POLYMERAS

e CHAIN
REACTION
(PCR)
JUAN JOSE JOEL VERA ASALDE
 Técnicas moleculares
● Conjunto de técnicas que permiten aislar o extraer ADN de alta pureza, visualizarlo,
cortarlo, pegarlo y o amplificarlo.
POLYMERASE CHAIN REACTION
● Obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ADN
 Replicación celular
● Se basa en la replicación celular (IN VIVO)
DESNATURALIZACIÓN Y
REASOCIACIÓN
 pcr
convencional
 PCR CONVENCIONAL
● En la PCR se simula en un tubo lo que ocurre durante la replicación celular.
● Esta mezcla se somete a la repetición de varios ciclos a diferentes temperaturas (ciclo de PCR)
que sustituye a la mayoría de las proteínas que actúan en la replicación celular.
 historia
• La PCR surgió en 1971 por Gobind Khorana
• Técnica mejorada por el Dr. Kary Mullis.
• Graduado en química en la Universidad de
Georgia Tech en 1966 y con un doctorado en
1973 por la Universidad de California en
Berkeley
• En 1979 se unió a la compañía de biotecnología
“CETUS”
• En 1983 trabaja en la síntesis de
oligonucleótidos y en el uso de iniciadores.
• Viaje en la carretera tuvo un sueño
 problemas

• La polimerasa que utilizaban se inactivaba a 95°C

• Al añadir en cada ciclo más polimerasa le hacía una
técnica costosa y lenta de lo que es hoy día
• Susanne Stoffel y David H. Gelfand, quienes finalmente
lograron aislar el ADN de la llamada polimerasa Taq en
1985.

Premio nobel

• En 1993 recibe el premio Nobel de química (compartió

premio con Michael Smith)
COMPONENTES PCR
 ETAPAS DE PCR punto final
DESNATURALI ALINEAMIEN ELONGACIÓ
ZACIÓN TO N
Apertura del adn HIBRIDACIÓN DE Extensión de la
Primers nueva cadena
94-96°C 40-60°C 72°C
Tiempos de pcr
OLIGONUCLEOT
•
IDOS
Son los 4 desoxinucleotidos involucrados en un PCR típico.
• dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
 MAGNESIO
• Los iones de magnesio estimulan a la enzima ADN polimerasa que incorpore los dNTPs
 ADN
•
POLIMERASA
Es la encargada de incorporar nucleótidos durante la síntesis de las nuevas cadenas de
ADN.
• Requiere de un molde y un cebador (iniciador)
Dominio de la palma: Lámina β
• Región de unión de iones metálicos
• Estabiliza la unión cebador-nucleótido entrante (dNTP)
• Verifica la precisión del apareamiento del nucleótido
añadido
Dominio de dedos y pulgar
• Varios residuos de los dedos se unen a los dNTP entrantes
 BUFFER
• Solución amortiguadora y sales.
• Un buffer 10X estándar contiene 500 mM KCl y 100 mM Tris-HCl, pH 8.3
• Mantiene el pH óptimo para que la polimerasa actúe.
• Sales: proporcionan la fuerza iónica adecuada para una máxima actividad de la enzima.
Influye en la Tm e hibridación.
 AGUA LIBRE DE
NUCLEASAS
• Agua grado PCR libre de RNAsas y DNAsas
• Provee el medio en el cual se llevará a cabo las reacciones necesarias para la replicación de
ADN
 CEBADORES
• Definen el segmento que será amplificado.
• Secuencias de ADN de 18-25 pb
• 3´ OH libre para la acción de ADN
polimerasa
• Complementario al ADN diana
 DISEÑO DE
CEBADORES
• Generalmente deben tener un tamaño de 18-30 pb.
• El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50-60
• Deben evitarse zonas con mas de tres repeticiones consecutivas de una
sola base.
• No seleccionar iniciadores que en su extremo 3´ tenga una importante estructura
secundaria.
• Se recomienda que en el extremo 3´ las ultimas bases sean G o C.
• Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de iniciadores.
• Si esta se da entre los extremos 3´, pueden formarse dímeros de iniciadores.
• La temperatura de alineamiento de los dos iniciadores utilizados en una reacción debe ser
similar
 PCR CONVENCIONAL
ventajas DESventajas
• Generar millones de
• Estandarizar la técnica
copias a partir de
para cada organismo
muestras pequeñas
• La Taq polimerasa
• Técnica molecular
carece de la actividad 3
robustas
´exonucleasa de
• El producto amplificado
corrección de pruebas
se puede utilizar para
• ADN contaminantes
clonar, secuenciar y
presentes en la muestra
análisis.
• Primers específicos
Sugerencias PCR (Modificado de Aoyaki
2001).
Fidelidad y especificidad

● Seleccionar una enzima con actividad 3’-5’ exonucleasa.

● Utilizar iniciadores con mas de 15 nucleotidos.
● Incrementar la temperatura de alineamiento.
● Reducir el tiempo de desnaturalizacion y alineamiento en el ciclo.
● Reducir la concentracion de iniciadores.
● Reducir el numero de ciclos.
● Reducir la concentracion de Mg2+.
● Revisar que el termociclador funcione adecuadamente
Sugerencias PCR (Modificado de Aoyaki
2001).
Eficiencia de amplificación

● Incrementar la concentración de dNTPs y enzimas.

● Usar en concentración baja algún aditivo.
● Reducir el tamaño del fragmento que se desea amplificar (amplicon).
● Probar con Pfu polimerasa.
● Confirmar que los iniciadores no forman dímeros.
 APLICACIONES

Ingenería genética Amplificar secuencias génicas específicas

Análisis forense e identificación Se detecta la presencia de ADN micro satélite para determinar parentesco o posibles
humanas sospechosos en la escena de un crimen. ADN Fingerprinting

Genética de poblaciones Estudios de similitud génica entre poblaciones y rutas de migración

Estudios de evolución Analizar las relaciones filogenéticas entre especies

Diagnóstico molecular Presencia de ADN de un patógeno, diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas,

presencia de mutaciones asociadas al cáncer

Identificación de especies Detectar la presencia de regiones específicas del ADN mitocondrial y ARN
ribosomal
Pcr en el ámbito forense
● Usted ha recibido una muestra de ADN de un cabello
encontrado en la escena de un crimen junto con muestras de
ADN de tres posibles sospechosos. Su trabajo es examinar un
marcador genético determinado y ver si alguno de los tres
sospechosos coincide con el ADN de cabello para este marcador
 Thank you

CREDITS: This presentation template was created by Slidesgo, and includes icons by Flaticon,
Do
and you have&any
infographics questions?
images by Freepik
• E-
• E
TIPOS DE PCR
• PCRs para la amplificacion de un solo sitio conocido del genoma (locus)
• PCRs en los que no es necesario conocer la región que se esta amplificando
(zonas hipervariables del genoma)
POLYMERASE CHAIN REACTION
● O
 Table of contents

Objectives Methodology
01 P 02 P

Results analysis Conclusions

03 P 04 P
 01
objectives
You can enter a subtitle here if
you need it
SOME BACKGROUND
INFORMATION

Do you know what helps you make your point

clear? Lists like this one:
● They’re simple
● You can organize your ideas clearly
● You’ll never forget to buy milk!
And the most important thing: the audience won’t
miss the point of your presentation
FACTORS WE SHOULD CONSIDER

GENES DNA
Mercury is the closest planet to the Venus has a beautiful name and is the
Sun and the smallest one in the entire second planet from the Sun. It has a
Solar System poisonous atmosphere
RESEARCH AND PUBLICATIONS
Saturn is a gas giant and has several Mercury is the closest planet to the
rings. It's composed mostly of Sun and the smallest in the entire
hydrogen and helium Solar System

BY SATURN BY MERCURY
Venus is the second planet from the Despite being red, Mars is actually a
Sun. It’s terribly hot, even hotter very cold place. It’s full of iron oxide
than Mercury dust

BY VENUS BY MARS
 RESEARCH RESOURCES
● You can list your reference websites or
publications here
● You can list your reference websites or
publications here
● You can list your reference websites or
publications here
● You can list your reference websites or
publications here
● You can list your reference websites or
publications here
● You can list your reference websites or
publications here
AWESO
ME
WORDS
 THE USE OF
CRISPR WITH
HUMAN
GENOME
Images reveal large amounts of data,
so remember: use an image instead of
a long text. Your audience will
appreciate it
 TRIAL TIMELINE
EXPERIMENT CONCLUSIO
RESEARCH
Mercury is the closest ATION
Venus is the second NSred, Mars
Despite being
planet to the Sun planet from the Sun is very cold

1 2 3 4 5
PRECLINICA
RESULTS
Jupiter isL
the biggest Saturn is composed of
planet of them all hydrogen and helium
STUDY CONCLUSIONS

CONCLUSION 1
Saturn is a gas giant and has several rings. It's composed
mostly of hydrogen and helium. It was named after the
Roman god of wealth and agriculture

CONCLUSION 2
Jupiter is the biggest planet in the Solar System. It's the
fourth-brightest object in the night sky. It was named after
the Roman god of the skies and lightning
 MULTIMEDIA MOCKUPS

You can replace the image on the

screen with your own work. Just
right-click on it and select “Replace
image”
Bioengineering Icon Pack
 Thank you
¿Tienen alguna pregunta?

CREDITS: This presentation template was created by Slidesgo, and includes icons by Flaticon,
and infographics & images by Freepik

Please keep this slide for attribution