Está en la página 1de 15

EL MARCAJE DE SONDAS

El marcaje de las sondas se puede dar de 2 formas:

• Marcaje radiactivo: La sonda se marca radiactivamente


utilizando nucleótidos que tengan átomos con un isótopo
radiactivo, pero también es frecuente el uso de tritio
• Este tipo de marcaje es apreciable mediante autorradiografía.
El uso de este marcaje va a asociado con los peligros por el uso
de elementos radiactivos, así como también por ser un agente
mutagénico.
EL MARCAJE DE SONDAS
• Marcaje Inmunológico: Las sondas se marcan utilizando
nucleótidos que llevan unida una molécula (digoxigenina), a
la solución se le añaden anticuerpos específicos que se
unen a esa molécula, estos anticuerpos llevan asociado un
compuesto luminiscente o fluorescente (como fluoróforos o
fluorocromos: fluoresceína, rodamina) que deja impronta
fotográfica.
HIBRIDACIÓN IN SITU POR
FLUORESCENCIA (FISH)
• Es una técnica que permite detectar secuencias de ADN en
cromosomas metafásicos o núcleos interfásicos en muestras
citogenéticas cultivadas o no cultivadas y fijadas. En la técnica
se utiliza una sonda de ADN que hibridiza los cromosomas
completos o las secuencias únicas simples y es un complemento
útil para la citogenética clásica.

• Esta técnica se fundamenta en que la sonda (segmento de ADN


monocatenario marcado con fluorocromo) tiene la capacidad de
hibridizarse con otra secuencia de ADN diana monocatenario,
que es complementario a las bases nitrogenadas de la sonda.
LAS SONDAS GÉNICAS

• Sondas de ADN complementario (ADNc): se obtienen a partir


de la copia de un ARNm y, por tanto, corresponden a
secuencias codificantes de un gen.
• Sondas de ARN: son copias del ARN y se obtienen in vitro,
mediante la síntesis de una cadena complementaria
utilizando una ARN-polimerasa.
• El uso de PCR y de sondas moleculares que reconozcan
secuencias de ADN asociadas a enfermedades genéticas,
permite detectar al gen involucrado, en cantidades ínfimas
material genético obtenido de tejido de adultos o de
embriones de humanos y animales.
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES
Tenemos las siguientes:
• Sondas Centroméricas:
Se obtienen y basan su elaboración a partir de la gran cantidad de
secuencias de ADN repetitivo (intergénico: disperso o yuxtapuesto
“en tándem”) encontradas en y alrededor del centrómero de
cromosomas específicos. En la actualidad son usadas para el
diagnóstico rápido.

Podemos utilizar sondas de ADN de distintos tipos:


• Centroméricas: (marcan únicamente las zonas centroméricas).
• Painting: pintado cromosómico (marcan todo un cromosoma).
• LSI (secuencias específicas de locus): (marcan regiones
cromosómicas de secuencia única).
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES
• Sondas BCR/ABL:
Especificaciones de la sonda:
BCR (22q11.23) verde
ABL (9q34) rojo.
La presencia del cromosoma Filadelfia (Ph') tiene una importante
repercusión en una serie de enfermedades hematológicas. Esta
anomalía es característica de la leucemia mieloide crónica (LMC),
esta anormalidad afecta a los cromosomas 9 y 22.
El resultado es que parte del gen de región de fractura (BCR,
Breakpoint Cluster Region, en inglés) del cromosoma 22 (región
q11) se fusiona con parte del gen ABL del cromosoma 9 (región
q34). El gen ABL toma su nombre de «Abelson», el nombre de un
virus causante de leucemias precursor de una proteína similar a la
que produce este gen.
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES

Actualmente se realiza esta técnica en el Laboratorio de


Genética del instituto de Enfermedades Neoplásicas para 2 tipos
de leucemias:
• Leucemia Mieloide Crónica para la detección de la fusión
génica BCR-ABL
• Leucemia Mieloide Aguda tipo M2 para la detección de la
fusión génica AML-ETO y para el cáncer de mama para la
detección de la amplificación del gen Her-2 neu ETO AML /
ETO AML AML / ETO Sonda AML / ETO ETO ML Citogenética
Molecular
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES

• Sondas Unilocus:
Son específicas para un locus particular. Se utilizan con éxito en
la identificación de minúsculas deleciones y duplicaciones
submicroscópicas.

• Pintar cromosomas:
Consiste en la mezcla de sondas de diferentes partes de un
cromosoma en particular. Cuando esta mezcla de sondas se usa
en una hibridación, el cromosoma entero fluorece, por lo que
decimos que está “pintado”. Pintar cromosomas es muy útil para
caracterizar reoirdenamientos complejos, tales como
translocaciones sutiles, y para identificar el origen de material
adicional de un cromosoma, como pequeños marcadores de
supernumerarios o anillos.
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES
• Pintar a la inversa:
En este procedimiento una porción de material cromosómico no
identificado, pequeños marcadores supernumerarios o anillos, se
usa para pintar por hibridación una metafase normal.
• El cromosoma no identificado se obtiene por separación de
células activadas por fluorescencia, el cual es amplificado
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
preparar dicha pintura. El origen del segmento no
identificado se obtiene mediante la identificación del
cromosoma sobre el cual se hibrida.
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES

• Cariotipo de espectro multicolor:

• El último logro de la tecnología FISH es utilizar todas las sondas


cromosómicas para obtener un cariotipo humano multicolor, en
el cual cada par de homólogos cromosómicos puede ser
identificado en base a su color.
• Para un cromosoma completo cada sonda se prepara de tal forma
que, cuando se une a un marcador fluorescente, da una señal
espectral diferente, que se analiza con un programa de
ordenador. Este abordaje es extremadamente útil para detectar
sutiles reordenamientos cromosómicos o constitucionales en
pacientes con anomalías adquiridas, como el cáncer, o del
desarrollo.
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES
• Sondas PML/RARA
Las sondas satélites consisten en secuencias específicas
generadas de satélites DNA altamente repetitivo, localizados en
regiones centroméricas, pericentroméricas o heterocromáticas
de cada cromosoma.
Estas sondas permiten una rápida identificación y enumeración
de cada uno de los cromosomas, tanto en interfase como en
metafase.
También se ofrecen sondas satélite doblemente marcadas para X
e Y, cada una de ellas marcada con rojo o verde
respectivamente.
AQUARIUS PAINTING PROBES

* Marcaje mediante sondas coloreadas de colores verde y rojo

* Hibridación completa del cromosoma

* Detección de translocaciones
Aquarius subtelomerics probes

* Región cercana a los telómeros es sumamente rica en genes

* Relacionada a la detección de alteraciones tales como:


retrasos mentales y anomalías congénitas
AQUARIUS MICRODELECTION PROBES

* Método de elección para el diagnóstico: Técnica de La


Fluorescencia in situ (FISH)

* Utiliza sondas como :


* • DiGeorge/VCFSTUPLE1
* • DiGeorge/VCFSN25
* • Prader-Willi/Angelman
* • Angelman(UBE3A/D15S10)
Ventajas de las sondas génicas

* Permiten investigar microorganismos no cultivables, de


lento crecimiento o difícil y de identificación compleja.

*
* Permite la identificación de genes no expresados
fenotípicamente.

* Adaptación a cualquier laboratorio.