BIOTECNOLOGIA

Es la aplicación de organismos vivos en

procesos analógicos para beneficios de
hombre.

La biotecnología es uno de los campos

multidisciplinarios que mayor expansión se ha
experimentado, considerándose prioritario
para el desarrollo tecnológico del país, dadas
las posibilidades que ofrece para producir
bienes y servicios a través de procesos
biológicos intensivos y controlados en lugar de
los tradicionales procesos biológicos y/o
químicos extensivos.
1
 Biotecnología:

Campo del conocimiento dirigido a la

producción de bienes y servicios mediante
sistemas biológicos y sus productos.

Aprovecha enzimas, microorganismos,

tejidos celulares, estructuras subcelulares,
etc.

Cultivo de tejidos

BIOTECNOLOGIA

Ingeniería genética
2
Es interdisciplinaria
Microbiología
Ingeniería
Bioquímica
mecánica

Ciencia y
tecnología de Genética
alimentos

BIOTECNOLOGIA Biología
Electrónica celular

Informática Química
Ingeniería
bioquímica
CONOCIMIENTOS:

BIOQUÍMICA
FISIOLOGÍA
GENETICA

4
 CULTIVO DE TEJIDOS

Es una herramienta de gran utilidades la

biotecnología.

Esta técnica se basa en la totipotencialidad

celular; obteniendo de esta forma una
propagación rápida y masiva de plantas
idénticas a la original a partir de cualquier
parte aislada de la planta.

5
Consiste en extraer bajo condiciones asépticas, órganos,
tejidos o células de cualquier parte de la planta y colocarlas en
medios nutritivos para luego cultivarlos en condiciones
ambientales controlados.

TRES FENOMENOS BASICOS

1) ORGANOGENESIS: Formación de órganos (diferenciación).

2) CAULOGENESIS: Formación de callo (no diferenciado,

solamente se acumulan no forman órgano ni nada).

3) EMBRIOGENESIS SOMATICA: Formación de embriones a

partir de células no germinadas.

6
 TOTIPOTENCIA

Capacidad de cualquier célula somática para

dividirse y crear un individuo completo y
semejante de aquel que se toma la muestra,
bajo ciertas condiciones químicas y físicas
dados en el cultivo in vitro.

Tipos de cultivos

1. El Desarrollo de estructuras pre-existentes

2. Nueva formación a base de totipotencialidad

7
 Desarrollo de Tuberización
Brote axilar o
yema ovario

Germinación de
semillas
Injerto in vitro

8
Promotor de Embriogenesis Desarrollo de
brotes bulbo

Rhizogenesis 9

Floración in vitro
APLICACIONES

- INDUSTRIA DE FERMENTACIÓN

- INDUSTRIAS AGROALIMENTARIAS

- INDUSTRIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

- PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS CON CONCENTRADOS DE

PROTEÍNA

- TRATAMIENTO Y VALORIZACIÓN DE SUBPRODUCTOS

AGRICOLAS Y SUS DERIVADOS.

- PRODUCCIÓN DE ALCOHOLES Y PRODUCCIÓN DE

BIOGAS

- TRATAMIENTO DE MINERALES
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MECANISMO DE GERMINACIÓN EN SEMILLAS

PROCESO DE GERMINACIÓN: TRES ETAPAS

CONDICIONES: HUMEDAD, LUZ, OXIGENO, TEMPERATURA

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CULTIVO IN VITRO

Es una técnica que usa para propagar plantas a partir de

plantas madres por lo que las plántulas obtenidas son
idénticas entre si a la planta madre.

El cultivo de vegetales superiores se inicio hace mas de

medio siglo y es en esta época que alcanza importancia en la
agricultura, en la obtención de nuevas variedades y por la
multiplicación vegetativa a escalas industriales.

12
Ventajas

1.- Es masiva y más rápida .

2.- Propagar especies difíciles de multiplicar en forma

tradicional; esto es posible al fenómeno de rejuvenecimiento.

3.- El crecimiento de las plantas in vitro es más vigoroso que el

de las clonadas in vivo; esto se debe sobre todo al
rejuvenecimiento y / o al hecho de que las plantas in vitro se
encuentran libres de enfermedades.

4.- Se consigue una multiplicación libre de enfermedades con

selección rigurosa del material inicial, o bien liberando el
material inicial de enfermedades.
13
5.- Homogeneidad del material.

6.- Multiplicación todo el año. Porque se trabaja en

condiciones ambientales controladas.

7.- Ya que se necesita una cantidad de material

relativamente pequeña para iniciar un cultivo in vitro,
se puede realizar una cuidadosa selección del
mismo.

8.- Ahorro de espacio con respecto de los sistemas

tradicionales.

9.- Conservación del material genético.

10.- Fácil transporte e intercambio de material 14

vegetal.
Desventajas

1.- En algunos sistemas de propagación in vitro la

estabilidad genética es débil.
2.- Las plantas producidas in vitro pueden mostrar
características poco convenientes in vivo: Excesiva
producción de ramas laterales y paso total a la fase juvenil.
3.- La aclimatación de las plántulas es un proceso difícil y
puede que muchas veces, los mayores porcentajes de la
pérdida se presenten en esa etapa.
4.- Difícil respuesta inicial de algunas especies y genotipos.
5.- Variación de respuesta entre los genotipos.
6.- Alto costo de establecimiento de un laboratorio, lo que
incide indirectamente en el precio final de la planta
producido de esta manera.
15
7.- Necesidad de una mano de obra especializada.
 ASPECTOS BÁSICOS DEL CULTIVO in vitro

ESQUEMA DE LA REALIZACIÓN DE CULTIVO “IN VITRO”

Material a sembrar

Aislamiento o explante

Esterilización del hipoclorito o Cl2Hg

Preparación del medio nutritivo

Esterilización en autoclave
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 EQUIPO NECESARIO PARA EL CULTIVO IN VITRO
- Autoclave
- Cámara de flujo laminar
- Medio de cultivo
- Planta
- Cámara de cultivo

Presión de 1.5 atm y una temperatura hasta 120º.

- Cámara de flujo laminar

Es una mesa con una campana de extracción, para uno o dos

operarios en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para 17
esterilizar el aire.
TECNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MANIPULACIONES
ASEPTICAS

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO

ESTERILIZACIÓN POR AIRE CALIENTE
ESTERILIZACIÓN POR MEDIOS QUÍMICOS

ESTERILIZACIÓN POR MEDIO NUTRITIVO

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO

ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

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ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

HIPOCLORITO DE CALCIO
TIEMPO DE ESTERILIZACIÓN DE SEMILLAS EN
HIPOCLORITO DE CALCIO 3%

Ejemplos:

Avena sativa - 7 Hrs

Zea mays - 8 Hrs
Triticum aestivum - 15 Hrs
Phaseolus vulgaris - 5 Hrs

 CLORURO DE MERCURIO
 CLORAMINAT Y IODOSUCCIANAMIDA

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-Medio de cultivo

Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de

ensayo, que se tapa con un tapón.
Dependiendo del material que se va a
propagar, el tubo se pone vertical o un poco
inclinado.

-Planta

El material vegetal de partida puede ser del

campo, pero esto conlleva un alto riesgo de
enfermedades y contaminación, aunque se lave
mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes
que crecen en condiciones controlada para que
halla menos infecciones.

-Cámara de cultivo

La cámara de cultivo es una habitación de

dimensiones muy variables, en la que se controlan
las condiciones de luz, temperatura, humedad,
variación día-noche, etc.. 20
 Medio de cultivo

 Es suma importancia
 Estado del cultivo - Sólido o líquido
 Componentes

La diferencia principal entre los medios surge por ser variables los
requerimientos nutritivos de las especies.

Debe ser específicos para la parte de la planta que se esté cultivando

y para la respuesta que se desea obtener.

Una vez preparado el medio de cultivo, se ajusta el pH, ya que su

valor final es importante pues puede afectar, entre otros, a los enzimas y
a algunos componentes del medio de cultivo.

Medio de Iniciación:
Rugini (MIR),
Olive Medium (OM),
Murashige y Skoog (MS),
Lloyd y McCown,
García-Berenguer, 21
Fiorino y Leva
COMPONENTES DEL MEDIO NUTRITIVO

AGUA
SALES MINERALES
MACRONUTRIENTES (N, S, P, Ca, K, Mg)
MICRONUTRIENTES (Fe, Cu, Mn, Al, B)
COMPUESTOS ORGANICOS
CARBOHIDRATOS
SUSTANCIAS HORMONALES
AMINOACIDOS Y AMIDAS
COMPUESTOS ORGANICOS
BASES ORGANICAS
INOSITOL
ACIDO MALICO
COMPUESTOS NATURALES
SUSTANCIAS INERTES
22
Reguladores de crecimiento

Aquellas substancias que son sintetizadas en un

determinado lugar de la planta y se translocan a otro,
donde actúan a muy bajas concentraciones, regulando el
crecimiento, desarrollo ó metabolismo del vegetal.

Pueden ser de origen natural como sintetizadas en

laboratorio que determinan respuestas a nivel de
crecimiento, metabolismo ó desarrollo en la planta.

Las hormonas vegetales se clasifican en cinco grupos:

 Auxinas
 Citocininas o citokininas
 Giberelinas
 Etileno
 Acido abcísico 23
 REGULADORES DE CRECIMIENTO

AUXINAS ACIDO-3- INDOLACETICO (AIA)

ACIDO-3-INDOLBUTIRICO (AIB)
ACIDO NAFTALENACETICO (ANA)
ACIDO-4- CLOROFENOXIACETICO (2, 4-D)
ACIDO -4-AMINO- 3, 5, 6 TRICLOROPICOLINICO
(TORDAN)
CITOCININAS 6-ISOPENTENIL AMINOPURINA (IPA)
ZEATINA
6-FURBURIL ADENINA (KINETINA)
6-BENCIL AMINOPURINA (BA)
GIBERELINAS GA, GA2, GA3.... GA40
GA3 = ACIDO GIBERELICO

24
Las funciones de las auxinas:

1. Dominancia apical
2. Aumentar el crecimiento de los tallos
3. Promover la división celular en el cambio vascular y diferenciación del
xilema secundario
4. Estimular la formación de raíces adventicias
5. Estimular el desarrollo de frutos (partenocárpicos en ocasiones9
6. Fototropismo
7. Promover la división celular
8. Promover la floración en algunas especies
9. Promover la síntesis de etileno (influye en los procesos de maduración
de los frutos)
10. Favorece el cuaje y la maduración de los frutos
11. Inhibe la abscisión ó caída de los frutos

25
Funciones de las citocininas:

1. Estimulan la división celular y el crecimiento

2. Inhiben el desarrollo de raíces laterales
3. Rompen la latencia de las yemas axilares
4. Promueven la organogénesis en los callos celulares
5. Retrasan la senescencia ó envejecimiento de los órganos vegetales
6. Promueven la expansión celular en cotiledones y hojas
7. Promueven el desarrollo de los cloroplastos.

Funciones de la giberelinas:

• Incrementan el crecimiento en los tallos

• Interrumpen el período de latencia de las semillas, haciéndolas
germinar y mobilizan las reservas en azúcares
• Inducen la brotación de yemas
• Promueven el desarrollo de los frutos
• Estimulan la síntessis de mRNA (RNA mensajero)

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Funciones Acido abcísico:

1. Promueve la latencia en yemas y semillas

2. Inhibe la división celular
3. Causa el cierre de los estomas
4. Antagónico de las giberelinas
5. Inhibe el crecimiento

Las funciones etileno:

1. Promueve la maduración de los frutos

2. Promueve la senescencia (envejecimiento)
3. Caída de las hojas
4. Geotropismo en las raíces

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Equipo para un laboratorio de cultivo de tejidos:
Cámara de flujo horizontal
 Autoclave (20 litros)  Destilador (2 litros/hora)
 Termómetro de máx. y min.  Destilador de agua
 Conductimetro de bolsillo  pH-metro
 Equipo de aire acondicionado  Balanza analítica
 Microscopio compuesto  Balanza analítica
 Binocular con sistema de  Des-ionizador
 Estéreo microscopio  Incubadora
 Cámara Digital  Agitador
 Agitador magnético con calefacción.  Pastilla magnética
 Tanque Eternit de 1100 Litros con  Refrigerador
Electro bomba  Cámara de termoterapia
Centrífuga  Cocinilla eléctrica
 Reloj/ alarma
 Estabilizador de Voltaje (1000 Wa)
 Estabilizador de Voltaje (1KVa)
 Autoclave (30 litros)
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 Autoclave (40 Litros)
Material de laboratorio:

 Pipetas Pasteur s
 Pipetas de 1 ml
 Frascos de 15 onzas
 Probetas 50, 500, 1000 ml
 Erlenmeyer de 1000, 500 , 250, 125 ml
 Microtiter plate
 Discos de Aluminio
 Frascos Autoclavables
 Recipientes plásticos para pesado

 Pipetas 10, 5, 1 ml
 Balón de destilación de 1000 y 15000 ml
 Matraz quitazato
 Placa petri chica y grande
 Tubo de ensayo 15 x 150 y 25 x 150 mm
 Tubo de ensayo grande 25 x 150
 Refrigerante (incompleto)
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 Pinzas de Acero inoxidable curva
 Mangos de Bisturí
 Gradillas 25 x 150
 Hojas de Bisturí
 Pabilo
 Papel aluminios 822.8 m x 304 mm)
 Mascarillas 23 unidades
 Tijeras de Acero inoxidable
 Espátula de acero quirúrgico
 Espátula de bronce en curva
 Espátula de bronce recta
 Secador para material de vidrio
 Embudo plástico
 Guantes quirúrgicos
 Cubre bocas
 Baldes de 10 litros
 Pizetas de plástico
 Algodón 06,5 kg.
30
 CONDICIONES DEL CULTIVO IN VITRO

En la cámara de flujo laminar no puede entrar material

contaminado. El problema más importante en todo el proceso
son las contaminaciones.

No se pueden esterilizar en el autoclave determinadas

sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico,
sacarosa, enzimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco
recipientes que no soporten altas temperaturas.

El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no

suministre al medio sustancias contaminantes para la planta.

Los reguladores de crecimiento (hormonas) son

imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio
de cultivo.

Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%. 31

El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Valores bajos,
inferiores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes
añadidos a los medios sólidos.

Si la evolución del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se
puede producir su licuación.

El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos

componentes del medio de cultivo.

El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados

nutrientes por parte del explante (p.e. la absorción de iones NO3-
aumenta con la acidez del medio).

El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y

como consecuencia a la actividad de muchos enzimas

32
El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de
energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.

El medio de cultivo es específico, y se pueden tardar dos años en

prepararlo.

En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20

horas) y temperatura.

- Existen plantas que se desarrollan en la oscuridad.

- Lo normal son 22-26ºC, y en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y
también 28-30ºC para plantas tropicales.

33
 Producen la luz por fenómenos de incandescencia
del filamento calentado por el paso de la corriente
LAMPARAS eléctrica. Buena parte del espectro se halla en la
INCANDESCENTES zona del rojo/rojo lejano. Producen gran cantidad
de calor y mucho consumo de electricidad.

Producen la luz por fenómenos de fluorescencia

del gas sometido a un arco voltáico. El espectro de
LAMPARAS la luz producida es rico en la zona del azul, existen
FLUORESCENTES fluorescentes especiales con un espectro rico en
la zona azul y roja. Consumen menos electricidad.

LAMPARAS DE Producen la luz por efecto del paso de la corriente

VAPOR DE eléctrica a través de gases calientes de mercurio
MERCURIO Y (azul y verde) y sodio (naranja). Son altamente
SODIO eficientes en el consumo de electricidad.
34
Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación
también influyen determinadas características de la
planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de
explante, parte más juvenil o más adulta.

En cuanto a los recipientes, deben permitir el

intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo
que provocaría un aumento de la concentración de sales,
y por tanto la muerte de la planta. Importante el cerrar o
sellar.

35
Inicio del cultivo in vitro

El material vegetal: Célula, tejido u órgano de la planta.

Partiendo de: fragmentos de tejidos somáticos, tallo, raíz,

hoja, meristemos, embriones; o de células o tejidos no
somáticos, anteras, polen, microesporas, óvulos, etc.

Según sea el explante utilizado se hablará de cultivo de

secciones nodales, cultivo de hoja, de meristemo, de polen,
de embriones, etc.

Explante es un fragmento cortado de un tejido o de un

órgano utilizado para iniciar un cultivo. Un explante
puede ser utilizado casi cualquier órgano o tejido, pero
para la micropropagación es conveniente partir de una
yema o ápice meristemático para garantizar la estabilidad
genética de sus células.
36
 Una regeneración de planta completa (morfogénesis o
órganogenesis) puede ser mediante la formación de raíces
(rizogénesis) y/o de tallos.

La morfogénesis parte del explante inicial por la formación de

raíces y/o tallos en posición normal o en posición no normal
(adventicias/os).

Morfogénesis indirecta:
Se produce después de la
formación de un callo.

Morfogénesis directa:
Se produce directamente
del explante sin que este
pase por fase de callo.

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Las condiciones de cultivo pueden dar origen a una
proliferación desorganizada de las células del explante
dando lugar a un callo o incluso a un cultivo de células
cuando se separan éstas del callo.

Se conoce como Caulogenesis a la formación de callo (no

diferenciado, solamente se acumulan no forman órgano ni
nada).

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El explante puede producir unas estructuras bipolares que
presentan las propiedades morfológicas de los embriones
zigóticos.

Estas estructuras se denominan embriones somáticos. Estos

pueden provenir directamente del explante o de un callo y se le
denomina Embriogénesis directa o indirecta.

EMBRIOGENESIS SOMATICA: Formación de embriones a partir de

células no germinadas.

39