UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Dr. Eloy López Medina

seellome88@gmail.com
 PRE-HISTORIA
1756. Henri-louisDuhamel du Monceau. “Seigneur du
Monceau et de Vrigny”. Cambium vascular corteza
de olmo.
1838. Schwann, Schleiden. Totipotencialidad celular.
1878. Vochting. Polaridad
1892. Sachs, Knopp. Nutrición mineral.
1892. Klercker. Aisla protoplastos mediante métodos
mecánicos.
1893. Rechinger. Tamaño Mínimo de explante
 HISTORIA
 1902. Haberlandt. Primer intento cultivo tejidos vegetales.
 1908. Simons. Indujo formación de callos, brotes y raíces en medios
no asépticos y no hizo transferencias.
 1922. Knudson. Germinación de semillas de orquídeas.
 1934. Gautheret. Cultivo de tejido cambial de salix.
 1934. White. Cultivo raíces de tomate.
 1934. Kogl. Reporta funciones del AIA
 1939. Gautheret, Nobecourt, White. Crecimiento continuo cultivo
de callo.
 1941. Braun. Utiliza por primera vez leche de coco.
 1942. Gautheret. Habituación.
 1946. Ball. Principios de Micropropagación, ápices caulinares
Tropaeolum sp
 1948. Skoog y Tsui. Formación de raíces y vástagos adventicios.
Relación citocinina/auxina.
 1952. Morel y Martin, Obtención de dalias libres de virus.
Primera aplicación del microinjerto.
 1954. Muir. Obtención de la primera planta a partir de una célula.
 1955.- Miller. Descubrimiento de la Kinetina.
 1956. Tulecke y Nickell. Crecimiento de cultivos en sistemas de
suspensión, metabolitos secundarios.
 1958. Maheswari y Rangaswmy. Regeneración in vitro de
embriones somáticos.
 1960. Coocking. Degradación enzimática para la obtención de
protoplastos.
 1962. Murashige y Skoog. Medio de cultivo.
 1964. Guha y Maheswari. Primeras plantas haploides.
 1971. Takebe. Primeras plantas regeneradas a partir de
protoplastos.
 1947. Reinhard. Biotransformación en cultivo de tejidos
vegetales.
 1982. Krens. Hace posible la transformación con DNA aislado.
 1985. Horsch. Regeneración de plantas transformadas con
Agrobacterium tumefasciens.
 CULTIVOS DE TEJIDOS
VEGETALES ¿in vitro?

Definición
Heterogéneo grupo de técnicas
mediante las cuales un explante se
cultiva asépticamente y se incuba en
condiciones ambientales controladas.
 SISTEMAS DE CULTIVO DE
TEJIDOS VEGETALES
De Fossard, 1977. Para las plantas superiores, distingue los
siguientes tipos de sistemas de cultivo:

ORGANIZADO. Cultivo de: Meristemas, yemas, nudos,

esquejes, embriones, semillas, donde se mantiene la
estructura característica del órgano o de la planta.
La descendencia obtenida es idéntica al material
original.

NO ORGANIZADO. Cultivo de: Callos, células, polen,

óvulos, agregados celulares, protoplastos.
 La estabilidad genética de los cultivos es frecuentemente baja.
 MICROPROPAGACION
 Consiste en la propagación de un genotipo a
gran escala a través de técnicas de cultivo de
tejidos.
 Se usa para referirse a la utilización de las
técnicas de cultivo in vitro aplicadas a la
propagación vegetativa de plantas.
 Cultivo de tejidos vegetales: Se refiere al
cultivo in vitro de partes de la planta (tejidos o
frecuentemente órganos).
ALCANCES MICROPROPAGACIÓN VEGETAL
 Propagación vegetativa rápida y a gran escala.
 Uniformidad seleccionada del material clonado.
 Multiplicación de plantas recalcitrantes
a las técnicas convencionales.
 Reducción en el tiempo de multiplicación
y en el espacio requerido para tal fin.
 Mayor control sobre la sanidad del material
propagado.
 Introducción rápida de nuevos cultivares.
 Conservación de germoplasma.
 Facilidades para el intercambio internacional
de material vegetal.
GLADIOLO
SEMILLA DE PIÑA
ESTEVIA
ORQUIDEAS
CONSERVANDO LA BIODIVERSIDAD
 FASES
FASE 0: Preparación de la planta madre
FASE I: Establecimiento del cultivo en
condiciones de asepsia
FASE II: Multiplicación de brotes
FASE III: Enraizamiento
FASE IV: Aclimatación

Generalmente las etapas de enraizamiento y

aclimatación pueden combinarse en
condiciones ex vitro.
 ESTABLECIMIENTO
 Dependerá en gran medida del tipo de
explante y del sistema de cultivo que se
emplee.
 Del objetivo perseguido.
 Un sistema de cultivo puede ser de utilidad
para el logro de un objetivo pero no puede ser
útil para otro.
 OBJETIVOS:
 Propagación de plantas.
 Obtención de plantas libres de patógenos.
 Conservación e intercambio de Germoplasma.
 Incremento de la variabilidad genética.
 Bioconversión y producción de compuestos
útiles.
 Estudio básico de fisiología, genética,
bioquímica y ciencias afines.
 ASPECTOS COMUNES AL
ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO :
 Se recomienda a partir de plantas de invernadero o
semillas germinadas asépticamente.
 Su elección estará determinada por el objetivo
perseguido y la especie vegetal utilizada.
 Tener en cuenta la variabilidad asociada con el
genotipo de la planta.
 Las respuestas de los explantes cultivados pueden
variar con el estado de desarrollo y edad ontogénica
de los mismos.
 Tamaño del explante.
 EXPLANTE:
 Cualquier estructura vegetal utilizada para iniciar un
sistema de cultivo in vitro.
 Se recomienda a partir de plantas de invernadero o
semillas germinadas asépticamente.
 Su elección estará determinada por el objetivo
perseguido y la especie vegetal utilizada.
 Tener en cuenta la variabilidad asociada con el
genotipo de la planta.
 Las respuestas de los explantes cultivados pueden
variar con el estado de desarrollo y edad ontogénica
de los mismos.
 Fruto:Semillas Nudos
Yemas

Callo Fragmento hoja

Esquejes
 ASEPSIA
Es conveniente o necesario:
 Trabajar en ambientes adecuados.
 Esterilizar los medios de cultivo.
 Desinfestar superficialmente el explante,
liberándolo de bacterias y hongos exógenos.
 Respetar las normas de asepsia.
 DESINFESTACIÓN
 Alcohol etílico al 70% v/v.
 Hipoclorito de sodio (NaOCl) 1- 3%.
 Hipoclorito de Calcio {Ca(OCl)2} 6-12%.
 Cloruro de mercurio (HgCl2) 0.1-1.5%.
 Agente tensoactivo (Tween 20, 80) 0.01-0.1%.
 Lavar con agua destilada estéril
 PRECAUCIONES EN LA
CAMARA DE TRANSFERENCIA.
 Desinfestar la mesa y paredes de la cámara con
etanol, así como la superficie de los recipientes.
 Desinfestar Manos y antebrazos del cultivador con
hipoclorito de calcio al 1% o alcohol etílico al 70%.
 Flamear con etanol 95% los instrumentos metálicos.
 Realizar operaciones de transferencia lo más cerca
posible a la llama de un mechero.
 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de órganos y tejidos
vegetales
Agua
Sustancias orgánicas Macro Micro
elementos
Azúcares N Fe Co
Aminoácidos P Zn Ni
Vitaminas K B Al
Auxinas Ca Mn Mo
Citokininas pH
Mg Cu I
Reguladores Giberelinas S
Acido abscísico
Etileno
Mezclas de sustancias Extracto de levadura
poco definidas Leche de coco
Extractos vegetales
Hidrolizado de caseína
 AGUA
Constituye el 95% del medio nutritivo por tanto
debe ser de buena calidad.
Destilada.
Bidestilada.
Su almacenamiento en recipientes de polietileno,
o vidrio pyrex.
Una alternativa sería el uso de agua desionizada.
H2O Q.P.. H20 2Q.P.
 SUSTANCIAS ORGANICAS
AZUCAR
 Componente muy importante en cualquier medio de
cultivo esencial para el crecimiento y desarrollo.
 Los tejidos verdes no son suficientemente autotróficos
in vitro.
 Generalmente se utiliza una concentración de 1-5% de
sacarosa.
 En algunos casos se puede utilizar glucosa y fructosa.
 La sacarosa de los supermercados resulta
generalmente adecuada.
AMINOACIDOS
 Sustancias orgánicas utilizadas como fuentes
de nitrógeno orgánico. Varían con la especie,
variedad, tipo de órgano, estado fisiológico,
estado nutricional, microclima.

 Glicina, alanina, cisteína, metionina, caseína,

sulfato de adenina.
VITAMINAS
Tienen una función catalítica en los sistemas enzimáticos
y se requieren en pocas cantidades, su presencia estimula
el crecimiento de los explantes.

*Tiamina
Acido nicotínico
Piridoxina
Acido pantoténico
Mio-inositol
Acido fólico
Riboflavina
Acido ascórbico
Biotina.
REGULADORES DE CRECIMIENTO
 Sustancias orgánicas diferentes de los nutrientes
que en pequeñísimas cantidades, estimulan,
inhiben, aceleran, regulan los diversos procesos del
crecimiento y desarrollo.
 Actúan generalmente en lugares diferentes a donde
fueron producidas.
 Fitohormonas y fitorreguladores.
 Teoría del balance hormonal:
1. Citocinina/auxina > 1 : brotes
2. Citocinina/auxina < 1: raíces
3. Citocinina/auxina = 1: tejidos indiferenciados.
AUXINAS

 Del griego Auxein = crecer.

 Crecimiento en longitud de la célula, elongación de
nudos, tropismos, dominancia apical, abscisión y
principalmente enrizamiento.
1. Ac. Indolacético, AIA
2. Ac. Indolbutírico, IBA
3. Ac. Naftalenoacético, ANA
4. 2,4-diclorofenoxiacético, 2,4-D
5. 2,4,5-triclorofenoxiacético.
CITOQUININAS
 Citocinesis = División Celular
 Promueve la división celular, morfogénesis,
inhibe dominancia apical, expansión de hojas,
desarrollo de cloroplastos, retardo de
senescencia, germinación de Semillas, etc.
1. Zeatina, ZEA
2. Isopentenil adenina, IPA
3. Benzil amino purina, BAP
4. Furfuril amino purina o kinetina, KIN
GIBERELINAS
 Único grupo de hormonas que estimulan el
crecimiento de plantas intactas.
 Intervienen en elongación de entrenudos,
crecimiento de meristemos y yemas, rotura
de dormancia de embriones y yemas,
producción enzimática durante la
germinación, etc.

Ac. Giberélico, AG3.

ACIDO ABSCISICO
 Sintetizada y transportada desde las hojas adultas.
 Es la hormona del Estrés.
 Produce un efecto negativo en los cultivos in vitro.
promueven cierre de estomas, síntesis de proteínas
de reserva, induce y mantiene la dormancia.

ETILENO
 Se sintetiza a partir de la metionina.
 Se transporta por difusión en forma de gas.
Participa en el crecimiento de yemas y su
diferenciación, promueve la formación de raíces
adventicias, abscisión y senescencia de hojas.
 SUSTANCIAS ORGANICAS
 Extracto de levadura
 Leche de coco
 Extractos vegetales
 Hidrolizados de caseína
 Peptona y
 Triptona.
 pH

El pH final del medio de cultivo es un factor

importante por diversas razones:
 Inferior a 3.5 impide la solidificación de los agentes
gelificantes.
 Puede afectar la solubilidad de algunos
componentes del medio de cultivo.
 Puede afectar la absorción de determinados
nutrientes por parte del explanto.
 Puede afectar al pH del citoplasma y como
consecuencia a la actividad de muchos enzimas.
 AGENTES GELIFICANTES
Constituyen los mecanismos de soporte par los
explantes.
 Agar comercial. Constituido por agarosa y
agaropectina: bactiagar, Noble agar, agar purificado.
 Phytagel. Gelificante sintético polímero del ac.
Glucurónico, rhamnosa y O-acetilmoieties,
producido por fermentación microbiana.
 SOLUCIONES MADRES PARA
PREPARAR EL MEDIO BASAL
Solución Constituyentes Cant./Const./ Vol./Sol. Madre/
N° Sol. Madre litro Medio Basal
1 NH4NO3 82,500 mg
KNO3 95,000 mg
MgSO4.7H2O 18,500 mg
KH2PO4 8,500 mg 20 ml
2 H3BO3 620 mg
MnSO4.H2O 2,176 mg
ZnSO4.7H2O 860 mg
Na2MoO4.2H2O 25 mg
CuSO4.5H2O 2.5 mg
CoCl2.6H2O 2.5 mg 1.0 ml
3 KI 75 mg 1.0 ml
4 CaCl2.2H2O 15,000 mg 2.9 ml
5 Na2EDTA 1,492 mg
FeSO4.7H2O 1,114 mg 5.0 ml
6 Tiamina. HCl 20 mg 4.10 ml
7 m-Inositol 1,600 mg 12.5 ml
MS
1,962
 ¿COMO DEBE ORGANIZARSE UN
LABORATORIO?
A. Con fines de investigación y docencia
B. Con fines de Producción masiva de plantas.
C. Instalaciones:
1. Ambientes de Laboratorio:
a. Recepción de plantas
b. Preparación de medios de cultivo
c. Transferencia
d. Incubación.
2. Invernadero: Casa de Mallas.
a. Sala de ingreso
b. Sala de materiales, fertilizantes y reactivos.
c. Ambiente de Camas de enraizamiento y almacigueras.
SALA DE PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
SALA DE TRANSFERENCIA
SALA DE INCUBACION
 CONDICIONES AMBIENTALES
 Incubación en ambientes controlados.
 Las respuestas morfogenéticas pueden ser
alteradas por la temperatura; calidad,
intensidad y duración de la luz.
 Lámparas fluorescentes luz de día, foto
período/escoto período 16/8.
 Temperatura entre 25-28o C.
 Humedad Relativa 85%.
GRACIAS