APLICADO A

INMUNOHEMATOLOGI
A
PRINCIPALES
TECNICAS
MOLECULARES
Lic. TM. Héctor Herrera Reynoso
Esp.: Citogenética y Biología Molecular
 Review: Molecular blood grouping of donors
Maryse St-Louis. Transfusion and Apheresis Science 50 (2014) 175–182

Durante muchas décadas, la hemaglutinación ha sido el único

medio para seleccionar los donantes de sangre, desde la
primera clonación de genes del grupo sanguíneo a principios
de 1990, el conocimiento de las bases moleculares de la
mayoría de los antígenos de glóbulos rojos, plaquetas y
neutrófilos trajeron la posibilidad de utilizar NAT para predecir
el fenotipo. Esta revisión resume las metodologías disponibles
para determinar el genotipo de los grupos sanguíneos las
plataformas disponibles comercialmente para ser
desarrollados en los laboratorios. El autor también comparte
su visión del futuro de la medicina transfusional.
 Antígenos de grupos sanguíneos
 Un antígeno de grupo sanguíneo es un carbohidrato o una
proteína que induce una respuesta inmune y el anticuerpo
producido reacciona con el antígeno de alguna forma
observable

 Diferencias en carbohidratos y proteínas en la superficie

externa de la membrana eritrocitaria forman la base de los
antígenos de grupos sanguíneos - el principal aspecto de la
inmunohematología

 El conocimiento sobre las principales variaciones en la

membrana eritrocitaria se utiliza para detectar e identificar
anticuerpos, lo que asegura que la sangre correcta será
transfundida al paciente correcto
Biología Molecular de Grupos Sanguíneos
 El conocimiento sobre las principales alteraciones de los
genes que codifican los antígenos de grupos sanguíneos y
que cambian su composición de aminoácidos está siendo
actualmente utilizado para identificar antígenos, lo que
también puede asegurar que la sangre correcta será
transfundida al paciente correcto

 Métodos moleculares han mostrado ser herramientas útiles

 Esta práctica puede generar un sistema eficiente que

minimizará los riesgos inmunes asociados a la transfusión
sanguínea

“Es importante conocer los mecanismos moleculares asociados

a la expresión de los antígenos de grupos sanguíneos”
Molecular basis of blood group expression
Gregory A. Denomme. Transfusion and Apheresis Science 44 (2011) 53–63

 La diversidad de antígenos surge de los cambios a nivel de genes que van desde
un polimorfismos solo nucleótido (SNPs) hasta intercambios intra e inter-
génicas, inversiones, inserciones y deleciones.

 Los cambios de nucleótidos a menudo resultan en diferencia de un aminoácido a

partir del producto de un gen de tipo salvaje y con esos cambios surgen nuevos
antígenos de los grupos sanguíneos. Alternativamente, hay una pérdida de
expresión en total, que se considera el fenotipo 'nulo'. Acercarse a un
conocimiento completo de los cambios genéticos que subyace a la expresión de
antígenos de grupo sanguíneo dará lugar a la realidad que el genotipado de
glóbulos rojos como un registro de prueba de paso. La importancia de las
pruebas moleculares en inmunohematología requiere programas de formación y
competencia adecuadas para garantizar que el personal altamente calificado
tenga los conocimientos apropiados. Esta revisión resume los mecanismos
básicos para la expresión de genes y proporciona una recopilación de la base
molecular para la expresión del grupo sanguíneo.
 Review: Molecular blood grouping of donors
Maryse St-Louis. Transfusion and Apheresis Science 50 (2014) 175–182

 Durante muchas décadas, la hemaglutinación ha sido el

único medio para seleccionar los donantes de sangre, desde
la primera clonación de genes del grupo sanguíneo a
principios de 1990, el conocimiento de las bases
moleculares de la mayoría de los antígenos de glóbulos
rojos, plaquetas y neutrófilos trajeron la posibilidad de
utilizar NAT para predecir el fenotipo. Esta revisión resume
las metodologías disponibles para determinar el genotipo
de los grupos sanguíneos las plataformas disponibles
comercialmente para ser desarrollados en los laboratorios.
El autor también comparte su visión del futuro de la
medicina transfusional.
Molecular Pathology in Transfusion Medicine
Matthew B. Elkins, MD, PhDa,*, Robertson D. Davenport, MDb, Barbara A. O’Malley, MDc, Martin H.
Bluth, MD, PhDd Clin Lab Med 33 (2013) 805–816

Las pruebas realizadas en la medicina transfusional se centran en

la detección de antígenos expresados en la membrana celular de
los glóbulos rojos (RBC) y / o plaquetas y la detección de
anticuerpos contra RBC o antígenos de plaquetas en el plasma de
un paciente. La detección de estos antígenos y anticuerpos se
deben a que RBC o unidades críticas de plaquetas que son
positivas para un antígeno dado y que se transfunden en un
paciente tiene anticuerpos contra ese antígeno específico y puede
causar disminución de la supervivencia de productos sanguíneos,
reacciones hemolíticas transfusionales, reacciones hiperhemólisis,
e incluso la muerte.
CONCLUSIONES
 La utilización de métodos moleculares en inmunohematología requiere
el conocimiento de las bases moleculares de los antígenos de grupos
sanguíneos, de entrenamiento apropiado del personal técnico y de
programas de proeficiencia para garantizar resultados confiables y
asegurar que la sangre correcta será transfundida al paciente correcto

 Las plataformas de genotipado son una gran conquista actual

 Una de las grandes promesas para el futuro es la técnica de "next

generation secuencing" que tiene la capacidad de secuenciar muchas
regiones del genoma en un solo ensayo para varios individuos
PRINCIPALES TECNICAS DE
BIOLOGIA MOLECULAR
DETERMINACIÓN DE LA
CONCENTRACION DE ADN
ABSORCION LUZ UV
DETERMINACION [ADN]
 Características Fisicoquímicas del
ADN
CARGA ELECTRICA

La carga eléctrica del DNA está

determinada
por: - Grupos fosfatos
- Asociaciones con proteínas
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
 De donde nace la idea

• Kary Mullis (1944-, UC Berkeley PhD), concibe la idea en

1983, mientras trabaja para la Cetus Corp.
(Biotecnología)
• Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and
Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin
genomic sequences and restriction site analysis for
diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54
• Los detalles de la PCR se publican después.
• Un proceso muy tedioso
En qué consiste la PCR
• La Reacción en Cadena de la Polimerasa no es sino
un copiado (amplificación) enzimático de un
fragmento determinado de DNA.
• Esta técnica imita la replicación natural del DNA,
pero in vitro.

DNA
(una copia) DNA
PCR (muchas copias)
 Síntesis por la polimerasa DNA
natural
Este primer hibridiza (se une
en forma complementaria)
a la cadena a ser copiada

3´
5´− T − A − C − G −

3´− A − T − G − C − A − T − G − C − A − T − G − C − * * 5´
Síntesis por la polimerasa DNA
natural

3´
5´− T − A − C − G − T −

3´− A − T − G − C − A − T − G − C − A − T − G − C − * * 5´
Síntesis por la polimerasa DNA
natural

3´
5´− T − A − C − G − T − A −

3´− A − T − G − C − A − T − G − C − A − T − G − C − * * 5´
Síntesis por la polimerasa DNA
natural

3´
5´− T − A − C − G − T − A − C −

3´− A − T − G − C − A − T − G − C − A − T − G − C − * * 5´
Síntesis por la polimerasa DNA natural

3´
5´− T − A − C − G − T − A − C − G −

3´− A − T − G − C − A − T − G − C − A − T − G − C − * * 5´
Síntesis por la polimerasa DNA
natural

3´
5´− T − A − C − G − T − A − C − G − T −

3´− A − T − G − C − A − T − G − C − A − T − G − C − * * 5´
Síntesis por la polimerasa DNA
natural

3´
5´− T − A − C − G − T − A − C − G − T − A −

3´− A − T − G − C − A − T − G − C − A − T − G − C − * * 5´
Síntesis por la polimerasa DNA
natural

3´
5´− T − A − C − G − T − A − C − G − T − A − C −

3´− A − T − G − C − A − T − G − C − A − T − G − C − * * 5´
Síntesis por la polimerasa DNA
natural

3´
5´− T − A − C − G − T − A − C − G − T − A − C − G −

3´− A − T − G − C − A − T − G − C − A − T − G − C − * * 5´
Síntesis por la polimerasa DNA
natural

Primer 1 Extensión de la cadena copiada por la polimerasa

Cadena original de DNA

 In vitro (PCR)
Requisitos:
1. Una hebra molde o templado de DNA (muestra purificada)
2. Iniciadores, cebadores o primers: secuencias cortas de
desoxirribonucleótidos (DNA) complementarias a la cadena de
DNA molde o templado.
3. dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfatados (4 tipos), para ir
agregando a medida que la cadena se extiende.
4. DNA polimerasa: enzima que hace posible la extensión de la
cadena.
5. Buffers
6. Tubos especiales de paredes delgadas (eppendorf)
7. Un instrumento que permita variar la temperatura en períodos
muy breves: termociclador
8. Un programa que controle al instrumento en los parámetros
adecuados.
 Resumen del proceso
Temperatura

100
Desnaturalización
94 oC

50

0
Tiempo
 Resumen del proceso
Temperatura

100
Desnaturalización
94 oC Hibridación
de primers
50 50 oC

0
Tiempo
 Resumen del proceso
Temperatura

100
Desnaturalización
94 oC Hibridación Extensión
de primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
 Resumen del proceso

Primer ciclo
Temperatura

100
Desnaturalización Desnaturalización
94 oC Hibridación Extensión 94 oC
de primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo

…y el proceso se repite de 20 a 40 veces !

 Pasos de la PCR
• Entonces, la base de la PCR es el cambio de T° y el efecto que este
cambio produce sobre el DNA.
• En una reacción común, la serie de pasos que se mencionan a
continuación se repiten de 20 a 40 veces (25 ciclos amplifican el
fragmento de DNA deseado uno millón de veces).

Paso 1: Desnaturalización del DNA a 95C. El DNA se desnaturaliza

(las hebras se separan)

Paso 2: Los primers Hibridizan. A 40C- 65C, los primers hibridizan

(o se unen a) sus secuencias complementarias en las cadenas
simples de DNA

Paso 3: La polimerasa DNA Extiende la cadena de DNA. A 72C, la

polimerasa DNA extiende la cadena de DNA agregando
nucleótidos al extremo 3’ de los primers.
1 Desnaturalización

5’ 3’
3’ 5’

5’ 3’

Esto ocurre a 94-95 ºC

imitando la función de
la helicasa celular.
3’ 5’
 2 Hibridación (annealing)
Los primers se unen a la
secuencia complementaria
en el ADN diana. Estos se
eligen de manera que uno 5’ 3’
sea complementario a una 3’ 5’ Reverse Primer
cadena en un extremo de la
secuencia diana y que el Forward Primer 5’ 3’
otro sea complementario a 3’ 5’
la otra cadena en el otro
extremo de la secuencia La temperatura de hibridación de un primer
diana. Suele ser alrededor particular se relaciona a su longitud y secuencia
de 50 °C. (contenido de G+C). Hay dos variables principales
para determinar las condiciones de hibridación para
una reacción PCR particular:
1) Temperatura de hibridación y
2) La concentración de iones Mg++.
3 Extensión
La DNA polimerasa
cataliza la extensión de
la cadena en la dirección
5’ 3’, comenzando a
nivel de los primers, y
fijando el nucleótido 5’ 3’
adecuado (A-T, C-G). 3’ 5’
extension
Suele activarse a 72 °C
extension
5’ 3’
3’ 5’
 …y cada ciclo

5’ 3’

3’ 5’
5’ 3’

3’ 5’ 5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’

5’ 3’ 5’ 3’
Cada nuevo ciclo 3’ 5’
empezará por la 3’ 5’
desnaturalización 5’ 3’
de las cadenas de 3’ 5’
DNA formadas en
el ciclo anterior
Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) en
tiempo real
 PCR en tiempo Real - qPCR
Es la detección del producto de amplificación
mientras va desarrollándose la reacción (tiempo real),
ayudado por una molécula reportera o indicadora.

Técnica que permite amplificar, detectar y cuantificar

el ácido nucléico, teniendo como fundamento la
técnica de la PCR.
En la PCR en
Tiempo Real, el
investigador
realmente ve el
incremento en la
cantidad de DNA
a medida que es
amplificado
PCR convencional PCR en tiempo real
Análisis del punto final: Identifica los productos en
(electroforesis en geles) la fase exponencial
Sensible y cualitativa Altamente sensible y
cuantitativa
Requiere las etapas de
amplificación y Fusiona las etapas de
detección por separado amplificación y detección.
Potencial contaminación Contaminación muy
con amplicones limitada
 ¿Qué nos permite hacer?
• Cuantificación del número de copias de DNA
presentes en una muestra
• Diagnóstico y Monitoreo de carga viral
• Comparación entre número de copias en diferentes
momentos
• Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real
• Análisis de la expresión de genes en diferentes tejidos
• Análisis de la expresión de genes en diferentes condiciones
normales vs patológicas
• Efecto de drogas
• Análisis de la cinética de la reacción
 Fundamento
• La detección es por fluorescencia
• La emisión de fluorescencia en la reacción es
proporcional a la cantidad de DNA formado
• Se conoce en cada momento la cinética de reacción
de amplificación
• El instrumento incorpora un lector de fluorescencia
• Puede medir en cualquier momento la fluorescencia
emitida en cada uno de los viales de reacción
• Los sistemas de detección pueden ser por agentes
intercalantes o sondas específicas
Corte de un termociclador en tiempo real
Inicia con una mezcla PCR básica
 Se agregan sondas fluorescentes a la mezcla
Una fuente luminosa del instrumento PCR excita la fluorescencia
Un sensor o cámara captura las señales fluorescentes
 A medida que la amplificación procede, la acumulación de la
fluorescencia es capturada por el instrumento en cada ciclo, y se
plasma en el gráfico PCR en Tiempo Real
En la PCR a Tiempo Real hay 3 estadios de amplificación:
1. Exponencial
2. Lineal
3. Meseta
1. Fase Exponencial
Los reactivos están en abundancia y los productos PCR se
duplican en cada ciclo.
2. Fase Lineal
Los reactivos empiezan a disminuir y los productos PCR se
generan cada vez más lentamente.
3. Fase Meseta
Los reactivos se han acabado y la reacción PCR se detiene.
La PCR en Tiempo Real se enfoca en la fase exponencial
debido a esta fase provee los datos más precisos y exactos
para la cuantificación.
En la Fase Exponencial se calcula dos valores
La línea de umbral es el nivel de detección o el punto en el
que la reacción alcanza una intensidad de fluorescencia por
encima del fondo
El ciclo PCR en el que la muestra alcanza este nivel se llama
umbral de ciclo , Ct. El valor Ct se usa en cuantificación o en la
detección por presencia/ausencia.
La PCR en Tiempo Real presenta varias ventajas sobre la PCR
convencional:

es más sensible

es cuantitativa

es más rápida -
no requiere gel

es más segura –
sin bromuro ni
radioactividad
Cuantificación de ácidos
nucleicos
• Cuantificación Absoluta
– Compara los valores Ct de las muestras problema
en relación a una curva estándar.
– Resultado del análisis: cantidad de ácido nucleico
(nº de copias, µg) por una cantidad de muestra (por
célula, por µg de RNA total por ml de sangre)
 Cuantificación

Cada muestra presenta una Ct
característica, que es una referencia
inversa del número de copias al
inicio de la reacción. En este
momento no se conoce el número
de copias.
Estos datos llevados a una curva patrón o
estándar, correlacionan con una concentración
de DNA en la muestra, correspondiente al
número de copias.
Cuantificación
El ciclo en el que se
empieza a detectar el
aumento de
fluorescencia se
denomina punto de
corte (Cp, de crossing
point) o ciclo umbral
(Ct, de threshold
cycle).
Cuantificación Absoluta
Cuantificación Absoluta
Cuantificación Absoluta
• Los calibradores/ estándares de cuantificación
pueden ser:
– Moléculas purificadas del blanco (oligonucleótidos
sintéticos de RNA o DNA que abarquen el amplicón
completo de PCR)
– Plásmidos
– cDNA clonado en plásmidos
– RNA o DNA de muestras biológicas específicas, o
estándares biológicos reconocidos internacionalmente
 Cuantificación de ácidos
nucleicos
• Cuantificación Relativa:
– Proporciona la cantidad relativa (fold difference) de un
ácido nucleico blanco para cantidades equivalentes de
una muestra problema y una muestra control.
– Comparación de los niveles de expresión de un gen
entre distintos tejidos o entre diferentes condiciones
biológicas.
– Compararción de los niveles de expresión de alelos
wild-type vs mutados.

Vandenbroucke et al., Nucleic Acids Research, 2001.

 Análisis de curvas de disociación
Se basa en la aplicación de un
gradiente de temperaturas
creciente después de la PCR
para monitorizar la cinética de
disociación de los fragmentos
amplificados. Mediante esta
aplicación se puede determinar
la Tm de los amplicones para
comprobar su especificidad.
consideraciones
• Controles
• Problemas de Inhibición - falsos negativos
• Estándares internos (genes de referencia,
control interno, control de carga, triplicados)
• Optimización
• Reproducibilidad
• Validación
• Personal
• Costos