Secuenciación de ADN

Cómo se determina la secuencia de las bases de nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) en un

fragmento de ADN.
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Puntos más importantes:

 La secuenciación de ADN es el proceso de determinar la secuencia de
nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de ADN.

 En la secuenciación de Sanger, el ADN blanco es copiado muchas

veces y se hacen fragmentos de diferentes longitudes. Nucleótidos
fluorescentes que actúan como "terminadores de cadena" marcan los
extremos de los fragmentos y permiten la determinación de la secuencia.

 Las técnicas de secuenciación de nueva generación son estrategias

nuevas a gran escala que aumentan la velocidad y reducen el costo de la
secuenciación del ADN.

¿Qué es la secuenciación?
Tal vez hayas oído que se están secuenciando genomas. Por ejemplo, el
genoma humano se finalizó en 2003 después de un esfuerzo internacional
de muchos años. Pero, ¿qué significa secuenciar un genoma o incluso un
pequeño fragmento de ADN?

La secuenciación de ADN es el proceso que determina la secuencia de

bases de los nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de ADN.
Hoy en día, con el equipo y los materiales adecuados, secuenciar un
fragmento pequeño de ADN es relativamente sencillo.
Secuenciar un genoma completo (todo el ADN de un organismo) sigue
siendo una tarea compleja. El proceso requiere romper el ADN del
genoma en muchos pedazos más pequeños, secuenciar dichos pedazos y
ensamblar las secuencias en una única y larga "secuencia consenso". Sin
embargo, gracias a nuevos métodos que se han desarrollado en las
últimas dos décadas, ahora secuenciar un genoma es mucho más rápido y
menos costoso de lo que resultó en el Proyecto Genoma Humano^11start
superscript, 1, end superscript.

En este artículo, revisaremos los métodos que se usan para secuenciar el

ADN. Analizaremos principalmente un método bien establecido, la
secuenciación de Sanger, pero también analizaremos nuevos métodos
("de nueva generación") que han reducido el costo y aumentado la
velocidad de la secuenciación a gran escala.

Secuenciación de Sanger: el método por

terminación de cadena
Rutinariamente se secuencian regiones de ADN de
hasta 900900900 pares de bases con un método llamado secuenciación
de Sanger o método por terminación de cadena. Este método de
secuenciación fue desarrollado por el bioquímico británico Fred Sanger y
sus colegas en 1977.

En el Proyecto Genoma Humano, se utilizó la secuenciación de Sanger

para determinar las secuencias de muchos fragmentos relativamente
pequeños de ADN humano. (Estos fragmentos no necesariamente eran
de 900900900 pb o menos, pero los investigadores pudieron "recorrer" la
longitud de cada fragmento con múltiples rondas de secuenciación de
 Sanger). Los fragmentos se alinearon con base en porciones que se
traslapaban para ensamblar la secuencia de regiones más grandes de
ADN y, al final, cromosomas completos.

Aunque actualmente los genomas se secuencian con otros métodos que

son más rápidos y menos costosos, la secuenciación de Sanger todavía se
usa ampliamente para secuenciar piezas individuales de ADN, como los
fragmentos utilizados en la clonación de ADN o los generados a través
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Ingredientes para la secuenciación de Sanger

La secuenciación de Sanger consiste en hacer muchas copias de una
región blanco de ADN. Sus ingredientes son similares a los necesarios
para la replicación del ADN en un organismo o para la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), que copia el ADN in vitro. Los
ingredientes son:

 Una enzima ADN polimerasa

 Un cebador, que es un fragmento pequeño de ADN monocatenario que

se une al molde de ADN y actúa como un "iniciador" de la polimerasa.

 Los cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).

 El molde de ADN que será secuenciado.

Sin embargo, una reacción de secuenciación de Sanger también contiene

un ingrediente único:

 Versiones didesoxi, o terminadores de la cadena, de los cuatro

nucleótidos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uno marcado con
pigmentos de color diferente.
_Crédito de la imagen: "Secuenciación de genoma completo: Figura 1", de OpenStax College, Biología
(CC BY 4.0)_

Los nucleótidos didesoxi son similares a los nucleótidos normales, o

desoxi, pero con una diferencia clave: no tienen grupo hidroxilo en el
carbono 3' del anillo de azúcar. En un nucleótido normal, el grupo
hidroxilo 3' actúa como un "gancho" que permite que un nuevo
nucleótido se añada a una cadena existente.

Una vez que se añade a la cadena un nucleótido didesoxi, ya no hay un

hidroxilo sobre el que se puedan agregar más nucleótidos. La cadena
termina con el nucleótido didesoxi, que está marcado con pigmento de un
color particular dependiendo de la base (A, T, C o G) que lleve.
[¿Dónde se coloca el pigmento?]
Método de secuenciación de Sanger
La muestra de ADN que se secuenciará se combina en un tubo con el
cebador, la ADN polimerasa y los nucleótidos del ADN (dATP, dTTP,
dGTP y dCTP). También se añaden los cuatro nucleótidos didesoxi
terminadores de la cadena, marcados con su pigmento, pero en
cantidades mucho más pequeñas que los nucleótidos normales.

Primero se calienta la mezcla para desnaturalizar el molde de ADN

(separar las cadenas) y luego se enfría para que el cebador pueda unirse
al molde de cadena sencilla. Una vez que se ha unido el cebador, se eleva
la temperatura para que la ADN polimerasa pueda sintetizar ADN nuevo
a partir del cebador. La ADN polimerasa añadirá nucleótidos a la cadena
hasta que aleatoriamente agregue un nucleótido didesoxi en lugar de uno
normal. A partir de ese momento, no es posible agregar más nucleótidos
y la cadena termina con el nucleótido didesoxi.

Este proceso se repite cierto número de ciclos. Cuando los ciclos

terminan, está prácticamente garantizado que se ha incorporado un
nucleótido didesoxi en cada una de las posiciones del ADN blanco en al
menos una reacción. Es decir, el tubo contendrá fragmentos de diferentes
longitudes que terminan respectivamente en cada una de las posiciones
de los nucleótidos del ADN original (observa la siguiente figura). Los
extremos de los fragmentos tendrán el pigmento que indica su nucleótido
final.
[¿Se marcarán todos los fragmentos?]
Imagen modificada de "Secuenciación de Sanger", de Estevezj (CC BY-SA 3.0). La imagen modificada
se encuentra bajo una licencia (CC BY-SA 3.0)

Cuando la reacción termina, los fragmentos se hacen pasar a través de un

tubo largo y delgado que contiene una matriz de gel en un proceso
llamado electroforesis capilar en gel. Los fragmentos cortos se mueven
rápidamente a través de los poros del gel, mientras que los fragmentos
largos se mueven más lentamente. Cuando cada fragmento cruza la
"línea de meta" al final del tubo, un láser lo ilumina y permite la
detección del pigmento asociado.

El fragmento más pequeño (que termina justo un nucleótido después del

cebador) es el primero que cruza la línea de meta, seguido por el próximo
fragmento más pequeño (que termina justo dos nucleótidos después del
cebador) y así sucesivamente. De esta manera, se puede reconstruir
nucleótido por nucleótido la secuencia del fragmento de ADN original a
partir de los colores de los pigmentos registrados uno tras otro por el
detector. Los datos registrados por el detector consisten en una serie de
picos en la intensidad de la fluorescencia, como se muestra en
el cromatograma anterior. La secuencia del ADN se lee a partir de los
picos en el cromatograma.

Usos y limitaciones
La secuenciación de Sanger arroja secuencias de alta calidad para
segmentos relativamente largos de ADN (de hasta
aproximadamente 900900900 pares de bases). La técnica suele utilizarse
para secuenciar fragmentos individuales de ADN, como plásmidos
bacterianos o ADN copiado en la PCR.
 Sin embargo, la secuenciación de Sanger es costosa e ineficiente para
proyectos a gran escala, como la secuenciación de un genoma completo o
un metagenoma (el "genoma colectivo" de una comunidad microbiana).
Para tareas como estas, las nuevas técnicas de secuenciación a gran
escala son más rápidas y menos costosas.

Secuenciación de nueva generación

El nombre puede sonar como de Star Trek, ¡pero de verdad así se llama!
El conjunto más reciente de tecnologías de secuenciación de ADN se
denominan secuenciación de nueva generación.

Hay una variedad de técnicas de secuenciación de nueva generación que

utilizan diferentes tecnologías. Sin embargo, la mayoría comparte un
conjunto común de características que las distinguen de la secuenciación
de Sanger:

 Altamente paralelas: ocurren muchas reacciones de secuenciación al

mismo tiempo.

 Microescala: las reacciones son diminutas y se pueden hacer muchas a

la vez en un chip.

 Rápidas: puesto que las reacciones se realizan en paralelo, los resultados

están listos mucho más rápido.

 Bajo costo: secuenciar un genoma es más barato que con la

secuenciación de Sanger.

 Longitudes más cortas: típicamente, las lecturas se obtienen con

fragmentos de entre 505050 -700700700 nucleótidos de longitud.
Conceptualmente, la secuenciación de nueva generación es como hacer
un número muy grande de pequeñas reacciones de secuenciación de
Sanger en paralelo. Gracias a esta paralelización y a la pequeña escala,
los métodos de última generación permiten secuenciar grandes
cantidades de ADN de forma mucho más rápida y barata con que con la
secuenciación de Sanger. Por ejemplo, en 2001, el costo de secuenciar un
genoma humano fue de casi \$100$100dollar sign,
100\text{millones}millonesm, i, l, l, o, n, e, s. En el año 2015, ¡fue de
solo \$1245$1245dollar sign, 1245^22start superscript, 2, end
superscript!

¿Por qué es importante que la secuenciación sea rápida y barata? La

capacidad de secuenciar genomas de forma rutinaria abre nuevas
posibilidades en la investigación biológica y en aplicaciones biomédicas.
Por ejemplo, la secuenciación de bajo costo es un paso hacia la medicina
personalizada: un tratamiento médico a la medida de las necesidades de
un individuo con base en las variantes génicas de su genoma.