PCR

• La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase

Chain Reaction) es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y revolucionaria
en biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias
de un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir de una sola
molécula. La PCR se basa en la replicación celular en la que actúan varias
proteínas para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona
como molde
Miller 2018
Electroforesis
• La electroforesis es una técnica que emplean los científicos en el
laboratorio utilizada para separar el ADN, el ARN, o moléculas o
proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica. Se utiliza una
corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través
de un gel. Los poros del gel actúan como un colador, permitiendo que
las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las grandes.
Las condiciones utilizadas durante la electroforesis se pueden ajustar
para separar moléculas en el rango de tamaño que se desee.
MARCADORES MOLECULARES
MARCADORES MOLECULARES
• Los marcadores moleculares son una herramienta necesaria en muchos campos
de la biología como evolución, ecología, bio-medicina, ciencias forenses y
estudios de diversidad. Además se utilizan para localizar y aislar genes de interés.
En la actualidad existen varias técnicas moleculares que nos permiten conocer
cómo se encuentran las proporciones de genes en las poblaciones naturales de
manera indirecta, como con los análisis de proteínas, o de manera directa con
estudios de ADN
MARCADORES MOLECULARES
Los marcadores moleculares son secuencias de ADN, que se han
constituido en herramientas valiosas para la detección y el uso
de la diversidad genética, con su consecuente aplicación en
programas de selección genética de plantas, animales y
microorganismos. Los polimorfismos (o variantes) a nivel de
ADN pueden ser detectados mediante técnicas moleculares
ADN nuclear
• En eucariontes, la mayor parte
de la información genética se
encuentra contenida en el
núcleo de la célula. El nADN se
encuentra empaquetado y
asociado a proteínas histonas,
conformando los cromosomas.
• El nADN contiene regiones
únicas −de una sola copia− y no
únicas−duplicadas o regiones
repetitivas (Stansfield, 1992)
ADN mitocondrial (mtADN)
• El genoma mitocondrial (mtADN)
tiene un tamaño de 15 a 17 kb (Brown
et al. 1979) y su longitud varía
considerablemente entre especies: 20
micrómetros en Neurospora; 25
micrómetros en levaduras; 30
micrómetros en plantas superiores
• Se considera que la mayoría del
mtADN de hongos y plantas no
codifica, ya que el mtARN contiene
intrones
Homocigoto y Heterocigoto
• Homocigoto se refiere a la composición genética de una característica
específica en un organismo diploide. Cada alelo de un gen en
particular se hereda de cada progenitor. Si ambos alelos para ese gen
en particular son iguales, entonces el organismo es homocigoto.
• Heterocigoto se refiere a haber heredado dos formas diferentes de un
gen en particular, una de cada progenitor. Lo contrario es un genotipo
homocigoto, donde un individuo hereda formas idénticas de un gen
en concreto del padre y de la madre.
Homocigoto y Heterocigoto
• Marcadores có-dominates: diferencia um indivíduo heterozigotico de um homozigotico.

• Marcadores dominantes: não se identificam heterozigóticos

RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
• Esta técnica produce fragmentos de ADN mediante el uso de enzimas
de restricción que detectan polimorfismos en los sitios de corte, lo
cual se ve reflejado como variación en la longitud de los fragmentos
generados.
• Las diferencias en longitud de los fragmentos obtenidos
(polimorfismo) ocurren como resultado de inserciones, deleciones o
mutaciones en una base de la secuencia del ADN
• Los RFLP son marcadores moleculares codominantes, es decir, pueden
detectar tanto individuos homocigotos como heterocigotos, y pueden ser
usados en todos los miembros de una especie o especies relacionadas.
Es posible obtener entre uno y cinco puntos (bandas) de información por cada
muestra. analizada
RAPDs
• Los RAPDs (polimorfismos de ADN amplificados al azar) son marcadores que
amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de especies.
• Los RAPDs se basan en la probabilidad estadística de que se presenten sitios
complementarios al oligonucleótido de 10 pares de bases (pb) a lo largo del
genoma
• El polimorfismo de las bandas entre los individuos se debe a cambios en la
secuencia de los nucleótidos en los sitios de acoplamiento del oligonucleótido y
por inserción o deleción de los fragmentos en estos sitios
• Los RAPDs son útiles en la elaboración de mapas genéticos, en el estudio de
parentesco y en el análisis de la estructura poblacional, ya que ayudan a estimar
tamaño efectivo, aislamiento reproductivo y niveles de fecundación cruzada
RAPDs
• Entre las principales ventajas de los RAPDs esta que amplifican regiones tanto
codificantes del ADN como las no codificantes y revelan niveles de variación más
altos que los RFLPs e isoenzimas
• Es una técnica relativamente fácil que no necesita conocimiento previo de la
secuencia de ADN, no requiere la construcción o el mantenimiento de una librería
genómica, el número de loci que puede ser examinado es ilimitado y no requiere
pruebas radiactivas
RAPDs
• Sin embargo los problemas prácticos detectados con los RAPDs son la
presencia de bandas “erróneas”, la reproducibilidad de los resultados y
la comigración de bandas. Asimismo, muchos de los alelos raros
presentes en las poblaciones estudiadas con RAPDs no son detectados
o pueden ser mal interpretados (Zhivotovsky, 1999). Por otro lado,
como los loci son dominantes, los RAPDs dan menos información
genética por locus que los marcadores codominantes.
Microsatélites
• Los microsatélites o secuencias simples repetidas (SSRs; Litt y Luty,
1989) son secuencias de ADN formadas de 1 a 4 pares de bases, por
ejemplo mononucleótidos TT)n, dinucleótidos (AT)n, o
tetranucleótidos (AAGG)n.
• Estos loci se encuentran en regiones codificantes y no codificantes
del ADN y es probable que se formen por eventos de rompimiento
que generan polimorfismos con valores superiores al 90%
Microsatélites
• Los microsatélites de ADN nuclear han sido detectados en múltiples
grupos de plantas y animales, y han sido utilizados
fundamentalmente para estudios de variación genética intra e
interespecífica
Microsatélites
• Los microsatélites han tomado ventaja sobre otros marcadores
genéticos como los AFLPs, RAPDs, RFLPs, debido a que: i) tienen el
más alto grado de polimorfismo; ii) segregan de manera mendeliana y
son codominantes; iii) la presencia de un solo locus genético por
microsatélite hace que la lectura de las bandas sea clara y fácil de
interpretar y iv) son selectivamente neutros
• Para trabajar con SRR es necesario conocer la secuencia de la región a
analizar para contar con primers específicos que amplifiquen la región
repetitiva (el microsatélite) responsable de la variación observada,
que además es homóloga para diferentes especies o incluso géneros