.

Un buen cromatograma presenta las zonas correspondientes a las sustancias separadas como
zonas circulares o en forma de elipses bién separadas unas de otras.

Cromatografía en capa fina CCF.- Esta técnica consiste en usar una capa delgada de sílice,
alúmina o celulosa depositada en un soporte de vidrio, aluminio o plástico.
El método de trabajo es similar a la de la cromatografía en papel. Esta técnica es la más popular
para el estudio y separación de compuestos químicos.

Cromatografía bidimensional.- Usada con el propósito de separar sustancias cuyos Rf son

cercanos y se requieren de una mayor separación entre ellas, para identificarlas o aislarlas,
entonces se realiza dos corridas cromatográficas sucesivas en dos direcciones en un mismo
soporte y con dos diferentes eluyentes.

Muestra Siembra Recorrido en primera dirección

con eluyente I.

Recorrido en segunda dirección Resolución de la muestra.

con eluyente II.
Soportes.- Hoy se dispone de una variedad de soportes 8SILICA ge4l, alúmina, Kieselguhr) y
tamaños de grano el más usado para la cromatografía en capa fina es la Silica G y H, la Silica Gel
60 G (sin indicador) Silica Gel 60 GF 254 (con indicador fluorescente) y de diferentes grados de
actividad (cantidad de agua retenida en el soprte), la Silica H es de menor tiempo de recorrido.

Preparación de la capa fina.- Las placas para la cromatografía en capa fina y en columna se
pueden encontrar preparadas en el comercio, así también soportes con los cuales el operador
puede preparar sus placas y columnas.
Se prepara las placas para la CCF tomando 30 g de sílica gel y se la suspende en 85 cm3 de
agua, ésta suspensión de deposita sobre una placa de vidrio y se la extiende de manera que se
forme una delgada de soporte sobre la placa de vidrio, se puede cubrir con ésta suspensión 5
placas de 20 cm x 20 cm.

Preparación del eluyente.- El eluyente es muy importante para lograr una buena separación,
éstos se puede encontrar en la bibliografía sobre cromatografía, sin embargo no siempre es el
eluyente adecuado, entonces se prepara uno propio de la siguiente manera.

• Sobre una placa se deposita varias la muestra con un capilar.

• Se elige los solventes que se desea usar o se dispone.
• Mediante un capilar se vacía el líquido elegido en cada muestra depositada sobre la placa.
• Se eligen los líquidos que expande mas la muestra y la que no expande.
• Con los dos líquidos se hacen mezclas de diferentes concentraciones.
• Con las soluciones preparadas se hacen las pruebas de resolución de las muestras.
• La que presenta mejor resolución se usa como el eluyente óptimo.

Visualización o revelado del cromatograma.- La visualización o revelado se realiza con luz UV. O
reactivos específicos.
Los reactivos usados en las cromatografías son específicos para diferentes familias de compuestos
orgánicos o inorgánicos y se aplica el revelador con un equipo llamado rociador o atomizador,
por ejemplo para: aldehidos es la 2,4 dinitrofenilhidrazina, ácidos carboxílicos el verde de
bromocresol, aminoácidos el revelador es la ninhidrina al 0,5 % en etanol absoluto, aminas para-
dimetil aminobenzaldehido, etc. Como reactivos generales se usa los vapores de yodo y el ácido
sulfúrico a diferentes concentraciones bajas. Esta técnica de visualización es destructiva.

Con luz UV. 254 nm y a 365 nm, éstas radiaciones aplicadas en un ambiente obscuro produce la
luminosidad de las compuestos químicos o la del soporte y es una técnica no destructiva.

Electroforesis.- Es una técnica de separación molecular como cualquier método cromatográfico,

donde las moléculas depositadas sobre un soporte como gel (agarosa), papel o acetato de celulosa,
tienen que estar dotadas de cargadas positivas o negativas, el soporte debe estar empapada de
una solución buffer y adecuada para poder aplicar un campo eléctrico, lo cual nos permitirá
separar las moléculas.
Esta técnica es muy usada para el estudio de proteínas y aminoácidos, así como ácidos nucleicos
en base a sus tamaños y cargas.

Analisis cuanti y cuali.- nos proporciona la información adecuada si se usa los medios adecuados
de deteción y evaluación de los componentes de una muestra, obteniéndose de cada componente
de la muestra un espectro si los equipos de cromatografía están acoplados a otros como ser un IR,
NMR-H, y el equipo tiene una biblioteca para realizar las comparaciones de espectros de esa
manera definir e identificar cualitativamente cada uno de los componentes de la muestra.
Para el análisis cuantitativo se dispone de registradores especiales que son capaces de integrar las
áreas y con ellas sacar los % de los componentes de una muestra.

Cromatografía analítica y preparativa.- Para estas técnicas se emplea soportes en cantidades con
el propósito de obtener cantidades mayores de una determinada sustancia. Asi por ejemplo para
la cromatografía analítica en capa fina el espesor de la capa debe estar comprendida entre 0,1-0,2
mm. Para la preparativa entre 0,5-2 mm.
Todos estos métodos pueden ser combinados de acuerdo a los requerimientos del proceso de
separaciones, aislamiento, purificación y análisis cualitativo y/o cuantitativo de las muestras.