Actividades Extras Tema 5

1. En qué tipos de medios puede llevarse a cabo la hibridación. Cita 2

ejemplos de cada uno.
En medio sólido: dot blot, southern blot

En medio líquido: Técnica de captura de híbrido y tecnología ADN

ramificado

In situ: FISH Y CISH

2. Responda a la imagen:
a) ¿Qué técnica da estos resultados? Explícala
brevemente.
Dot blot. Es una técnica de hibridación simple que
utiliza membranas de nailon como soporte sólido
y permite detectar secuencias de ácidos
nucleicos, ADN o ARN, en una mezcla compleja.

b) ¿Cómo se lleva a cabo el revelado si el

resultado final es el de la imagen?
Al revelar la placa, aparecerán puntos negros en las posiciones correspondientes
a las muestras positivas, es decir, aque llas que contenían la secuencia diana.

Si la sonda empleada está marcada con haptenos, a continuación de los

lavados se revela con un método de detección cromogénico, siendo el resultado
final una mancha coloreada en las posiciones correspondientes a las muestras
positivas.

c) ¿Qué marcador usa?

Se puede realizar con sondas radiactivas o con sondas marcadas con hapteno

d) Explica brevemente dos aplicaciones concretas de esta técnica.

ASO dot blot (ASO allele specific oligonucleotides): es útil para detectar
mutaciones asociadas con enfermedades, siempre y cuando el número de posibles
variantes alélicas sea reducido.

Dot blot inverso: tiene el mismo fundamento que el ASO dot blot, pero
aplica una estrategia inversa. En esta técnica lo que se inmoviliza en la memb rana
son los distintos oligonucleótidos específicos de alelo (normales y mutados) sin
marcar, lo que permite estudiar genes con un gran número de variantes alélicas
que afectan a distintas zonas del gen. Lo que se marca es el gen de interés
procedente de la muestra, bien utilizando nucleótidos o cebadores marcados, en
la PCR para su amplificación. Se emplea bastante para el diagnóstico de las
talasemias (otras hemoglobinopatías) y permite también distinguir entre
individuos homocigóticos y heterocigóticos.

3. Resultado de un ASO dot blot para dos variantes alélicas de un gen.

Explica qué le ocurre al individuo: 1,2,3 y 4.

Individuo 1: Homocigoto normal

(sano)

Individuo 2: Homocigótico para la

variante mutada

Individuo 3: Tiene otra mutación

diferente a la buscada.

Individuo 4: Heterocigotos

4. Responda con relación a la imagen:

a) ¿Qué técnica es?

Hibridación de las colonias bacterias, se
trata de un dot blot especial

b) Explícala brevemente.
Utilizado para detectar bacterias que
portan una secuencia génica concreta
que puede ser un gen de interés, un
plásmido natural o un plásmido
recombinante

c) ¿Qué marcador usa?

Isótopos radiactivos.
5. Responda con relación a la imagen:

a) ¿Qué técnica es?

Southern blot.

b) Explícala brevemente.
Es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN
purificado separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de
nitrocelulosa o nailon. A diferencia del dot blot, permite la detección simultánea
de varias secuencias diana de distintos tamaños con una única hibridación. Se
utilizan más las sondas radiactivas, aunque pueden emplearse otros marcajes.

c) ¿Qué marcador usa?

Isótopos radiactivos, aunque se pueden utilizar otros marcadores

d) ¿Qué otra técnica es significativamente similar? ¿Qué las diferencia?

El Northerm blot, se diferencia en que este no necesita ser desnaturalizado y se
trata de ARN

6. Relaciona:
Dot blot Sondas para pintdo
Southern Blot específicas BSP
Microarrays Capilaridad
M-FISH Biochips
Bomba de vacío
7. Explica el protocolo general de las técnicas con Microarrays. ¿Qué
tiene de especial el marcaje? Comenta dos aplicaciones.
1º. Marcaje de la muestra: se marca empleando fluorocromos

2º. Hibridación y lavados de poshibridación: se realiza siguiendo las indicaciones

de cada fabricante.

3º. Lectura del microarray: mediante un escáner láser que excita cada punto de la
matriz con la longitud de onda adecuada al fluorocromo utilizado y de un detector
que mide la intensidad.

4º. Interpretación de los resultados: lo realiza un software específico

Lo importante del marcaje es que su lectura del resultado obtenido tras la

hibridación requiere un escáner de lectura basado en tecnología láser y un potente
software de análisis.

Aplicaciones:

- Estudios de expresión génica: Permite análisis detallados de perfiles de

expresión génica de poblaciones celulares, al estudiar simultáneamente la
expresión de miles de genes.

- Hibridación genómica comparada en arrays (aCGH): Es muy útil par a realizar

estudios genómicos de células tumorales, en el diagnóstico de enfermedades
genéticas y en diagnóstico prenatal ya que permite detectar e identificar
alteraciones genéticas consistentes en pérdida (deleciones y microdeleciones) o
ganancia (duplicaciones y microduplicaciones) de material genético, mediante la
comparación del ADN de una muestra con un ADN de referencia.

8. Responde:

a) ¿Qué técnica es?

Técnica de captura de híbrido mediante anticuerpos específicos

b) Explícala brevemente
Se basa en la formación de híbridos ARN/ADN que serán reconocidos o capturados
por anticuerpos específicos que reconocen estos heterodúplex y que se hallan
fijados en las paredes de pocillos de una placa microtiter.
 c) ¿Qué caracteriza el marcador?
En este caso se trata de una enzima que catalice el paso de un sustrato, que habrá
que añadir, a cierto producto coloreado o luminiscente.

9. Marca si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones y

arregla las falsas:
Los microarrays de ADN son conjuntos de sondas marcadas constituidas por
fragmentos de ADN distintos monocatenarios fijados a una superficie sólida, que
puede ser vidrio, plástico, silicona o silicio.

FALSO. Son conjuntos de sondas no marcadas.

En las técnicas de hibridación en medio líquido, el híbrido sonda/secuencia

diana se forma en solución, normalmente en tubos de ensayo, y posteriormente se
fija a la pared del pocillo para proceder a su detección por métodos indirectos.

FALSO. Normalmente en pocillo de una placa microtiter .

La técnica de ADN ramificado consiste en un sistema de amplificación de

señal empleando dos tipos de sondas, basado en la unión de la secuencia diana a
un macrocomplejo de ADN, mediante sucesivas hibridaciones. Se ha ideado para
aumentar la especificidad de la técnica.

FALSO. Se ha ideado para aumentar la sensibilidad de la técnica.

Las técnicas de hibridación in situ permiten detectar y localizar secuencias

de ácidos nucleicos, ADN y ARN, directamente sobre preparaciones citogenéticas
de metafases o núcleos interfásicos desnudos, extensiones citológicas o secciones
de tejido y el resultado obtenido se analiza microscópicamente, lo que permite
además la observación de detalles morfológicos.

VERDADERA.

La ISH no requiere extracción y purificación previa de los ácidos nucleicos.

Se emplean sondas de ADN, ARN o LNA. Se puede realizar sobre material fresco,
congelado e incluso fijado en formal e incluido en parafina.

FALSO. Se emplean sondas de ADN, ARN o PNA.

Se han desarrollado varias técnicas de FISH metafásica que utilizan cócteles

complejos de sondas que cubren cromosomas enteros o el genoma completo.

VERDADERA.

La hibridación in situ cromogénica (ClSH) es una técnica en la que el híbrido

se detecta mediante una reacción inmunohistoquímica que produce un producto
coloreado visible con un microscopio óptico convencional. Es una técnica muy
utilizada en los laboratorios de análisis clínico.

FALSO. Es una técnica muy utilizada en los laboratorios de anatomía patológica .

10. ¿Qué diferencia principal hay entre las dos técnicas que dan estos
resultados? Explica el revelada en ambos casos.

FISH: las sondas se marcan con

fluorocromos. Se requiere un
microscopio de fluorescencia
para visualizar los resultados.

CISH: Las sondas se marcan con

haptenos. Se visualiza en un
microscopio óptico convencional

11. Rodea la correcta con respecto a la imagen: ISH

a) Tiipo: Interfásica / Metafásica
b) Marcador: Hapteno / Fluorocromo
c) Sonda: CEP / LSI

12. Responda con relación a la imagen:

a) ¿Qué técnica da estos resultados?
Técnica CISH

b) Explícala brevemente.
Es una técnica en la que el híbrido se detecta
mediante una reacción inmunohistoquímica
que produce un producto coloreado visible
con un microscopio óptico convencional. Es
una técnica muy utilizada en los laboratorios
de anatomía patológica.

c) ¿Cómo se lleva a cabo el revelado si el resultado final es el de la imagen?

Se detectan por métodos inmunohistoquímicos indirectos empleando un
anticuerpo primario al que se une otro anticuerpo secundario conjugado con una
reacción enzimática, que al añadir un sustrato cromogénico será transformado al
final en un producto coloreado, que se deposita en el tejido alrededor del
híbrido.

d) ¿Qué marcador usa?

Haptenos.