UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA

MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Y

PREPARACIÓN DEL INÓCULO

Curso:

Microbiología Industrial

Docente:

Ing. Manuel Omar Diaz Rodríguez

Integrantes:

Cárdenas Malca, Axel Gabriel

Chávez Reyes, Erinson Luisin

Domínguez Paz, Maria Ibelda

Flores Bazan, Lizbeth Sarays Flor

Rojas Llamoga, Wendy Roxana

Villacorta Abanto, Julio Israel

Trujillo – Perú

2023
 ÍNDICE

I. OBJETIVOS ........................................................................................... 3

II. FUNDAMENTO TEÓRICO .................................................................. 3

2. 1. MÉTODOS ........................................................................................ 3

2. 2. PRINCIPIOS .................................................................................. 10

2. 3. CARACTERÍSTICAS ..................................................................... 12

2. 4. APLICACIONES ............................................................................. 16

III. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO................................................ 17

MATERIALES ................................................................................................... 17

PROCEDIMIENTO ........................................................................................... 20

IV. DISCUSIÓN ......................................................................................... 24

V. CONCLUSIONES ................................................................................ 25

VI. RECOMENDACIONES:...................................................................... 26

VII. REFERENCIAS ................................................................................ 26

P á g i n a 2 | 27
 MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Y

PREPARACIÓN DEL INÓCULO

I. OBJETIVOS

• Analizar como preservar la viabilidad y diversidad genética de las cepas a

largo plazo.

• Identificar cuales son las condiciones óptimas de crecimiento de los

microorganismos.

• Estudiar la obtención de un inoculo homogéneo y reproducible en

términos de composición y concentración.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

2. 1. MÉTODOS

Métodos generales de conservación de microorganismos

En los últimos tiempos, se ha visto un incremento en la apreciación del valor de

las colecciones de cultivos de microorganismos, tanto para la conservación de recursos

genéticos y la biodiversidad, como para proveer la fuente esencial para el desarrollo

biotecnológico mundial. Por estas razones, muchos países han apoyado el establecimiento

de colecciones de cultivos que brinden servicios en su país o en la región y que desarrollen

sus propios programas de investigación (Acosta Ovallos, 2019)

Existen métodos de conservación para microorganismos y estos se agrupan

atendiendo a los factores tiempo y características fisiológicas de la cepa en tres grandes

grupos:

1. Métodos de Conservación a largo plazo

Estos métodos garantizan al máximo la estabilidad genética, al evitar la

aparición de generaciones sucesivas y por tanto son los más utilizados en

microorganismos que han sido sujetos a manipulaciones genéticas las cuales los hacen
P á g i n a 3 | 27
diferentes de las cepas de origen y permiten mediante ellas evaluar medicamentos con

alto potencial genotóxico y carcinogénico (Arencibia et al., 2014).

a) Por Congelación

La sobrevivencia de los microorganismos conservados por congelamiento puede

ser aumentada usando temperaturas inferiores a 0°C, se congelan las células en

suspensión con el uso de nitrógeno en la fase de vapor (-196°C) o en la fase líquida

(-150 a -180°C). Estas temperaturas permiten el almacenamiento por periodos

prolongados y la mayoría de bacterias pueden ser recuperadas con un 90 a100%

de sobrevivencia (Zuberer, 1987).

Se propuso la congelación con nitrógeno líquido como la técnica idónea o

alternativa para conservar por largos periodos de tiempo aquellas células que no

sobreviven al proceso de liofilización. Este es el mejor método de conservación

desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos

especiales, y además existe el peligro de que algún fallo del sistema produzca una

subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento. (Stanbury &

Whitake, 1987)

Factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por

este método son los siguientes: (Zuberer, 1987)

• Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células

maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento

• Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de

congelación bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en

general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas, tanto para

la congelación como para la descongelación, por lo que para descongelar

conviene poner las células a 37ºC.

P á g i n a 4 | 27
 • Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible, es aconsejable

que se alcance temperaturas por debajo de –70 °C, las temperaturas más bajas

favorecen la viabilidad y la estabilidad genética. Lo mejor es guardar tubos

cerrados o sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en

nitrógeno.

• Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se

pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación.

Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores,

pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración

del 15 al 20%. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche

descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En

su elección influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar.

b) Por liofilización

Es uno de los métodos más utilizados para la conservación de cepas

bacterianas. Su principio básico, consiste fundamentalmente en extraer por

sublimación, bajo condiciones de alto vacío, el agua de las células congeladas que

pasan directamente a un estado de vapor debido a que no hay presión molecular

que lo impida. Este proceso consta de tres etapas, la precongelación del producto

para asegurar una estructura completamente congelada; el secado primario con el

que se elimina la mayor parte del agua por sublimación; y el secado secundario

con el que se remueve el agua que queda ligada.

Este es un método muy recomendable por su comodidad para el

almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez que se liofilizan, los

microorganismos pueden permanecer en un lugar fresco a una temperatura que

oscile entre los 15ºC a los 25°C, esto significa guardar a las muestras liofilizadas

P á g i n a 5 | 27
a temperatura ambiente, lo que reduce en gran medida los costos energéticos que

se requieren para mantener las bajas temperaturas de un ultracongelador. (Zuberer,

1987)

El éxito de la liofilización para la preservación de los microorganismos no

sólo depende de los pasos de esta técnica (congelación y deshidratación) sino

también de las características físico-químicas del medio de suspensión, el tipo de

microorganismo, el estado fisiológico del cultivo, las condiciones del cultivo, la

concentración de los microorganismos, entre otros: (Acosta Ovallos, 2019)

• Tipo de microorganismo: Hay algunos microorganismos que no resisten la

liofilización y lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su

interior. Algunos hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no

se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos.

• Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir

por encima de –50ºC.

• Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la

concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad de agua

remanente que no es perjudicial.

• Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos

cerrados al vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún

gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede dañar a las células.

• Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante,

preferentemente a 18ºC y sin bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar

en la oscuridad.

Este método es uno de los más eficaces para la conservación de muchos

tipos de microorganismos, como: bacterias, hongos, bacteriófagos y virus;

P á g i n a 6 | 27
 algunos de ellos pueden sobrevivir por períodos de más de 40 años.30 Es

conveniente para la producción y distribución masiva de cultivos, la viabilidad,

pureza y estabilidad de los cultivos se mantenga por largos períodos de tiempo,

no se requiere de una atención constante después de almacenarse los cultivos

liofilizados y cientos de éstos pueden guardarse en un pequeño espacio. (Acosta

Ovallos, 2019)

2. Métodos de Conservación a mediano plazo:

a) Congelación Bacteriana: La congelación bacteriana es un método físico-

químico que permite conservar microorganismos viables a temperaturas entre

- 20ºC y - 80ºC por un tiempo sin sufrir cambios genotípicos (Allievi &

Salardi, 1993). En este proceso se involucra el agua como microambiente y es

ella la que cambia su estado líquido a sólido. Las bacterias inmersas en este

medio deben adaptarse a las condiciones de este nuevo ambiente, transformar

la velocidad de su metabolismo, conservar su viabilidad y evitar los daños

ocasionados por la aparición de cristales de hielo formados por el cambio de

temperatura (James, 1984)

Para su desarrollo, primero se cultiva al microorganismo en cuestión y se deja

crecer hasta la fase estacionaria temprana, las células del cultivo se lavan, con

una solución tampón y después son adicionadas con un volumen equivalente

de una suspensión que contiene una sustancia que deberá funcionar como

protectora de las células a la congelación. Esta sustancia conocida con el

nombre de crioprotector, evita la formación de cristales de hielo y el estrés

osmótico generado por la baja disponibilidad de agua, durante el proceso de

congelación (James, 1984)

P á g i n a 7 | 27
3. Métodos de Conservación a corto plazo:

Estos procedimientos son frecuentemente usados en laboratorios de primer nivel

con ceparios pequeños, donde no se cuenta con la infraestructura adecuada ni el

presupuesto para la preservación bacteriana. Ayudan al mantenimiento de las

cepas, generalmente para el uso frecuente donde se requiera la cepa activa

(Arencibia et al., 2014).

a) Subcultivos

El método comúnmente usado es el cultivo seriado o subcultivo. En éste, el

microorganismo en cuestión se siembra en su medio adecuado y una vez crecido

se guarda a 4°C, donde se mantiene unos días para su uso y se vuelve a resembrar

en un tiempo no mayor a un mes. El gran problema de este procedimiento, es

que se puede generar mutaciones por cada transferencia con pérdida de las

características del microorganismo, riesgo de contaminación y adaptaciones al

medio de cultivo, lo que termina generando cepas “domesticadas” cuyo

comportamiento ya no representa a la especie inicialmente aislada (Zuberer,

1987).

b) Conservación por suspensión en agua estéril

Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de vibilidad en

diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y

algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del

cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los

anteriormente mencionados. En este caso la concentración celular no debe ser

superior a 104 -105 células/ml en el caso de bacterias. Los resultados obtenidos

en laboratorios de microbiología en la conservación de microorganismos por este

P á g i n a 8 | 27
 método muestran altos porcentajes de viabilidad en períodos a veces superiores a

5 años (Allievi & Salardi, 1993).

c) Conservación con aceite mineral estéril

Consiste en recubrir con aceite mineral estéril un cultivo que se encuentra en

condiciones óptimas de crecimiento. Generalmente se utiliza aceite mineral de

alta calidad de grado medicinal (Allievi & Salardi, 1993)

d) Desecación en papel filtro

Es un método de conservación que reduce drásticamente el metabolismo

bacteriano. Este, implica la utilización de papel absorbente preferentemente

Whatmann número 3, que se impregna con una solución muy densa de células y

se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por

el procedimiento que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para

ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación previa de las células.38

El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que

un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición. (James, 1984).

e) Desecación con bolitas de alginato

En este procedimiento las células se encentran en una matriz de alginato la cual

se deseca mediante el tratamiento con soluciones hipertónicas y luego se hace

desecación al aire. Posteriormente, las células son conservadas en tubos estériles,

cerrados herméticamente y a una temperatura de entre 4ºC y 18ºC. Es importante

destacar que la desecación en bolitas de alginato es un procedimiento bastante

eficaz de preservación bacteriana (James, 1984).

P á g i n a 9 | 27
f) Desecación con sal gorda:

Es un método usado para halobacterias, en el cual, las células se mezclan con una

solución de sal gorda y se secan aprovechando la higroscopicidad de la sal. En

este protocolo, la desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse

por el nivel insuficiente de agua disponible en el medio, aunque pueden contener

un poco de sustrato e incluso humedad. Aun así, el tiempo en que las bacterias se

mantienen es un periodo corto, no superior a los 6 meses (Arencibia et al., 2014).

g) Conservación en suelo estéril

Este método consiste en esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio

absorbente para una pequeña cantidad de inóculo. Debido a que sus nutrientes y

humedad son reducidos considerablemente, limitando no solo el metabolismo

bacteriano si no también su periodo de vida, este siempre se ha tomado como

última opción en la conservación de microorganismos. En general los métodos de

preservación a corto plazo poseen alto riesgo de contaminación celular debido a

que los microorganismos están expuestos a condiciones ambientales normales.

(Stanbury & Whitake, 1987). En el caso específico de la desecación, las células

sufren estrés por oxidación y pérdida de agua razón por la que el número de células

viables disminuye notablemente, especialmente para microorganismos sensibles

(Arencibia et al., 2014).

2. 2. PRINCIPIOS

1. Pureza del cultivo: Es fundamental asegurarse de que el cultivo esté compuesto

únicamente por el microorganismo de interés y esté libre de contaminantes. Se

deben utilizar técnicas de aislamiento y siembra en medios selectivos para obtener

cultivos puros.

P á g i n a 10 | 27
2. Mantenimiento de la viabilidad: El objetivo principal de estos métodos es

preservar la viabilidad de los microorganismos. Esto implica asegurarse de que

los microorganismos conservados sigan siendo viables y capaces de crecer y

reproducirse después de la conservación.

3. Reducción del metabolismo: La mayoría de los métodos de conservación

implican reducir o detener el metabolismo de los microorganismos. Esto se logra

mediante la aplicación de condiciones ambientales desfavorables, como bajas

temperaturas, deshidratación o la adición de agentes conservantes, para minimizar

el consumo de nutrientes y la actividad metabólica.

4. Minimización del daño celular: Durante los procesos de conservación y

preparación del inóculo, se debe minimizar el daño celular para mantener la

integridad y funcionalidad de los microorganismos. Esto implica utilizar técnicas

suaves y controladas para evitar daños en la estructura y las funciones celulares.

5. Conservación de la diversidad genética: Los métodos de conservación deben

permitir la conservación de la diversidad genética de los microorganismos. Esto

se logra conservando tanto la variabilidad genética intrapoblacional como

interpopulacional, lo que es esencial para la conservación de características

importantes y la adaptabilidad de los microorganismos.

6. Facilidad de recuperación: Un principio importante en la conservación de

microorganismos es asegurar la facilidad y eficacia de la recuperación de los

cultivos conservados. Los métodos deben permitir una rápida y exitosa

recuperación de los microorganismos para su posterior uso en investigaciones,

aplicaciones industriales o cualquier otra aplicación relevante.

(García, M. & Uruburu, F., 2017)

P á g i n a 11 | 27
Estos principios son fundamentales para garantizar la conservación exitosa de los

microorganismos y la preparación adecuada del inóculo para su uso posterior.

2. 3. CARACTERÍSTICAS

Las características para conservar un microorganismo pueden variar dependiendo

del tipo de microorganismo y del propósito de la conservación. Aquí hay algunas

características comunes a considerar al conservar un microorganismo:

1. Criopreservación:

▪ Permite la conservación a largo plazo de microorganismos.

▪ Mantiene la viabilidad y la integridad genética de los

microorganismos.

▪ Requiere equipos especializados, como tanques de nitrógeno

líquido, para almacenar los microorganismos a temperaturas muy

bajas.

▪ Es adecuada para una amplia gama de microorganismos,

incluyendo bacterias, hongos y levaduras.

2. Liofilización:

▪ Proporciona una conservación estable a largo plazo.

▪ Permite una fácil manipulación y transporte de los

microorganismos conservados debido a su forma deshidratada y

liviana.

▪ Los microorganismos liofilizados pueden recuperarse rápidamente

mediante rehidratación.

▪ Es útil para microorganismos que son sensibles al congelamiento

o que tienen una alta tasa de supervivencia después de la

rehidratación.

P á g i n a 12 | 27
3. Conservación en medio de cultivo:

▪ Es un método sencillo y de bajo costo.

▪ Los microorganismos se mantienen en su medio de cultivo natural,

lo que facilita su crecimiento y mantenimiento.

▪ Requiere la transferencia periódica de los microorganismos a

nuevos medios de cultivo para evitar la contaminación y el

agotamiento de nutrientes.

▪ Es adecuado para microorganismos que pueden crecer y sobrevivir

en medios de cultivo específicos.

4. Conservación en agar inclinado:

▪ Proporciona una mayor superficie de crecimiento para los

microorganismos.

▪ Permite una fácil transferencia y mantenimiento de las cepas

conservadas.

▪ Los microorganismos en agar inclinado pueden ser almacenados a

temperatura ambiente.

▪ Es conveniente para la conservación a corto plazo y para la

distribución de cepas a otros laboratorios.

5. Conservación en glicerol o glicerina:

▪ Protege a los microorganismos durante la congelación mediante su

acción crioprotectora.

▪ Es una técnica simple y efectiva para la conservación a largo plazo.

▪ Los microorganismos se pueden almacenar en congeladores

domésticos a -80°C.

6. Es adecuada para microorganismos sensibles a la congelación directa.

P á g i n a 13 | 27
 Cada método de conservación de microorganismos tiene sus propias ventajas y

limitaciones, y la elección del método adecuado depende de factores como el tipo de

microorganismo, los recursos disponibles y los objetivos de conservación a largo plazo o

distribución a corto plazo. (Castro G, 2000)

Los métodos de preparación de inóculos dentro de la industria

A continuación, se detallan las características principales de la preparación de

inóculos:

1. Viabilidad: Los inóculos deben contener microorganismos vivos y en estado

activo. La viabilidad de los microorganismos es esencial para que puedan llevar a

cabo las funciones deseadas, como la fermentación, la degradación de compuestos

o la promoción del crecimiento vegetal.

2. Concentración: Los inóculos deben tener una concentración adecuada de

microorganismos para garantizar una respuesta efectiva en la aplicación. La

concentración puede variar dependiendo de la aplicación y la especie de

microorganismos utilizada.

3. Pureza: Los inóculos deben estar libres de contaminantes y otros

microorganismos indeseables. Esto asegura que los microorganismos deseados

sean los dominantes en la aplicación y evita problemas de competencia o

alteración de los resultados esperados.

4. Estabilidad: Los inóculos deben ser estables durante su almacenamiento y

transporte. La estabilidad se refiere a la capacidad de los microorganismos de

mantener su viabilidad y actividad durante un período de tiempo determinado,

asegurando su efectividad en la aplicación.

5. Compatibilidad: Los inóculos deben ser compatibles con el medio ambiente o el

sistema en el que se van a aplicar. Esto implica que los microorganismos deben

P á g i n a 14 | 27
 ser capaces de sobrevivir y funcionar adecuadamente en las condiciones

ambientales presentes en la aplicación, como pH, temperatura, humedad, entre

otros factores.

6. Calidad y trazabilidad: Los inóculos deben cumplir con estándares de calidad

establecidos y ser trazables desde su preparación hasta su aplicación. Esto implica

seguir buenas prácticas de fabricación, realizar controles de calidad y mantener

registros adecuados de la preparación y el uso de los inóculos.

7. Aplicabilidad: Los inóculos deben ser aplicables a la situación específica para la

cual se han diseñado. Esto implica que los microorganismos utilizados en el

inóculo deben tener las características y capacidades necesarias para cumplir con

los objetivos deseados en la aplicación, ya sea en la producción de alimentos, la

biorremediación, la agricultura, la medicina u otras áreas.

(Koshy, 2018)

P á g i n a 15 | 27
2. 4. APLICACIONES

2.4.1.1. Conservación a largo plazo: Los microorganismos pueden

conservarse durante períodos prolongados utilizando métodos de

conservación como la crio-preservación. Este proceso implica la

congelación de los microorganismos a temperaturas muy bajas,

generalmente en nitrógeno líquido, lo que permite su almacenamiento

durante años. Estos cultivos congelados pueden utilizarse para futuros

estudios, investigación o producción de productos biotecnológicos

(Mártinez, 2012).

2.4.1.2. Distribución y transporte: Los métodos de conservación de

microorganismos permiten su distribución y transporte a diferentes

laboratorios o instalaciones de producción. Los microorganismos

conservados pueden enviarse en forma de cultivos líquidos, cultivos en

agar inclinado o en forma de liofilizados (desecados). Esto facilita el

intercambio de microorganismos entre instituciones y colaboradores, y

garantiza que los cultivos lleguen en condiciones viables

(Uruburu, 2007).

2.4.1.3. Estudios microbiológicos: Los métodos de conservación y

preparación del inóculo son esenciales para llevar a cabo estudios

microbiológicos. Los cultivos conservados pueden utilizarse para

investigar la patogenicidad de microorganismos, realizar pruebas de

sensibilidad a antimicrobianos, estudiar la fisiología y el metabolismo de

los microorganismos, o realizar estudios de secuenciación genómica,

entre otros (Hernández, 2011).

P á g i n a 16 | 27
 2.4.1.4. Producción de biotecnología: Los microorganismos se utilizan

ampliamente en la producción de productos biotecnológicos, como en la

fermentación industrial. Los métodos de conservación y preparación del

inóculo son esenciales para mantener y propagar cepas específicas

utilizadas en la producción de productos farmacéuticos, enzimas,

productos alimenticios fermentados y otros productos biotecnológicos.

2.4.1.5. Control de calidad: Los microorganismos conservados se

utilizan en laboratorios de control de calidad para verificar y calibrar los

métodos de prueba utilizados. Estos cultivos se pueden utilizar para

asegurar la precisión y la validez de las pruebas microbiológicas, como

las pruebas de esterilidad, las pruebas de recuento de microorganismos y

las pruebas de identificación.

III. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO

MATERIALES

• MEDIO DE CULTIVO EN LIQUIDO

1. Medios de cultivo: Los medios de cultivo líquidos son el principal

componente necesario. Puedes adquirir medios comerciales específicos para

el tipo de microorganismo que deseas cultivar o preparar tus propios medios

utilizando ingredientes como agua destilada, nutrientes, sales y azúcares.

2. Matraces o recipientes de cultivo: Se utilizan para contener el medio de

cultivo líquido y permitir el crecimiento del microorganismo. Puedes utilizar

matraces de vidrio, frascos de cultivo o recipientes de plástico estériles,

dependiendo de tus necesidades.

P á g i n a 17 | 27
 3. Pipetas y puntas de pipeta estériles: Son esenciales para transferir pequeñas

cantidades de cultivo inicial al medio de cultivo líquido. Las pipetas

desechables de plástico estéril y las puntas de pipeta son preferibles para

mantener la asepsia.

4. Bunsen o mechero de alcohol: Estos dispositivos se utilizan para esterilizar

las puntas de las pipetas y otros instrumentos de laboratorio, calentándolos y

eliminando posibles contaminantes.

5. Incubadora: Es un equipo utilizado para mantener una temperatura constante

y controlada durante la incubación del cultivo. Puedes ajustar la temperatura

según los requisitos del microorganismo que estás cultivando.

6. Agitador magnético o agitador orbital: Estos dispositivos se utilizan para

agitar suavemente el cultivo líquido durante la incubación, asegurando una

distribución uniforme de los microorganismos y nutrientes.

7. Autoclave o esterilizador de alta presión: Si deseas esterilizar tus medios de

cultivo o equipos de laboratorio, puedes utilizar un autoclave para someterlos

a altas temperaturas y presiones, eliminando cualquier microorganismo no

deseado.

8. Equipo de seguridad: Para garantizar la seguridad, es importante contar con

guantes estériles, batas de laboratorio, gafas protectoras y mascarillas,

especialmente cuando se trabaja con microorganismos patógenos o

potencialmente peligrosos.

• MEDIO DE CULTIVO EN SOLIDO

1. Medios de cultivo sólidos: Pueden ser agar nutritivo, agar Sabouraud,

agar sangre, agar MacConkey, entre otros. Estos medios contienen

P á g i n a 18 | 27
 nutrientes y agentes solidificantes, como el agar, para proporcionar una

superficie sólida para el crecimiento de los microorganismos.

2. Matraces o placas de Petri: Utilizados para contener el medio de cultivo

sólido. Los matraces son recipientes de vidrio estériles con tapa, mientras

que las placas de Petri son recipientes de plástico estériles con tapa.

3. Espátulas o asas de inoculación: Instrumentos utilizados para transferir

los microorganismos al medio sólido. Pueden ser de metal o de plástico, y

deben esterilizarse antes de su uso.

4. Mechero Bunsen o mechero de alcohol: Utilizados para esterilizar las

espátulas o asas de inoculación calentándolas a alta temperatura y

eliminando posibles contaminantes.

5. Autoclave o esterilizador de alta presión: Empleados para esterilizar los

medios de cultivo sólidos antes de su uso, mediante altas temperaturas y

presiones, eliminando microorganismos no deseados.

6. Incubadora: Equipamiento utilizado para mantener una temperatura

constante y controlada durante la incubación del cultivo en medio sólido.

Se ajusta la temperatura según los requisitos del microorganismo.

7. Equipo de seguridad: Incluye guantes estériles, batas de laboratorio,

gafas protectoras y mascarillas para garantizar la seguridad al trabajar con

microorganismos patógenos o potencialmente peligrosos.

• MEDIO DE CULTIVO EN SEMISOLIDO

1. Agar: El agar es un polisacárido derivado de las algas marinas y se utiliza

para solidificar los medios de cultivo. En el caso de los inoculantes

semisólidos, se agrega agar en una concentración menor que la utilizada

P á g i n a 19 | 27
 en los medios sólidos, lo que da como resultado una consistencia

gelatinosa.

2. Frascos de cultivo: Los frascos de cultivo se utilizan para preparar y

contener los inoculantes semisólidos. Estos frascos pueden ser frascos de

vidrio o plástico y deben ser esterilizados antes de su uso.

3. Pipetas o asas de siembra: Las pipetas o asas de siembra estériles se

utilizan para transferir los microorganismos al medio de cultivo. Estas

herramientas aseguran una transferencia precisa y libre de contaminación.

4. Autoclave: El autoclave es un equipo utilizado para esterilizar los medios

de cultivo, el agua y los instrumentos de laboratorio. Aplica calor y presión

para eliminar cualquier microorganismo presente y prevenir la

contaminación del inoculante.

5. Medios selectivos o enriquecidos: Dependiendo del tipo de

microorganismo que se desee cultivar, se pueden agregar medios

selectivos o enriquecidos al medio de cultivo semisólido para favorecer el

crecimiento de ciertos microorganismos y evitar el crecimiento de otros.

PROCEDIMIENTO

Preparación de Inoculo en liquido

1. Preparación del medio de cultivo líquido: Prepara el medio de cultivo líquido

según las instrucciones específicas o utilizando una fórmula apropiada. Asegúrate

de esterilizar el medio correctamente antes de su uso.

2. Preparación del inóculo inicial: Transfiere una pequeña cantidad de cultivo inicial

estéril, como una colonia de bacterias o una suspensión de células, a una pipeta

estéril.

P á g i n a 20 | 27
3. Inoculación del medio de cultivo líquido: Con la pipeta estéril, añade suavemente

el inóculo inicial al medio de cultivo líquido. La cantidad de inóculo puede variar

según el microorganismo y los requisitos experimentales.

4. Mezcla y dispersión del inóculo: Agita suavemente el medio de cultivo líquido

para asegurar una dispersión uniforme del inóculo en todo el medio. Puedes

utilizar un agitador magnético o agitador orbital a una velocidad adecuada para

promover una buena mezcla.

5. Incubación: Coloca el recipiente con el medio de cultivo líquido inoculado en una

incubadora o en condiciones adecuadas para el crecimiento del microorganismo.

Ajusta la temperatura y otros parámetros según las necesidades del

microorganismo.

6. Monitoreo del crecimiento: Durante el período de incubación, monitorea el

crecimiento del microorganismo a través de observación visual, toma de muestras

periódicas o mediante técnicas analíticas, según los objetivos experimentales.

7. Análisis: Los inóculos en medio líquido son fáciles de manipular y transferir a

otros recipientes o medios de cultivo. Pueden ser utilizados para realizar

diluciones seriadas, ensayos de sensibilidad a antibióticos, transferencias a otros

medios de cultivo o para preparar muestras para análisis posteriores. Además.

Preparación de Inoculo en solido

1. Preparación del medio de cultivo sólido: Prepara el medio de cultivo sólido

adecuado según las instrucciones específicas o utilizando una fórmula apropiada.

Agrega los ingredientes necesarios y sigue los pasos de esterilización adecuados,

como la autoclavación, para garantizar la esterilidad del medio.

P á g i n a 21 | 27
2. Preparación del inóculo inicial: Transfiere una pequeña cantidad de cultivo inicial

estéril, como una colonia bacteriana o una suspensión de células, a una espátula o

asa de inoculación estéril.

3. Inoculación del medio de cultivo sólido: Toma la espátula o asa de inoculación

estéril con el inóculo y realiza trazos en la superficie del medio de cultivo sólido.

Puedes realizar trazos en forma de "X" o sembrar de manera uniforme según tus

necesidades experimentales.

4. Incubación: Coloca las placas de Petri o recipientes con el medio de cultivo

inoculado en una incubadora o en condiciones adecuadas para el crecimiento del

microorganismo. Ajusta la temperatura y otros parámetros según las necesidades

del microorganismo.

5. Monitoreo del crecimiento: Durante el período de incubación, monitorea el

crecimiento del microorganismo en el medio sólido. Observa la formación de

colonias, cambios en el color o textura, y toma notas de los resultados obtenidos.

6. Análisis: La preparación de inóculos en medio sólido permite estudiar las

características de crecimiento de los microorganismos además el medio sólido

proporciona un entorno adecuado para el estudio de interacciones microbianas,

como la competencia, la cooperación o la inhibición entre diferentes especies de

microorganismos. Al sembrar diferentes cepas en un mismo medio sólido, se

pueden observar las interacciones que ocurren entre ellas, como la formación de

halos de inhibición, la formación de biofilms o la aparición de sinergias.

Preparación de Inoculo en semisólido

1. Preparación del medio de cultivo:

a. Pesar los ingredientes necesarios según la receta del medio de

cultivo semisólido.
P á g i n a 22 | 27
 b. Disolver los ingredientes en agua estéril calentando y agitando la

mezcla hasta su completa disolución.

c. Ajustar el pH del medio si es necesario.

d. Agregar agar en una concentración menor a la utilizada en los

medios sólidos (generalmente alrededor de 0.5-1%).

e. Mezclar bien para asegurar una distribución uniforme del agar.

f. Distribuir el medio de cultivo en frascos de cultivo estériles,

dejando suficiente espacio en la parte superior para permitir la

solidificación.

2. Esterilización del medio de cultivo:

a. Colocar los frascos de cultivo en un autoclave y asegurarse de que

estén correctamente sellados.

b. Programar el autoclave para la esterilización a la temperatura y

presión adecuadas (generalmente 121°C a 15 psi) durante el tiempo

recomendado para el medio de cultivo en cuestión.

c. Iniciar el ciclo de esterilización y asegurarse de que se complete

correctamente.

3. Inoculación del medio de cultivo semisólido:

a. Preparar los cultivos puros de los microorganismos que se desean

multiplicar y transferir.

b. Utilizar pipetas o asas de siembra estériles para transferir una

pequeña cantidad de cultivo puro al centro de cada frasco de

cultivo estéril.

c. Asegurarse de que la inoculación sea aséptica y evitar la

contaminación cruzada entre frascos.

P á g i n a 23 | 27
 d. Repetir el proceso de inoculación para cada frasco de cultivo.

4. Incubación del inoculante semisólido:

a. Dejar los frascos de cultivo con el medio inoculado en posición

vertical hasta que el medio se solidifique por completo.

b. Colocar los frascos en una incubadora a la temperatura y

condiciones adecuadas para el crecimiento del microorganismo en

cuestión.

c. Incubar durante el tiempo necesario para permitir que los

microorganismos se multipliquen y desarrollen en el medio

semisólido.

5. Análisis:

Los inoculantes semisólidos pueden ser utilizados como medios de

transporte y almacenamiento de microorganismos. Al solidificar, el medio

actúa como una matriz protectora que permite la supervivencia y

viabilidad de los microorganismos durante períodos de tiempo

prolongados. Además, se dice que los inoculantes semisólidos son

fundamentales en investigaciones científicas para estudiar la ecología

microbiana, el comportamiento de microorganismos en condiciones

específicas y realizar pruebas de sensibilidad a antimicrobianos.

Proporcionan un ambiente controlado y reproducible para el crecimiento

y análisis de los microorganismos.

IV. DISCUSIÓN

• El cultivo en medio líquido permite el estudio de la cinética de crecimiento de los

microorganismos. Se pueden medir parámetros como la velocidad de crecimiento,

la fase de crecimiento logarítmico, la fase estacionaria y la fase de declinación.

P á g i n a 24 | 27
 Estos datos son importantes para comprender el comportamiento de los

microorganismos y para optimizar procesos biotecnológicos.

• Al sembrar un inóculo en medio sólido, se pueden observar y analizar las

características de las colonias bacterianas o fúngicas, como su tamaño, forma,

color, textura y patrones de crecimiento. Estas características pueden proporcionar

información importante para la identificación y el estudio de los microorganismos.

• Todos los métodos de preservación tienen ventajas y desventajas por tanto es

necesario hacer una selección del método a utilizar haciendo un análisis de las

características de cada técnica, factibilidad de su uso y las necesidades del usuario.

V. CONCLUSIONES

• La conservación de microorganismos busca mantener las cepas viables y estables

a largo plazo, evitando su contaminación y pérdida de pureza. Esto se logra

mediante técnicas de conservación como la criopreservación, la liofilización o la

conservación en medios de cultivo especiales. Estos métodos permiten almacenar

las cepas en condiciones óptimas para su posterior recuperación y utilización.

• La preparación del inóculo implica el cultivo y multiplicación de los

microorganismos en condiciones controladas. Esto se lleva a cabo para obtener

una población activa y suficiente para su uso en diferentes aplicaciones. Durante

este proceso, se deben establecer las condiciones adecuadas de crecimiento y

garantizar la homogeneidad y reproducibilidad del inóculo.

• Los métodos de conservación y preparación del inóculo son fundamentales para

mantener la diversidad genética y la funcionalidad de los microorganismos,

asegurando su utilidad en diferentes campos como la medicina, la agricultura, la

biotecnología y la investigación científica. Estos métodos contribuyen a la

P á g i n a 25 | 27
 preservación de valiosos recursos biológicos y facilitan el acceso a cepas de

interés para el avance científico y tecnológico.

VI. RECOMENDACIONES:

• Seleccionar el método de conservación adecuado: Es importante seleccionar el

método más adecuado según las características del microorganismo y los recursos

disponibles. Se debe considerar factores como la viabilidad a largo plazo, la

facilidad de recuperación y la estabilidad genética al elegir un método de

conservación.

• Establecer condiciones óptimas de cultivo: Durante la preparación del inóculo, es

esencial proporcionar las condiciones de cultivo óptimas para el crecimiento y

multiplicación de los microorganismos. Esto incluye la temperatura adecuada, el

pH, la concentración de nutrientes y la disponibilidad de oxígeno.

• Utilizar técnicas asépticas: Para evitar la contaminación y la pérdida de pureza de

los microorganismos.

• Controles de calidad periódicos: Para asegurar la viabilidad y la estabilidad de los

microorganismos conservados, es recomendable realizar controles de calidad

periódicos. Esto puede incluir pruebas de viabilidad, evaluación de la integridad

genética, y verificación de las propiedades fenotípicas de las cepas conservadas.

REFERENCIAS

Allievi, L., & Salardi, C. (1993). Frozen storage (-20ºC and -80ºC) of soybean

Bradyrhizobium cell suspension.Microb. 16: 196-08.

Castro G, H. J. (2000). Manual sobre conservación de microorganismos. Mexico:

Insistituto Politécnico Nacional. Escuela nacional de Ciencias Biologicas.

P á g i n a 26 | 27
García, M. & Uruburu, F. (2017). Conservación de cepas microbianas-principios.

Valencia: Universidad de Valencia. Obtenido de

https://www.uv.es/cect2/87_Conservacion_cepas_microbianas

Hernández. (Mayo de 2011). Obtenido de

https://repositorio.utp.edu.co/server/api/core/bitstreams/b5ba3fac-1181-4b60-

bb0f-045c6cf44b54/content

James, E. (1984). Maintenance of parasitic protozoa by cryopreservation. A manual of

laboratory methods. Academic press. London. p.161-176.

Koshy, P. &. (2018). Inoculum preparation and its importance in fermentation

technology. Enzyme and Microbial Technology.

Mártinez. (Abril de 2012). Obtenido de

https://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1665-

27382012000100005

MDM científica. (2019). Los medios de cultivo para microbiología más usados. Obtenido

de https://mdmcientifica.com/medios-cultivo-microbiologia-mas-

usados/#:~:text=Entre%20las%20caracter%C3%ADsticas%20o%20condiciones

,mide%20la%20acidez%20o%20alcalinidad.

Stanbury, P., & Whitake, A. (1987). Obtenido de Principles of fermentation technology.

Pergamon Press, New.

Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introducción a la microbiologia. España:

Editorial panamericana.

Uruburu. (Junio de 2007). Obtenido de

https://www.uv.es/cect2/87_Conservacion_cepas_microbianas

P á g i n a 27 | 27