CRIOPRESERVACIN DE EMBRIONES Equipo 6 por: Asbel, Isaac,

BOVINOS Obed.
 QU ES LA CRIOPRESERVACIN?
Es el proceso en el cual clulas, tejidos, rganos o individuos completos son congelados a
muy bajas temperaturas, generalmente entre -80C y -196C (el punto de ebullicin del
nitrgeno lquido) para disminuir las funciones vitales de una clula o un organismo y
poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo.
 QU PASA A BAJAS TEMPERATURAS?
A esas temperaturas, cualquier actividad biolgica, incluidas las reacciones bioqumicas que
produciran la muerte de una clula, quedan efectivamente detenidas.
 QU SE USA PARA LOGRARLO?
Cmara de congelacin:

Como su nombre lo indica es la unidad que permite congelar o "criopreservar" la muestra

biolgica por largo tiempo, preservando al mismo tiempo su viabilidad. Un sistema
controlado por computadora controla el grado de congelacin del vapor del nitrgeno para
evitar el deterioro de la clula por fenmenos osmticos o por la cristalizacin del agua.
 Unidad de almacenamiento

Es en donde se almacena la muestra despus de que esta ha alcanzado la temperatura

deseada. Ya en esta unidad a la muestra se le colocan gradillas adecuadas al volumen y al
tipo de muestra.
La criopreservacin es til para las tcnicas de reproduccin asistida, a las cuales acuden
parejas con problemas de fertilidad. As se congela el semen del donante, con el fin de
realizar varios intentos de fecundacin del vulo en el momento ms adecuado.
CRIOPRESERVACIN EN BOVINOS
 EN CASO PARTICULAR DE BOVINOS
Los embriones que son recolectados y transferidos mediante mtodos no quirrgicos
la ventajas que brinda la criopreservacin se ven reflejadas en:

1)Durante la ejecucin del programa de transferencia

2)En mucha mayor magnitud, en comercio nacional e internacional

Progreso gentico a bajo costo

Se puede controlar enfermedades
TCNICAS DE CRIOPRESERVACIN
La refrigeracin, mtodo simple por el cual se
mantienen embriones a temperaturas entre 0C y
Las tcnicas de 4C durante 24 a 72 hrs.
criopreservacin La conservacin a -196C permite mantener embriones por
permiten conservar periodos extensos .Leibo (1989)
embriones por
distintos periodos
dependiendo de la
temperatura que se Exposicin de los embriones a concentraciones molares de agentes crio protectores.
utilicen. Enfriamiento desde temperaturas fisiolgicas hasta temperaturas lo suficientemente
bajas como para causar un virtual cese de todas las reacciones qumicas inducidas
trmicamente.
Calentamiento desde la temperatura de conservacin a temperaturas fisiolgicas.
Extraccin del crioprotector.
 REFRIGERACIN
Transferencia en Conservados a
Refrigerados
fresco -196C

Es una tcnica que permite el desarrollo y viabilidad de los embriones mediante

un simple refrigerador con hielo y agua para regular el descenso de temperatura.

Suero fetal

Buffer fosfato
PBSS
PUNTOS A TRATAR
Los embriones son cargados en pajuelas de 0.25 ml y colocados en el refrigerador
hasta el momento de realizar la trasferencia. Si bien el almacenaje de los embriones
se realiza en poco tiempo, un fenmeno comnmente observado es el colapso de los
blastocitos, el cual puede ser revertido luego de un breve periodo de tiempo.

La tcnica se usa para transportar embriones cuando las receptoras se encuentran

distantes de los donadores

Y tambin para conservar embriones hasta que las receptoras asincrnicas alcancen la
sincronizacin adecuada

Esta tcnica ha logrado tener porcentajes entre 44% y 50%

Ya casi no se usa, por la congelacin convencional

 CONGELACIN CONVENCIONAL
El proceso de congelacin podra resumirse mencionando que a medida que una
solucin acuosa se enfra por debajo de 0 C disminuye el movimiento molecular,
sobreenfrindose hasta alcanzar una masa crtica de ncleos, momento en el cual se
libera el calor latente de cambio de estado.

Los embriones son congelados y descongelados rpidamente

Se deshidratan antes de la congelacin a fin de evitar la

formacin de cristales

Se incorpora un agente crioprotector (bajo peso molecular) al medio

de congelacin.

Glicerol Propilenglicol Distintos azucares

Dimetilsulfoxido
Etilenglicol
Las soluciones de congelacin pueden enfriarse por debajo de su punto de congelacin, al llegar a los -10c se forma hielo
y de manera espontanea se produce un aumento brusco de temperatura denominado calor latente de fusin

Para evitar este fenmeno perjudicial para los embriones se induce a la formacin de hielo en el medio extracelular, a
esto se le denomina seeding, entre los -4C a -7C tocando el envase de los embriones con una pinza enfriada
previamente a -196C

La temperatura a la que se detiene la congelacin lenta y a la que los embriones son inmersos en el nitrgeno
liquido, cuando se le detiene en -30 o -40C es posible realizar la descongelacin de manera rpida,
sumergiendo los embriones en bao maria a 20-37C durante 20 o 30 segundos, si el enfriamiento lento se
extiende hasta -70C, la congelacin debe efectuarse lentamente.

Debe ser retirado el crioprotector para evitar

el shock osmtico, empleando sucrosa que
actua como contrafuerza osmtica.
PARMETROS
El resultado de congelacin esta condicionado por la calidad del embrin, por el
tiempo que transcurre desde la recoleccin hasta que comienza la congelacin y por
el estado de desarrollo embrionario.
Por su parte los porcentajes de preez resultantes de la transferencia de embriones congelados as
como el desarrollo embrionario in vitro post descongelacin son inversamente proporcionales al
tiempo transcurrido desde la recoleccin gasta el comienzo de la congelacin.
La viabilidad embrionaria disminuye significativamente cuando dicho periodo es mayor a 3h lo cual se
correlaciona con los porcentajes de preez, del mismo modo la tasa de desarrollo in vitro pos
descongelacin disminuye del 86 al 54%, y el porcentaje de embriones que hace un pequeo orificio
en la zona pelucida, proceso conocido como Hatching, pasa del 64 al 34% cuando los embriones
superan un tiempo de 12 hrs entre su recoleccin y criopreservacin
METODO ESTANDAR
WILMUT Y ROWSON (1973)
Incorporacin de 1.5M de Retiro de los embriones del
DMSO a temperatura nitrgeno liquido y De -10C descongelado
ambiente en PBSS en colocacin en un bao a rpido a temperatura
cuatro etapas (0.25, 0.5, -100C hasta -10C a ambiente en un bao a
1, 1.5M por 5, 5, 10, 20 20C
min) razn de 10C/min

Retiro del DMSO a

Enfriado de embriones
(1C/min) hasta -7C
Introduccin de los temperatura ambiente en
embriones en nitrgeno seis etapas (1.5, 1.25, 1,
liquido a -196C 0.75, 0.5, 0.25M por 5,
10, 10, 10, 10min)y
colocar en PBS

Induccin de la congelacin Congelacin hasta -65C a Evaluacin de la viabilidad

a -7C mediante un cristal razn de 0.3C/min y de cultivando los embriones
de hielo -65C hasta -120C a 24h en PBS a 38C
razn de 1C/min
 METODO ESTANDAR
MODIFICACIONES

1.5M DMSO por 1.4M de Glicerol (Bouyssou y Chupin 1988)

Comparacin de la adicin del Glicerol con una y dos etapas de 5min c/u obteniendo como
resultado que dos etapas de 5min con glicerol puede ser execiva (Martinez y Col. 2002)
Los embriones sobreviven aun cuando la congelacin lenta se detiene a -30 o -40C, se
sumergen en nitrgeno liquido y luego se descongelan de manera rpida colocndolos en un
bao maria a 25C por 20min (Willadsen 1977)
Los embriones pueden ser colocados en el equipo de congelacin directamente a la
temperatura que se induce la cristalizacin (Bouyssou y Chupin 1982, Scheinder y Mazur
1984)
La aucrosa puede ser utilizada para retirar el crioprotector de los embriones (Leibo y Mazur
1978)
METODO ESTANDAR

Porcentajes de prees 10% inferior a lo que generalmente se logra con ola

transferencia de embriones sin criopreservar.
METODO DE ONE STEP
LEIBO 1982 Y RENARD 1982

El embrin es acondicionado en el
segmento medio de la pajuela, separados
por burbujas de aire de los extremos que
contienen sucrosa en concentracin isomolar
con la del medio de congelacin
Para la descongelacin, las soluciones se
mesclan agitando la pajuela permitiendo
que las soluciones se mexclen
METODO DE ONE STEP

El mtodo de one step presenta una gran ventaja practica, dado de posibilita transferir embriones
congelados a campo de manera similar a lo que ocurre con la IA.
Por otro lado los porcentajes de prees tienen una gran variabilidad.
METODO DE TRANSFERENCIA DIRECTA
METODO DE TRANSFERENCIA DIRECTA
DOS VARIANTES

Massip y El embrin es expuesto a una

solucin de glicerol y sucrosa
Col 1987 previo a la congelacin.

Voelkel y Se reemplaza glicerol por

etilenglicol
Ho 1992
METODO DE TRANSFERENCIA DIRECTA

El mtodo de transferencia directa en el que se utiliza EG ha dado resultados satisfactorios.

CONGELACION DE EMBRIONES SOMETIDOS A
MICROMANIPULACION

Los porcentajes de prees obtenidos luego de la transferencia de los embriones

manipulados no supera el 30%.
 VITRIFICACIN
Proceso termodinmico mediante el cual un
fluido incrementa su viscosidad durante el
enfriamiento, adquiriendo las habilidades
de un slido
2500/

Soluciones altamente
concentradas de uno o
mas crioprotectores
permeables
CONGELACIN ULTRARRPIDA
 CONCLUSIONES
La congelacin convencional resulta una tcnica para la criopreservacin de
embriones. Ha alcanzado gran aplicacin prctica, a partir del empleo del mtodo
de transferencia directa donde se utiliza etilenglicol como crioprotector.
La vitrificacin y la congelacin ultrarrpida de embriones aparecen como opciones
mas simples y econmicas que la congelacin convencional, no obstante para que
tenga aplicacin practica ser necesario superar los fenmenos de embriotoxicidad
que generalmente provocan.
En las distintas tcnicas de crioperservacin se observan diferencias de viabilidad
de acuerdo al estadio de los embriones y al mtodo utilizado, por lo tanto; resulta
de inters realizar estudios tendientes a encontrar las condiciones optimas para
cada situacin.
Teniendo en cuenta la evolucin de la biotecnologa de la reproduccin, en
investigaciones futuras deber presentarse especial atencin en resolver los
problemas que se presentan actualmente con la crioperservacin de embriones
producidos in vitro o sometidos a micromanipulacin.