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Un enfoque retrospectivo para probar el método de código de barras de ADN

ArtículoenMÁS UNO · Noviembre 2013

DOI: 10.1371/journal.pone.0077882 · Fuente: PubMed

CITAS LECTURAS

31 1.213

2 autores:

David Chapple Peter A Ritchie

Universidad de Monash (Australia) Universidad Victoria de Wellington

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Un enfoque retrospectivo para probar el método de código de barras de
ADN

David G. Chapple1,2*, Peter A. Ritchie2

1Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Monash, Clayton, Victoria, Australia,2Centro Allan Wilson para la Evolución y Ecología Molecular, Facultad de Ciencias
Biológicas, Universidad Victoria de Wellington, Wellington, Nueva Zelanda

Abstracto

Hace una década, se propuso el código de barras de ADN como método estandarizado para identificar especies existentes y acelerar el
descubrimiento de nuevas especies. Sin embargo, a pesar de sus numerosos éxitos en una variedad de taxones, sus frecuentes fracasos han
puesto en duda su precisión como método taxonómico abreviado. Utilizamos un enfoque retrospectivo, aplicando el método a la clasificación
de los eslizones de Nueva Zelanda tal como estaba en 1977 (principalmente basado en caracteres morfológicos), y lo comparamos con la
taxonomía actual alcanzada utilizando enfoques tanto morfológicos como moleculares. Para el conjunto de datos de 1977, los códigos de
barras de ADN tuvieron un éxito moderado-alto en la identificación de especímenes (78-98%) y en señalar correctamente los especímenes que
desde entonces han sido confirmados como taxones distintos (77-100%). Pero la mayoría de los métodos de comparación no lograron
detectar los complejos de especies que estaban presentes en 1977. Para el conjunto de datos actual, hubo un éxito moderado-alto en la
identificación de especímenes (53-99%). Para ambos conjuntos de datos, la capacidad de descubrir nuevas especies dependía del enfoque
metodológico utilizado. La delimitación de especies en los eslizones de Nueva Zelanda se vio obstaculizada por la ausencia de una brecha en
los códigos de barras local o global, como resultado de recientes eventos de especiación e hibridación. Si bien los códigos de barras de ADN
son potencialmente útiles para la identificación de especímenes y el descubrimiento de especies en eslizones de Nueva Zelanda, su tasa de
error podría obstaculizar el progreso en la documentación de la biodiversidad en este grupo. Sugerimos que los enfoques taxonómicos
integrados son más efectivos para descubrir y describir la biodiversidad.

Citación:Chapple DG, Ritchie PA (2013) Un enfoque retrospectivo para probar el método de codificación de barras de ADN. MÁS UNO 8(11): e77882. doi:10.1371/
diario.pone.0077882

Editor:Indra Neil Sarkar, Universidad de Vermont, Estados Unidos de América

Recibió8 de agosto de 2013;Aceptado13 de septiembre de 2013;Publicado11 de noviembre de 2013

Derechos de autor:© 2013 Chapple y otros. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso,
distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor y la fuente originales.

Fondos:El estudio fue financiado por el Centro Allan Wilson de Ecología y Evolución Molecular y una subvención del Fondo de Investigación Universitaria de la Universidad Victoria
de Wellington. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses:Los autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.

* Correo electrónico: David.Chapple@monash.edu

Introducción En contraste con el número limitado de caracteres morfológicos

La capacidad de identificar y describir especies con precisión sustenta
toda la investigación biológica; sin embargo, los enfoques taxonómicos
tradicionales basados en la morfología sólo han logrado describir entre
1,2 y 1,5 millones de especies en los últimos 250 años [1,2], apenas el
10% de las especies previstas para la Tierra. diversidad eucariota [2]. Se
estima que persistir en enfoques tan engorrosos y que requieren mucho
tiempo no daría como resultado un inventario completo de la
biodiversidad mundial durante al menos ~1000 años [3,4], y tal vez
mucho más tiempo, dada la fuerte disminución en el número de
taxónomos especializados y la financiación. para la investigación
taxonómica [5,6]. El enfoque de códigos de barras de ADN fue
introducido en 2003 por Paul Hebert y sus colegas [7,8] como una forma
de superar el "impedimento" o "cuello de botella" taxonómico existente
[7,9]. Prometió revolucionar la identificación de especies existentes y
acelerar el descubrimiento de nuevas especies, utilizando un marcador
molecular estandarizado (un segmento de 650 pb del gen del ADN
mitocondrial de la citocromo c oxidasa I [COI]) y un método de análisis.
discretos disponibles para identificar y discriminar especies, los cuatro
nucleótidos alternativos (A, T, C, G) y las 650 posiciones de nucleótidos
en el gen COI proporcionan un número casi infinito de combinaciones
potenciales [7]. A diferencia de muchos caracteres morfológicos que son
relevantes sólo para grupos taxonómicos específicos, los datos de
secuencia son comparables en todo el reino animal [4], lo que lleva a la
analogía con los Códigos Universales de Productos (UPC) que identifican
de forma única los productos comerciales y a la sugerencia de que se
podrían identificar especies. basado en su 'código de barras' COI [7]. Una
ventaja significativa del enfoque es que funciona en situaciones que
confundirían muchos enfoques morfológicos: fragmentos de
especímenes [10-12], especies con múltiples etapas de vida [13] y
dimorfismo sexual o morfología plástica, variable o conservada [14-16]. ].
Es importante destacar que los avances en la tecnología de
secuenciación de alto rendimiento continúan aumentando la velocidad y
disminuyendo el costo de generar bibliotecas de referencia de COI para
la fauna mundial [17,18].
La capacidad de delimitar especies es un componente esencial de la
identificación de ambas especies (en lo sucesivo denominada especímenes).

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identificación; [19]) y descubrimiento de especies. Una suposición crítica del
enfoque de códigos de barras de ADN es que el nivel de variación genética
intraespecífica es menor que el evidente entre especies [7,8,20]. Esta
distinción entre divergencias intraespecíficas e interespecíficas, denominada
"brecha de códigos de barras" [21], permite asignar secuencias desconocidas
a una especie existente o marcarlas como una especie nueva sospechosa. El
umbral por encima del cual una secuencia de consulta se considera distinta de
una secuencia de referencia se ha sugerido de diversas formas como 2-3%
[7,8], 10 veces la divergencia intraespecífica media [20], o se calcula de forma
independiente para cada conjunto de datos empíricos (por ejemplo, código de
barras automático). Descubrimiento de brechas [ABGD], [22]). Las
investigaciones realizadas durante la última década han demostrado que la
precisión de la delimitación de especies está influenciada por la calidad y la
integridad de la base de datos de referencia, la extensión geográfica del
muestreo, la intensidad del muestreo intraespecífico y el momento de la
divergencia entre especies estrechamente relacionadas [23- 27].
El enfoque tradicional de códigos de barras de ADN se basa en
una única región genética de ADNmt y experimenta dificultades
inherentes en casos de introgresión, clasificación de linaje
incompleta, pseudogenes, duplicación de genes, transferencia
horizontal de genes y selección de ADNmt [28-32]. A pesar de estas
limitaciones reconocidas, el desarrollo continuo del método de
codificación de barras de ADN (por ejemplo, enfoques analíticos y
estadísticos mejorados, el uso de otras regiones de genes nucleares
y de ADNmt) le ha permitido obtener una aceptación generalizada
con varias colaboraciones y consorcios internacionales dedicados a
codificar con barras toda la vida animal ( NEGRITA, CBOL, iBOL). Sin
embargo, los numerosos supuestos éxitos del método [20,26,33-41]
se han visto atenuados por su frecuente fracaso en una amplia
gama de grupos de animales [21,25,42-48]. Pocos estudios han
informado de un éxito completo (es decir, del 100%) [35] y, a
menudo, la base sobre la cual un estudio particular se designa
como éxito o fracaso es subjetiva.
Aparte de los casos que involucran cuestiones metodológicas inherentes
(por ejemplo, introgresión, clasificación incompleta de linajes), en algunas
ocasiones los "fracasos" se reportan como éxitos, y los investigadores: i)
cuestionan la calidad o confiabilidad de los conjuntos de datos de referencia
existentes [4], o ii) citan casos de superposición intra e interespecífica como
evidencia (o prueba) de la presencia de complejos de especies o taxones
distintos que se han pasado por alto anteriormente [20,26,33,49]. Esto ha
llevado a los críticos a etiquetar los códigos de barras de ADN como un
método configurado para que "no pueda fallar" [50]. Sólo un subconjunto de
estudios utiliza posteriormente enfoques taxonómicos integrados para
evaluar la validez de los complejos de especies señaladas y los nuevos taxones
sospechosos, lo que dificulta determinar si representan problemas con la
taxonomía existente [16,26,51] o el enfoque de códigos de barras de ADN en sí
[ 48,52]. Distinguir entre estas posibilidades alternativas suele ser difícil ya que
la taxonomía "verdadera" generalmente se desconoce y representa el enfoque
real del estudio de códigos de barras de ADN. Aquí describimos un estudio de
caso en el que utilizamos un enfoque retrospectivo que nos permite evaluar el
valor potencial del método de códigos de barras de ADN como un método
abreviado para la identificación de especímenes y el descubrimiento de
especies en lagartos de Nueva Zelanda.
Aplicamos el enfoque de códigos de barras de ADN a la fauna de eslizones
de Nueva Zelanda (Scincidae) tal como estaba antes de la implementación de
técnicas moleculares modernas [53], y lo comparamos con el
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Código de barras de ADN en eslizones de Nueva Zelanda
taxonomía actual que se ha alcanzado después de 25 años de estudio
taxonómico intensivo e integrado [54-76]. En 1977, Hardy [53] completó
una revisión exhaustiva, principalmente basada en la morfología, de los
eslizones de Nueva Zelanda, reconociendo 23 especies o taxones
distintos (Tabla S1). La morfología conservada de esta radiación ha dado
lugar a una historia taxonómica turbulenta, pero la revisión de Hardy
[53] proporciona una base conveniente para la resolución taxonómica
posible a partir de caracteres morfológicos. Los estudios que combinan
enfoques morfológicos y moleculares (aloenzimas, ADNmt, ADN nuclear)
han dado como resultado la división de complejos de especies y el
descubrimiento de nuevos taxones, lo que lleva al reconocimiento actual
de 55 especies, varias de las cuales aún no se han descrito formalmente
(Tabla S1; [ 66,75]).
Este enfoque nos permite: i) determinar si los complejos de especies en el
conjunto de datos de 1977 están correctamente identificados y marcados, ii)
comparar el resultado del método de códigos de barras de ADN en el conjunto
de datos actual con el alcanzado mediante un enfoque taxonómico integrado,
y iii) evaluar si Los supuestos nuevos taxones descubiertos desde 1977 pueden
asignarse correctamente como taxones nuevos o existentes mediante códigos
de barras de ADN. Esto se logrará utilizando 296 secuencias COI de eslizones
de Nueva Zelanda que representan los 23 taxones reconocidos en 1977 (1-82
secuencias por especie) y 48 de las 55 especies actualmente reconocidas (1-27
secuencias por especie) (Tabla S2). Nuestro estudio representa uno de los
pocos estudios de códigos de barras de ADN realizados en reptiles ([18], pero
ver 77).
Materiales y métodos
Muestreo y secuenciación de COI.
Las muestras se obtuvieron, con permiso, de la Colección Nacional de
Tejidos Congelados (NFTC, Universidad Victoria de Wellington, Nueva
Zelanda; los especímenes de vales asociados se encuentran en Te Papa)
y los especímenes conservados en etanol se encuentran en Te Papa
Tongarewa (Museo Nacional de Nueva Zelanda, Wellington) (Tabla S2).
Estas instituciones donaron las muestras de tejido para su uso en este
estudio. Las únicas especies existentes no incluidas fueron cuatro
especies descritas recientemente (O. burganae,O. juez,O. repens,O. toka;
[67,74]), una especie no descrita recientemente reconocida (oh. af.
policroma'clado 2'; [70]), y dos taxones presuntamente distintos (cada
uno conocido sólo a partir de un único espécimen:oh. af.discreto'
Okuru' [67];oh. 'Whirinaki' [75]). Para los análisis filogenéticos, se
incluyeron muestras de grupos externos de Nueva Caledonia y Australia,
basándose en estudios filogenéticos más amplios de eslizones del grupo
Eugongylus en la región [66] (Tabla S2).
El ADN genómico total se extrajo de muestras de hígado, músculo o
cola utilizando un protocolo de extracción modificado con fenol-
cloroformo [78]. Se desarrollaron cebadores específicos para Skink para
amplificar y secuenciar un fragmento de ~ 710 pb del gen COI mtDNA
(Tabla S3). La PCR y la secuenciación se realizaron como se describe en
Greaves et al. [61]. Los productos de la PCR se purificaron utilizando
ExoSAP-IT (USB Corporation, Cleveland, Ohio, EE. UU.). El producto
purificado se secuenció directamente utilizando un kit de secuenciación
de ciclos BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) y luego se analizó
en un secuenciador capilar ABI 3730XL. Los datos de secuencia se
editaron y alinearon usando GENEOSOv5.4 [79]. Tradujimos todas las
secuencias para confirmar que ninguna contenía codones de parada
prematuros. Los datos de secuencia fueron enviados a
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GenBank con el número de acceso KC349552-KC349853 (Tabla
S2).
Análisis de brechas de códigos de barras
Las distancias genéticas intra e interespecíficas se calcularon en
MEGA5 [80] utilizando el modelo de 2 parámetros de Kimura (K2P). S
ESPECIESIDENTIFICADORSe utilizó v1.7.8 (http://taxondna.sourceforge.net/;
[43]) para calcular el nivel de superposición (total y 90%) entre las
distancias genéticas intraespecíficas e interespecíficas. Se utilizó el
programa ABGD (http://wwwabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/
abgdweb.html; [22]) para determinar el umbral de distancia genética
para la delimitación de especies, siguiendo la metodología de Jörger et al
[51] y Puckridge et al. [41].
Como cierta superposición entre divergencias intraespecíficas e
interespecíficas se ha convertido en una expectativa, en lugar de una rara
excepción [21,46], su presencia no excluye necesariamente la identificación de
la muestra [19]. Esto se debe a que la identificación de especímenes se basa
en la presencia de una brecha en el código de barras "local" (es decir, una
secuencia de consulta que está más cerca de una secuencia conespecífica que
de una especie diferente), en lugar de la brecha en el código de barras
"global" (es decir, un umbral de distancia establecido para todas las
especies). ) que se requiere para el descubrimiento de especies [19,46]. Se
utilizan gráficos de la distancia intraespecífica máxima frente a la distancia
interespecífica mínima (es decir, el vecino más cercano; [81]) para investigar la
presencia de una brecha de código de barras local, con puntos por debajo de
la pendiente 1:1 que representan casos en los que está ausente [19 ,26,40,49].
Utilizamos el Análisis de Varianza (ANOVA) para comparar el nivel de
divergencia intraespecífica presente en los conjuntos de datos de taxonomía
de 1977 y actuales.
Identificación de muestras
Para no confundir la identificación de especímenes y el
descubrimiento de especies [19], consideramos cada uno por separado.
Empleamos tres enfoques diferentes para la identificación de muestras:
métodos basados en la unión de vecinos (NJ), basados en la distancia y
de coincidencia.
Método basado en Nueva Jersey.Se trataba de la versión modificada
del método NJ de Hebert et al. [7], desarrollado originalmente por Meier
et al. [43] (“identificación basada en árboles, criterios revisados”). Los
árboles NJ se generaron en MEGA utilizando distancias genéticas K2P y
1000 bootstraps. Se designó una secuencia ejemplar para cada especie
[35,46], que representa (cuando sea posible) la muestra
geográficamente más cercana a la localidad tipo de la especie (Tabla S2).
Los criterios descritos en la Tabla S4 se utilizaron para determinar si la
identificación de la muestra fue exitosa, ambigua o fallida (es decir,
identificación errónea). Para el conjunto de datos de 1977, comparamos
los especímenes listados como ambiguos con la taxonomía actual para
determinar si estaban correctamente marcados como representantes de
nuevas especies.
Método basado en la distancia. Se generó un conjunto de datos.
que contiene sólo la secuencia ejemplar para cada especie. Usando S
ESPECIESIDENTIFICADOR, calculamos la distancia genética a la secuencia
ejemplar más cercana para cada espécimen de consulta. El éxito o el
fracaso de la identificación se evaluó según una serie de umbrales de
distancia (2, 4, 6, 8, 10%). Para el conjunto de datos de 1977,
determinamos si las consultas de especímenes que excedieron el umbral
de distancia respectivo fueron marcadas correctamente como especies
nuevas/distintas en relación con la taxonomía actual.
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Código de barras de ADN en eslizones de Nueva Zelanda
Métodos de emparejamiento. SESPECIESIDENTIFICADORestaba acostumbrado a
determinar el éxito de tres enfoques de coincidencia ("Mejor
coincidencia", "Mejor coincidencia", "Código de barras de todas las
especies") desarrollado originalmente por Meier et al. [43]. Los criterios
utilizados para evaluar si la identificación de la muestra fue exitosa,
ambigua o fallida se describen en la Tabla S4.
Descubrimiento de especies
Desde 1977 se han descubierto en Nueva Zelanda trece nuevos
taxones sospechosos (formas morfológicamente distintas o
descubrimientos de regiones remotas de la Isla Sur) (Tabla S5). Los
enfoques taxonómicos integrados han confirmado que algunas son
especies nuevas, mientras que otras simplemente representan formas
morfológicamente distintas de especies existentes [66,75] (Tabla S5).
Utilizamos el conjunto de datos de 1977 y una versión modificada del
conjunto de datos de taxonomía actual (que contiene sólo taxones/
poblaciones conocidas en 1977), para evaluar si los enfoques basados
en Nueva Jersey y en la distancia habrían identificado correctamente
estos nuevos taxones sospechosos como nuevos o existentes. especies.
Resultados
Análisis de brechas de códigos de barras
Tanto la media (1977: 3,3 ± 0,75, actual: 1,9 ± 0,29; ANOVA:F1,61= 4,57,
PAG=0,037) y máximo (1977: 5,6 ± 1,25, actual: 3,0 ± 0,45; ANOVA:F1,61=
5,51,PAG=0,022) las distancias genéticas intraespecíficas eran mayores
en la taxonomía de 1977 en comparación con la taxonomía actual (Tabla
S5, Tabla S6). Esto resultó en una superposición casi completa entre las
distancias genéticas intra e interespecíficas para el conjunto de datos de
1977, y la ausencia de una brecha en el código de barras (Figura 1, Tabla
1). Aunque todavía era evidente cierta superposición en la taxonomía
actual (4-10% de las observaciones), había una distinción más clara entre
las distancias genéticas intra e interespecíficas (Figura 1, Tabla 1).
Para la taxonomía de 1977, no había una brecha en el código de
barras local para seis especies (27%; Figura 2). Cinco de estos casos
se relacionaron con complejos de especies que se han dividido
desde 1977 (aeneo,lineoocellatum-cloronotón,oliveri,nigriplantare
maccanni; Tabla S1), y uno a la hibridación entreotagense y
waimatense[68]. Sin embargo, a pesar de que estos complejos han
sido revisados en la taxonomía actual, no existía una brecha en el
código de barras local para seis especies (5 [12%] debajo de la línea,
1 [2%] en la línea; total 14%; Figura 2). Estos casos involucraron
especiación reciente (infrapunctato,lineoocellatum-cloronotón,
smithi-microlepis; [61,62,69]) y la hibridación entre otagensey
waimatense[68].
Identificación de muestras
Implementamos varios enfoques para determinar el umbral de
distancia para la delimitación de especies. El enfoque de divergencia
intraespecífica media de 10x arrojó umbrales irrazonablemente altos
tanto para los conjuntos de datos de 1977 (33,1%) como para los
actuales (18,7%). Aunque los resultados del enfoque ABGD no fueron
concluyentes, el rango de umbral más consistente fue del 2,3 al 3,8%.
Por lo tanto, utilizamos una amplia gama de umbrales de distancia (2, 4,
6, 8, 10%) para evaluar la precisión de la identificación de muestras
mediante pruebas basadas en distancia y basadas en NJ.
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 Código de barras de ADN en eslizones de Nueva Zelanda

Figura 1. La brecha del código de barras, la superposición de distancias genéticas K2P intra e interespecíficas.Basado en el (A) taxonomía de
1977, y (B) taxonomía actual de los eslizones de Nueva Zelanda.
doi: 10.1371/journal.pone.0077882.g001

MÁS UNO | www.plosone.org 4 noviembre 2013 | Volumen 8 | Número 11 | e77882


Tabla 1.Superposición de las distancias genéticas intra e interespecíficas en los eslizones de Nueva Zelanda.
Conjunto de datos No. muestras Superposición total
Superposición (rango)
taxonomía de 1977 256 21,28% (0-21,28%)
Taxonomía actual 296 11,03% (0-11,03%)
Basado en la taxonomía de 1977 y la taxonomía actual. La superposición del 90% excluye el 5% más grande de las distancias intraespecíficas y el 5% más bajo de las distancias interespecíficas.
doi: 10.1371/journal.pone.0077882.t001
(distancia a la secuencia ejemplar de especies) y métodos de comparación (mejor
coincidencia, mejor coincidencia cercana, código de barras de todas las especies).
Con sede en Nueva Jersey.El enfoque de Nueva Jersey identificó
correctamente el 56 % de los especímenes como especies existentes, y
otro 42 % se marcó como especies distintas (de estas, el 97 % ha sido
confirmado posteriormente como especies nuevas) (Tabla 2, Figura S1).
Esto resultó en una tasa de éxito general del 97 %, similar a la
encontrada según la taxonomía actual (96 %; Tabla 2, Figura S2). Los
casos de fracaso relacionados con la hibridación (otagensewaimatense) y
radiaciones de especies recientes (Figura S1, Figura S2).
Distancia a especies ejemplares.El 'éxito' de identificación de
especímenes (= ejemplar correcto, dentro del umbral + marcado
correctamente como nueva especie) para el conjunto de datos de 1977
osciló entre 78-89%, dependiendo del umbral utilizado (Tabla 3). Los
umbrales más bajos tuvieron más éxito al marcar nuevas especies, pero
a la inversa tuvieron tasas de error más altas al marcar incorrectamente
especímenes distintos (Tabla 3). El éxito de la identificación para el
conjunto de datos actual osciló entre el 53% y el 96%, y la tasa de
señalización incorrecta disminuyó con el umbral empleado (Tabla 3).
Métodos de emparejamiento.A pesar de los problemas
taxonómicos evidentes en el conjunto de datos de 1977, se
informaron altos niveles de éxito (86-98%) con los enfoques Best
Match y Best Close Match (Tabla 3). La tasa de éxito fue similar en el
conjunto de datos actual (88-99%), y los casos de fracaso
generalmente involucraron hibridación (otagense-waimatense) o
radiaciones recientes (Tabla 3).
En contraste, el enfoque del código de barras para todas las especies
fue mucho más efectivo para identificar los problemas taxonómicos
presentes en 1977, con una baja tasa de éxito (26-30%) reportada en
todos los umbrales de distancia (Tabla 3). Sin embargo, solo fue evidente
un éxito moderado (63-70%) para la taxonomía actual, debido a una gran
cantidad de secuencias ambiguas derivadas de la ausencia de una
brecha en el código de barras local o global (Tabla 3).
Descubrimiento de especies
Para examinar la eficacia del método de códigos de barras de ADN para el
descubrimiento de especies, se utilizaron versiones modificadas de ambos
conjuntos de datos que contenían sólo taxones que se conocían en 1977. El
método de Nueva Jersey asignó correctamente todos (100% de éxito) nuevos
taxones sospechosos descubiertos desde 1977 como parte de una especie
existente o correctamente marcada como una nueva especie (Tabla 2). El
enfoque de Distancia a especies ejemplares fue menos preciso y el éxito
dependió del conjunto de datos utilizado y
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Código de barras de ADN en eslizones de Nueva Zelanda
90% de superposición
% Observaciones Superposición (rango) % Observaciones
99,9% 8,49% (10,68-19,17%) 88,1%
10,4% 4,05% (6,26-10,31%) 4,1%
el umbral de distancia empleado (1977: 77-95%, actual: 35-87%;
Tabla 3).
Discusión
Brecha de código de barras
No pudimos encontrar evidencia de una brecha en los códigos de barras
locales o globales para los eslizones de Nueva Zelanda. La presencia de una
brecha en el código de barras es esencial para una delimitación precisa de las
especies y subyace tanto a la identificación de especímenes (brecha local)
como al descubrimiento de especies (brecha global) [19,46]. La superposición
entre distancias genéticas intra e interespecíficas a menudo se atribuye a
problemas con la taxonomía existente o la calidad del conjunto de datos de
referencia [20,49]; sin embargo, nuestro enfoque retrospectivo nos permite
excluirlos como explicaciones de la ausencia de una brecha en el código de
barras en este grupo.
Para el conjunto de datos de 1977, la superposición casi completa de
la variación genética intra e interespecífica se debió a la presencia
generalizada de complejos de especies no reconocidos (Tabla S1). Sin
embargo, si bien estos complejos se resolvieron en la taxonomía actual,
debido a la hibridación (otagenseywaimatense; [68]) y varios eventos de
especiación recientes (infrapunctato, lineoocellatum-cloronotón,smithi-
microlepis; [61,62,69]) todavía no había una brecha en el código de
barras. El potencial limitado para la delimitación de especies en los
eslizones de Nueva Zelanda podría indicar posibles deficiencias del
enfoque tradicional (es decir, sólo COI) de códigos de barras de ADN, en
lugar de cuestiones relacionadas con la calidad de las taxonomías o
conjuntos de datos de referencia existentes. Los estudios iniciales que
documentaban la presencia de distintas lagunas en los códigos de
barras en animales [7,8,20] subestimaron el grado de divergencias
genéticas intraespecíficas (debido al muestreo limitado dentro de las
especies) y exageraron el nivel de distancias interespecíficas (debido a la
falta de genes estrechamente relacionados). especies) [21,52,82].
Numerosos estudios empíricos que emplean un muestreo exhaustivo
dentro de grupos taxonómicos [21,25,26,46,49,52], incluido el presente
estudio, han respaldado las predicciones teóricas [23,27] de que la
superposición entre las distancias genéticas intra e interespecíficas es
una ocurrencia común en radiaciones recientes (pero ver 39).
El concepto de brecha en los códigos de barras está directamente relacionado con
la búsqueda de un umbral de distancia establecido para delimitar las especies dentro
de los estudios de códigos de barras de ADN. Sin embargo, debido a factores como
el tamaño de la población, la tasa de mutación y la historia biogeográfica, no existea
prioriHay razones para esperar que los tiempos de divergencia dentro o entre linajes
sean consistentes [19]. Por ejemplo, el nivel de variación genética intraespecífica en
anfibios y reptiles
5 noviembre 2013 | Volumen 8 | Número 11 | e77882
 Código de barras de ADN en eslizones de Nueva Zelanda

Figura 2. Distancia genética K2P intraespecífica máxima en relación con la distancia del vecino más cercano.Basado en el (A) Taxonomía de 1977 para
eslizones de Nueva Zelanda, y (B) taxonomía actual. Los puntos que caen por encima de la línea 1:1 indican la presencia de un espacio en el código de barras local,
mientras que este espacio en el código de barras local está ausente en los puntos debajo de la línea.
doi: 10.1371/journal.pone.0077882.g002

MÁS UNO | www.plosone.org 6 noviembre 2013 | Volumen 8 | Número 11 | e77882


Tabla 2.Tasa de éxito del enfoque basado en Nueva Jersey (Neighbour-Joining)
para la identificación de especímenes y el descubrimiento de especies.
1977 Taxonomía Taxonomía actual
Identificación de muestras
Éxito 56% (130) 96% (237)
Ambiguo 42% (98) 2% (7)
¿Marcado correctamente? 41% (95) N/A
Identificado erróneamente 2% (5) 1% (4)
Descubrimiento de especies: nuevos taxones desde
1977
Éxito 100% (40) 100% (40)
Listado correctamente como especie existente 4 29
Correctamente marcado como nueva especie 11 11
Correctamente marcado, pero parte de un complejo
25 N/A
conocido
Basado en la taxonomía de 1977 y la taxonomía actual.
doi: 10.1371/journal.pone.0077882.t002
difiere significativamente entre los hemisferios norte y sur debido a historias
climáticas divergentes durante los últimos 5 millones de años [83,84]. Para los
eslizones de Nueva Zelanda, se sabe que hubo varios períodos de especiación;
el primero ocurrió después de la colonización inicial del país hace
aproximadamente 16-19 millones de años, seguido de eventos más recientes
en respuesta al levantamiento tectónico del Plioceno en la Isla Sur y los ciclos
glaciales del Pleistoceno [66]. Son estos eventos de especiación más recientes
los que han llevado a la ausencia de una brecha en los códigos de barras local
(Figura 2) o global (Figura 1, Tabla 1) en los eslizones de Nueva Zelanda.
Identificación de muestras
Nuestro enfoque retrospectivo en eslizones de Nueva Zelanda destaca
la importancia de la calidad de la base de datos de referencia para la
identificación de muestras. La calidad de la base de datos depende tanto
de i) el número de taxones muestreados como del nivel de muestreo
intraespecífico [24], y ii) de la "exactitud" de la taxonomía utilizada
[29,30,43,50]. Como nuestro estudio se basó en un muestreo detallado
dentro de la especie con una cobertura completa (conjunto de datos de
1977) o casi completa (conjunto de datos actual) de taxones conocidos,
podríamos centrarnos en el impacto de la precisión taxonómica en la
identificación de especímenes.
El éxito en la identificación de especímenes basado en la taxonomía de 1977 fue
de moderado a alto en los métodos basados en Nueva Jersey (97%), basados en
distancia (78-89%) y de emparejamiento (86-98% para Mejor Coincidencia y Mejor
Coincidencia Cercana). Es importante destacar que los enfoques basados en Nueva
Jersey y en la distancia podrían señalar especímenes que supuestamente eran
distintos de los taxones conocidos. El método NJ fue muy preciso (97%) con respecto
a los especímenes que marcó como nuevos, mientras que el umbral utilizado en el
enfoque de Distancia al ejemplar influyó (inversamente) en el número (64-140) y la
precisión (66-97%) de los especímenes. ejemplares marcados. Sin embargo, los
métodos de comparación tuvieron problemas con los problemas taxonómicos
presentes en el conjunto de datos de 1977. Mientras que el enfoque de códigos de
barras para todas las especies
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Código de barras de ADN en eslizones de Nueva Zelanda
detectaron correctamente la presencia de complejos de especies (es decir,
baja tasa de éxito, 26-30%), los métodos Best Match y Best Close Match
informaron un alto "éxito" a pesar de estos problemas taxonómicos. Esta
situación pone de relieve un ejemplo novedoso de la "falacia de coincidencia
más cercana" [50], mediante la cual los especímenes con coincidencias
cercanas "dentro del umbral" en el conjunto de datos de referencia podrían
representar taxones distintos si en el grupo hay complejos de especies no
resueltos.
Nuestro estudio de los eslizones de Nueva Zelanda brinda apoyo
mixto a la sugerencia de que el enfoque de códigos de barras de ADN es
un método taxonómico "atajo" válido en comparación con los enfoques
integrados tradicionales o modernos [9,51]. En primer lugar, nuestro
estudio de códigos de barras se completó en solo unos pocos meses en
comparación con las dos décadas que tomó el enfoque moderno e
integrado (Tabla S1). Sin embargo, como se describió anteriormente en
otros estudios [21,30,43,50], el enfoque de códigos de barras en los
eslizones de Nueva Zelanda no podría haberse implementado sin una
base taxonómica sólida, desarrollada a través de métodos tradicionales
([53]; Tabla S1). En segundo lugar, no pudimos identificar un umbral de
distancia ideal para la delimitación de especies. Según la taxonomía
actual, fueron evidentes altas tasas de error (4-47%) para los enfoques
2-3% y ABGD, mientras que la divergencia intraespecífica 10x arrojó un
umbral irrealmente alto (18,7%). En tercer lugar, para el conjunto de
datos actual, el éxito en la identificación de muestras osciló entre
moderado (53-96%, Distancia al ejemplar; 63-70%, Código de barras de
todas las especies) a alto (88-99%, Mejor coincidencia y Mejor
coincidencia cercana; 96%, árbol de Nueva Jersey). Aunque los casos de
hibridación confundirían cualquier enfoque que se base únicamente en
el ADNmt [85], sería fácilmente detectado por cualquier método
taxonómico integrado [28,31]. Finalmente, la ausencia de la brecha en el
código de barras (Figuras 1, 2), o la selección de un umbral de distancia
inadecuado (Tabla 3), podría llevar a marcar incorrectamente los
especímenes como distintos, perdiendo un tiempo valioso y
obstaculizando el progreso de la documentación y descripción de los
especímenes. verdadera diversidad dentro de un grupo [29].
Descubrimiento de especies
La capacidad del enfoque de códigos de barras de ADN para ayudar con el
descubrimiento de especies ha sido uno de los aspectos más polémicos del
método [7,8,29-31]. Sin embargo, el método basado en Nueva Zelanda asignó
correctamente, ya sea como especies nuevas o existentes, los 13 taxones
(representados por un total de 40 especímenes) descubiertos en Nueva
Zelanda desde 1977. En contraste, el método de Distancia al Ejemplar tuvo
menor éxito, dependiendo de la Umbral de distancia (35-87%). Esto tiene
implicaciones importantes para el potencial de este enfoque para el
descubrimiento de especies, ya que el método ejemplar se relaciona con el
espécimen más cercano a la ubicación tipo y, por lo tanto, es
taxonómicamente relevante. Dado que los métodos ejemplares y de
comparación también tuvieron dificultades para identificar casos de complejos
de especies en el conjunto de datos de 1977, estos enfoques podrían tener
una utilidad limitada para el descubrimiento de especies en estudios de
códigos de barras de ADN.
Conclusiones
Aunque los códigos de barras de ADN no han resultado ser la
panacea para resolver el impedimento taxonómico, todavía hay
un valor sustancial en el enfoque para la biodiversidad y
7 noviembre 2013 | Volumen 8 | Número 11 | e77882
 Código de barras de ADN en eslizones de Nueva Zelanda

Tabla 3.Éxito en la identificación de especímenes en eslizones de Nueva Zelanda.

Método 1977 Taxonomía Taxonomía actual

2% 4% 6% 8% 10% 2% 4% 6% 8% 10%

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA

Distancia al ejemplar

Ejemplar correcto, dentro del umbral. 39% (91) 47% (111) 54% (126) 58% (136) 59% (137) 53% (131) 80% (198) 92% (229) 95% (237) 96% (238)

Correctamente marcado como nueva especie 39% (92) 39% (90) 35% (82) 30% (69) 26% (62) N/A N/A N/A N/A N/A

Marcado incorrectamente como nueva especie 21% (48) 12% (28) 6% (13) 1% (3) 1% (2) 46% (115) 16% (40) 4% (9) 1% (1) 0% (0)

ID como especie incorrecta/No marcado como

1% (2) 2% (4) 5% (12) 11% (25) 14% (32) 1% (2) 4% (10) 4% (10) 4% (10) 4% (10)
nuevo

Mejor partido

Éxito, dentro del umbral 86% (219) 95% (241) 96% (246) 98% (249) 98% (250) 88% (256) 96% (279) 98% (283) 98% (284) 99% (285)

Éxito, fuera del umbral 12% (31) 3% (9) 2% (4) > 1% (1) 0% (0) 10% (29) 2% (6) 1% (2) <1% (1) 0% (0)

Ambiguo 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3)

Identificación errónea 1% (2) 1% (2) 1% (2) 1% (2) 1% (2) <1% (1) <1% (1) <1% (1) <1% (1) <1% (1)

Mejor partido cerrado

Éxito 86% (219) 95% (241) 96% (246) 98% (249) 98% (250) 88% (256) 96% (279) 98% (283) 98% (284) 99% (285)

Ambiguo 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3) 1% (3)

Identificación errónea <1% (1) <1% (1) <1% (1) <1% (1) <1% (1) <1% (1) <1% (1) <1% (1) <1% (1) <1% (1)

Sin coincidencia 13% (32) 4% (10) 2% (5) 1% (2) <1% (1) 10% (29) 2% (6) 1% (2) <1% (1) 0% (0)

Código de barras de todas las especies

Éxito 26% (67) 29% (75) 30% (76) 30% (76) 30% (76) 63% (183) 68% (197) 69% (201) 70% (202) 70% (202)

Ambiguo 61% (156) 67% (170) 68% (174) 69% (177) 70% (178) 27% (77) 30% (86) 30% (86) 30% (86) 30% (87)

Identificación errónea 0% (0) 0% (0) 0% (0) 0% (0) 0% (0) 0% (0) 0% (0) 0% (0) 0% (0) 0% (0)

Ninguna coincidencia cercana 13% (32) 4% (10) 2% (5) 1% (2) <1% (1) 10% (29) 2% (6) 1% (2) <1% (1) 0% (0)

DESCUBRIMIENTO DE ESPECIES

Distancia al ejemplar

Éxito 95% 95% 82% 82% 77% 35% 80% 87% 87% 77%

Agrupados correctamente con especies

2 2 2 2 2 3 21 29 29 29
existentes.

Correctamente marcado como nueva especie 11 11 6 6 4 11 11 6 6 2

Correctamente marcado, pero parte de

25 25 25 25 25 0 0 0 0 0
un complejo conocido

Falla 5% 5% 18% 18% 23% sesenta y cinco% 20% 13% 13% 23%

Marcado incorrectamente como una nueva

2 2 2 2 2 26 8 0 0 0
especie

Agrupado incorrectamente con una especie

0 0 5 5 7 0 0 5 5 9
existente

Uso de métodos basados en la distancia (Distancia al ejemplar más cercano) y de coincidencia (Mejor coincidencia, Mejor coincidencia cercana, Código de barras de todas las especies) para eslizones de Nueva

Zelanda según la taxonomía de 1977 y la taxonomía actual. El éxito de la identificación se evaluó utilizando una variedad de umbrales de distancia K2P (2, 4, 6, 8, 10%). También se investigó la eficacia del enfoque

basado en la distancia para el descubrimiento de especies para los nuevos taxones descubiertos desde 1977.

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estudios taxonómicos. Representa un enfoque ideal para realizar marco para enfoques taxonómicos integrados posteriores y más
estudios preliminares rápidos de grupos bien caracterizados o de detallados [9]. En consecuencia, los estudios de códigos de barras de
grupos taxonómicos o regiones geográficas poco conocidos; con el ADN se están alejando cada vez más de los enfoques tradicionales
estudio inicial de códigos de barras proporcionando una basados únicamente en COI e incorporando estadísticas sofisticadas.

MÁS UNO | www.plosone.org 8 noviembre 2013 | Volumen 8 | Número 11 | e77882


enfoques para la delimitación de especies (por ejemplo, Delineación
bayesiana de especies [86,87], modelo coalescente mixto generalizado
de Yule [88,89], ABGD [22], Membresía difusa [90]), incluidos ADNmt
adicionales o genes nucleares [9,51], y adoptar enfoques taxonómicos
integrados [16,51,91]. En particular, los métodos basados en caracteres,
que no formaban parte de los enfoques originales de códigos de barras
de ADN, se han utilizado cada vez más en una variedad de taxones
[9,18,92-95]. Al adoptar estos enfoques modificados, los investigadores
se están alejando de algunos elementos de la filosofía y los conceptos
iniciales que sustentaron el enfoque de los códigos de barras de ADN, y
se están acercando a un método integrado más sólido que está mejor
equipado para abordar el impedimento taxonómico actual y acelerar el
ritmo de descubrimiento de especies. y descripción.
información de soporte
Tabla S1. Comparación de la taxonomía actual de los eslizones
de Nueva Zelanda con la reconocida en 1977, antes de la
implementación de técnicas moleculares modernas.Evidencia en
la que se basa la taxonomía actual: 1: aloenzimas, 2: datos de
secuencia de ADN mitocondrial, 3: datos de secuencia de ADN
nuclear, 4: datos morfológicos, 5: cambio taxonómico propuesto
aún por confirmar.
(PDF)
Tabla S2. Datos de localidad, ejemplar de vale de museo.
información y números de acceso de GenBank para las
muestras de eslizones de Nueva Zelanda utilizadas en este
estudio.Las muestras con códigos CD o FT se obtuvieron de la
Colección Nacional de Tejidos Congelados (NFTC) ubicada en la
Universidad Victoria de Wellington, Nueva Zelanda (los especímenes
de vales asociados ahora se encuentran en Te Papa). Las muestras
con códigos RE se obtuvieron de Te Papa, Museo Nacional de Nueva
Zelanda, Wellington (los códigos S se refieren a especímenes de la
antigua colección de la División de Ecología, ahora alojada en Te
Papa). Las muestras con códigos ABTC (Colección Australiana de
Tejidos Biológicos) se obtuvieron del Museo de Australia del Sur. Se
obtuvieron muestras con códigos NR y EBU del Museo Australiano.
Los asteriscos indican los ejemplares ejemplares.
(PDF)
Tabla S3. Cebadores oligonucleotídicos utilizados en este estudio para
amplificar y secuenciar COI en eslizones de Nueva Zelanda.
(PDF)
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Código de barras de ADN en eslizones de Nueva Zelanda
Tabla S4. Criterios de identificación de consultas para los métodos de
comparación y basados en Nueva Jersey (modificados de Meier et al. 2006).
(PDF)
Tabla S5. Número de muestras y localidades geográficas utilizadas en el
estudio de códigos de barras de ADN de eslizones de Nueva Zelanda
basado en la taxonomía de 1977.(Consulte las Tablas S1 y S2 para obtener
detalles adicionales). El nivel (media ± error estándar [SE] y rango) de las
distancias genéticas K2P intraespecíficas se muestra para cada especie de
eslizón de Nueva Zelanda. Se indican los códigos de muestra (ver Tabla S2)
para los nuevos descubrimientos desde 1977.
(PDF)
Tabla S6. Número de muestras y localidades geográficas utilizadas
en el estudio de códigos de barras de ADN de eslizones de Nueva
Zelanda (génerooligosoma).(Consulte la Tabla S2 para obtener detalles
adicionales). El nivel (media ± error estándar [SE] y rango) de distancias
genéticas K2P intraespecíficas en cada especie de eslizón de Nueva
Zelanda. La taxonomía sigue la lista actual de Clasificación de Amenazas
de Nueva Zelanda (Hitchmough et al. 2010).
(PDF)
Figura S1. Árbol de unión de vecinos (con 1000 bootstraps) para
eslizones de Nueva Zelanda basado en la taxonomía de 1977. Los
asteriscos indican los especímenes ejemplares de cada especie (consulte
la Tabla S2). Los detalles de la localidad se proporcionan en la Tabla S2.
(PDF)
Figura S2. Árbol de unión de vecinos (con 1000 bootstraps) para
eslizones de Nueva Zelanda según la taxonomía actual. Los asteriscos
indican los especímenes ejemplares de cada especie (consulte la Tabla
S2). Los detalles de la localidad se proporcionan en la Tabla S2. (PDF)
Agradecimientos
Agradecemos a L. Berry, S. Chapple, C. Daugherty, D. Gleeson,
K. Hare, R. Hitchmough, S. Keall, L. Liggins, G. Patterson, S.
O'Neill y T. Whitaker por su ayuda. durante el estudio.
Contribuciones de autor
Concibió y diseñó los experimentos: DGC PAR. Realizó los
experimentos: DGC. Analizados los datos: DGC. Reactivos/
materiales/herramientas de análisis aportados: DGC PAR.
Escribió el manuscrito: DGC PAR.
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