AGROBIOTECNOLOGA

Biotecnologa Vegetal
Tomado de: Ma. Mercedes Rivero

Fitomejoramiento. CUNOR

Programa de Biotecnologa
para Amrica Latina y el Caribe
Universidad de las Naciones Unidas
http://www.unesco.org/unuoe/unuesp/centros/biolac.htm

Biotecnologa Vegetal
Cultivo in vitro de clulas, tejidos y rganos
micropropagacin
mejoramiento de plantas
produccin de compuestos de inters comercial
produccin de metabolitos secundarios
produccin de protenas
produccin de polmeros biodegradables
establecimiento de plantas transgnicas
plantas resistentes a virus
plantas con rutas metablicas modificadas
plantas mejoradas en cuanto a composicin de
protenas, aceites, etc.
fitorremediacin
remocin de xenobiticos
remocin de metales pesados

Sumario

Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales

Micropropagacin vegetal
Consideraciones tcnicas de la propagacin
clonal masiva de plantas
Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis

Sistemas de micropropagacin vegetal

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Alcances de la propagacin clonal masiva de plantas

Referencias

Tcnicas del cultivo de clulas

y tejidos vegetales

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Principales
conceptos
fisiolgicos
aplicables a los
cultivos in vitro

Existen tres conceptos bsicos que

fundamentan el cultivo in vitro de clulas y
tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciacin / Rediferenciacin

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- Balance de reguladores del crecimiento

vegetal

Fundamentos
tericos y
prcticos del
cultivo de
tejidos
vegetales

La teora de la totipotencialidad celular, enunciada

por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda
clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta
entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de
diferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones
especficas referidas al medio del cultivo, relaciones
hormonales, temperatura, fotoperodo, etc.
La desdiferenciacin consiste en la transformacin y
prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo
celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. El
siguiente paso involucrado en la regeneracin de una planta
es la rediferenciacin de las clulas previamente
desdiferenciadas.

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance

entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento,
fundamentalmente de auxinas y citocininas.

Tcnicas
del cultivo
de clulas
y tejidos
vegetales

Micropropagacin vegetal

Regeneracin de plantas
(embriognesis y organognesis)
Cultivo de meristemos
Cultivo de suspensiones de clulas vegetales
Cultivo de protoplastos
Cultivo de anteras
Cultivo de vulos y embriones

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Micropropagacin vegetal

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

La
micropropagacin
constituye la
principal aplicacin
comercial del
cultivo de tejidos
vegetales

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

La micropropagacin vegetal, o propagacin clonal

masiva de plantas superiores, posibilita la obtencin
y cultivo de plantas a gran escala.
Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en
un medio sinttico nutritivo y con control de temperatura,
luz y fotoperodo.

Consideraciones tcnicas de la propagacin

clonal masiva de plantas

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

La
micropropagacin
vegetal requiere
disponer de una
infraestructura
mnima
especializada
y de condiciones
controladas
de cultivo

Laboratorio
- Area de preparacin de medios.
- Area de lavado y esterilizacin.
- Cuarto estril.
- Cmara de cultivo.
- Area de rusticacin.

Material vegetal
- Plantas madres seleccionadas
(pre-acondicionamiento).
- Explantes (eleccin, diseccin,
esterilizacin, etc.).

Condiciones de cultivo
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- Asepsia.
- Recipientes.
- Temperatura.
- Luz y fotoperodo.

Medios de cultivo: composicin general

Compuestos inorgnicos
Macronutrientes: NO3- , PO43- , K+, Ca2+,
Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+,
Mo2+, Co2+, ICarbohidratos
Sacarosa, glucosa, mio-inositol

Vitaminas
Tiamina (B1)
Piridoxina
Acido nicotnico (C)
Biotina
Aminocidos
Glicina

Reguladores del crecimiento

Auxinas
Citocininas
Giberelinas
Soporte inerte (medios semislidos)
Agar (0,7 a 1%)
Gelrite

pH
5,6 5,8
Esterilizacin
1 atmsfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Formulacin
bsica
de un medio
de cultivo
para tejidos
vegetales

Soluciones concentradas de macroelementos (100x)

Soluciones concentradas de microelementos (100x)
Vitaminas grupo B (500 1000x)
Mio-inositol (100 mg/L)
Azcares: Generalmente sacarosa o glucosa
en concentraciones de aproximadamente 30 g/L.
Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso
molecular extrado a partir de algas. Se usa entre
5 y 10 g/L

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Propiedades
fsicas
de los medios
de cultivo

Semislido
Consistencia
del medio

Lquido
El metabolismo de los tejidos puede modificarse
dependiendo de las caractersticas del medio de cultivo
(lquido o semi-slido).

En el caso de un medio slido, la concentracin y calidad

del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo
del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.).
El cultivo en medio lquido resulta imprescindible cuando
la propagacin in vitro es desarrollada a travs
de las siguientes vas:
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- Induccin de embriognesis*.
- Cultivo de protoplastos.
- Cultivo de suspensiones celulares.
*tambin en medio semislido

Propiedades
fsicas
de los medios
de cultivo

Intercambio gaseoso:
Los recipientes de cultivo se tapan con una pelcula de
polietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambio
de gases. La organognesis puede verse modificada
si el intercambio de gases se ve dificultado.
- La induccin de yemas a partir de callos
de tabaco se reduce si no hay suficiente oxgeno.
- La acumulacin de etileno puede inhibir
la regeneracin de brotes.

pH:
- Constituye un factor crtico.
- Se ajusta en el rango 5,5 5,8.
- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos.

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Reguladores del crecimiento comnmente usados

en los medios de cultivos vegetales

Reguladores
del crecimiento

Grupos bsicos de reguladores del crecimiento:

- Auxinas
- Citocininas
- Giberelinas
- Acido abscsico
- Etileno
Generalidades:
- Actan a bajas concentraciones
- Interactan unos con otros (los resultados
estn determinados por las concentraciones
relativas entre las diferentes fitohormonas).

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- Los reguladores endgenos del crecimiento

estn presentes en la planta durante todo
su ciclo de vida pero su concentracin flucta.
Su concentracin relativa vara en funcin
del estado fisiolgico de la planta y en cada
uno de los rganos de sta.
- Estn involucrados en numerosos procesos
fisiolgicos.

Auxinas: estos
compuestos se
emplean
bsicamente
como
promotores de
la proliferacin
celular y la
induccin de la
morfognesis

OH

Acido indol actico (AIA)

(auxina endgena)

Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir

de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero
qumico responsable de la elongacin y de la respuesta
fototrpica del coleptilo de gramneas.
- Alargamiento y divisin celular
- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos
- Formacin de races adventicias
- Dominancia apical
- Accin herbicida
- Estimulacin de la produccin de etileno
Se sintetizan en las yemas, las hojas jvenes, los frutos y
en el embrin. La concentracin endgena en la planta vara
entre 0,001 y 0,1 mgKg-1.

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Su transporte es polar
Auxinas sintticas:
- Acido indol butrico (IBA)
- Acido naftalen actico (ANA)
- 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)

Citocininas: en
combinacin
con las auxinas,
determinan
diferentes
respuestas
morfogenticas

Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias

promotoras de la divisin celular in vitro.
Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas:

- Promocin de la divisin celular

- Promocin de la organognesis (relacin
auxinas/citocininas)
- Retardo de la senescencia
- Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos
Citocininas endgenas:
- Zeatina (Zea)
- Isopenteniladenina (2iP)
Citocininas sintticas:
- Cinetina (Kin)
- Benziladenina (BAP)

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentran

en todos los tejidos. La concentracin endgena en
plantas vara entre 0,1 y 500 gKg-1.

Su transporte es no polar.

Estructura qumica de las principales citocininas

Las giberelinas
se utilizan para
favorecer el
crecimiento y el
alargamiento de
los entrenudos
de los brotes
de novo

Acido giberlico (GA3)

Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz

infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos
entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando
extractos solubles del hongo.
El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En
la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.
Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos

o plantas bianuales
- Crecimiento de yemas latentes
- Germinacin de semillas en dormancia
- Floracin
- Movilizacin de reservas en la semilla.

Se sintetizan en hojas jvenes, yemas y en el embrin.

Su transporte no es polar.

Etapas del cultivo in vitro

de plantas superiores

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Etapas de la
micropropagacin
vegetal

Iniciacin
- Eleccin y fitoacondicionamiento de la planta madre
- Eleccin del explante inicial y de la formulacin
del medio de cultivo
- Desinfeccin superficial de los explantes
- Establecimiento del cultivo in vitro

Multiplicacin
- Multiplicacin del material stock

Enraizamiento
- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro

Rusticacin
- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones
de maceta o a campo

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Existen dos
posibles vas
morfogenticas
implicadas en la
diferenciacin
de novo
de brotes y/o
plantas
completas

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Posibles vas morfogenticas:

- Organognesis
- Embriognesis
Diferencias entre las dos posibles vas:
- La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo o
cluster de clulas del explante inicial se desdiferenca
inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un
rgano vegetal. No se obtienen por esta va plantas completas
directamente.
- La embriognesis se presupone de origen unicelular.
Una clula del explante se asla y constituye el punto
de partida para la obtencin de un embrin somtico.
Se diferencian embriones o estructuras bipolares
que completan cada una de las etapas implicadas
en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es
una planta completa.

Etapas implicadas
en el protocolo de
micropropagacin
de una especie
vegetal

Eleccin de una planta

madre selecta
Explantes
ETAPA 1

Desinfeccin superficial
Establecimiento en medio
de cultivo apropiado
Transferencia a un
medio de multiplicacin
ETAPA 2

Formacin de
brotes o embrioides

Agrobiotecnologa

ETAPA 3

Transferencia a un medio
para el enraizamiento de
los brotes

ETAPA 4

Pasaje a maceta en
un invernadero

Cultivo de tejidos
vegetales

Eleccin del explante inicial

Los explantes
deben ser
esterilizados
antes de ser
establecidos
en condiciones
de cultivo

Protocolo tipo de esterilizacin superficial

de material vegetal:
- Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos.
- Solucin de hipoclorito de sodio (NaCIO)
al 5 a 20%, entre 5 y 30 min
Este paso puede ser reemplazado por el uso
de soluciones diludas de bicloruro de mercurio
(HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.
- Enjuagues con abundante agua estril
(4 5 veces).

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- En el caso del HgCl2, el material se debe

enjuagar sucesivas veces pues es difcil
de eliminar.

Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

Vas morfogenticas:
organognesis y embriognesis

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Propagacin vegetativa por embriognesis somtica

Embriognesis: Obtencin de semillas artificiales

Semillas sintticas de
orqudea obtenidas por
encapsulacin en alginato

Sistemas de micropropagacin vegetal

Sistemas de micropropagacin vegetal

Proliferacin de yemas axilares o apicales

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Propagacin
vegetativa a
partir de yemas
preexistentes

Proliferacin de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicacin de plantas a partir
de las yemas axilares preexistentes.
Representa la aceleracin in vitro del crecimiento
natural de dichos meristemos.
- La tasa de multiplicacin (t.m.) se calcula con
base en el nmero de brotes o vstagos obtenidos
a partir de un explante inicial, entre una resiembra
y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y 20
brotes por mes, dependiendo de la especie
en cuestin, entre otras variables.
- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podran
obtenerse 10.000.000 plantas en un solo ao,
a partir de una nica yema inicial.

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- El cultivo de meristemos es un caso especial

del uso de esta tcnica.

Sistemas de micropropagacin vegetal

Proliferacin de tejidos desdiferenciados

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Resulta posible
regenerar brotes
o yemas a partir
de tejidos
vegetales
desdiferenciados
in vitro

Consideraciones generales:
- Callo: masa de clulas desdiferenciadas
obtenidas a partir de un explante cultivado
in vitro (disco de hoja, meristemo,
clulas en suspensin, etc.)
- Es posible regenerar brotes o vstagos a partir
de estos callos.
- Las plantas diferenciadas pueden
no ser uniformes, debido al posible desarrollo
de variantes somaclonales. Esto debe tenerse
en cuenta, especialmente cuando se trabaja en
propagacin clonal a gran escala.

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Sistemas de propagacin vegetativa in vitro

Regeneracin directa e indirecta

Sistemas de
propagacin
vegetativa
in vitro

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Sistemas de micropropagacin vegetal

Cultivo de meristemos

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Los meristemos
son grupos de
clulas
indiferenciadas
que retienen
la capacidad de
dividirse
durante todo el
ciclo de vida de
una planta

Los meristemos determinan el crecimiento de

la planta y dan origen a sus diferentes rganos

Posibilitan la micropropagacin de diferentes especies

vegetales.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Constituyen el explante ideal para liberar de patgenos in

vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias.
Son ampliamente utilizados como explantes para la
criopreservacin y conservacin de germoplasma.

En el cuerpo
de una planta
se reconocen
diferentes tipos
de meristemas

Meristemos apicales
- Estn localizados en la porcin terminal o distal del vstago
y de la raz.
- Sus divisiones dan lugar a las clulas de los tejidos
pimarios del tallo y la raz.
- Son organognicos.
- Determinan el crecimiento en largo de tallos y races.

Meristemos secundarios
- Determinan el crecimiento radial de los rganos vegetales.
- Dan lugar a los tejidos de conduccin.

Meristemos florales
- Derivan de la transformacin de meristemos apicales.
- Se limitan a la produccin de rganos florales.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Meristemos intercalares
- En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos
de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros.
- Determinan el crecimiento en largo de tallos y races

El empleo
de los meristemos
como explantes
del cultivo in vitro
constituye
una posible
herramienta para
el saneamiento de
plantas infectadas

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Cultivo de meristemas

El cultivo de
meristemos
facilita la
eliminacin de
patgenos

- El domo meristemtico no est vascularizado

(muchos patgenos se translocan por los tejidos
de conduccin).

- El nmero de partculas virales es menor

en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de divisin celular a nivel del meristema

es mayor que la velocidad de replicacin de un virus.

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo

de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin
entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y
Dahlia.

Aspectos
Asp
tcnicos
del cultivo
de meristemas

Equipamiento
- Elementos generales para cultivo in vitro.
- Lupa estereoscpica.
- Instrumental de diseccin.

Etapas del cultivo

- Eleccin del explante: escencialmente meristemos apicales
de vstago. Domo meristemtico desnudo o acompaado
por 2 3 pares de primordios foliares.
Tamao aproximado 0,5 mm.

- Esterilizacin de la yema o porcin apical del vstago

conteniendo al meristemo propiamente dicho.
- Diseccin del meristemo bajo lupa. Eliminacin
de las primeras hojas.
- Transferencia del explante al medio de cultivo semi-slido.
Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- Regeneracin de yemas axilares. Subcultivo a medio

sin hormonas para la obtencin de plantas completas.
- Propagacin del material (a partir de estacas uninodales, etc.)
- Rusticacin.

Consideraciones
prcticas sobre
el cultivo de
meristemos

La eficiencia del cultivo de meristemos como

procedimiento para la obtencin de plantas sanas
depender del tamao del explante.
Existe una situacin de compromiso entre el tamao
mnimo posible del meristemo y su capacidad de
desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro.
Ejemplos prcticos:
- Frutilla (Fragaria sp) / patgeno?:
Explantes de 0,22 mm; 100% de plantas sanas.
- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X:
Explantes de 0,1 mm (o menor); 10% de plantas
sanas. Si el explante incluye 2 pares de primordios
el % de plantas sanas es menor.

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V:

Se obtienen altas eficiencias de saneamiento
cultivando explantes de no ms de 2 pares
de primordios foliares.

Alcances de la
micropropagacin
vegetal

Propagacin vegetativa rpida y a gran escala

Uniformidad seleccionada del material clonado
Multiplicacin de plantas recalcitrantes
a las tcnicas convencionales
Reduccin en el tiempo de multiplicacin
y en el espacio requerido para tal fin
Mayor control sobre la sanidad del material
propagado
Introduccin rpida de nuevos cultivares

Agrobiotecnologa
Cultivo de tejidos
vegetales

Conservacin de germoplasma
Facilidades para el intercambio internacional
de material vegetal