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LIOFILIZACIN

CONSERVACIN Y CONTROL DE CEPAS


MICROBIANAS
Coleccin de Cultivo y servicio que ofrece
Qu son las Colecciones de Cultivo?

- Son organizaciones que principalmente se ocupan de
guardar
convenientemente cepas de microrganismos, clulas
superiores o diversos materiales biolgicos y los
suministran, previa peticin, a laboratorios microbiolgicos
o de biologa celular.
- Son por lo tanto servicios de apoyo a los trabajos de
microbiologa
Cundo aparecieron las primeras colecciones de cultivo?
-Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catlogo
-La ms antigua Lobaina (Belgica) (Hongos)
-La ATCC,en 1925.No vinculos directos con la Universidad,es de
carcter comercial (Manassas,USA).
-La CECT,nace en el CSIC(Villanueva)(1960).
-PRCC ,Profesor J.L.Ramos (Pseudomonas putida)
A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion internacional
denominada World Federation for Culture Collection (WFCC).
En Europa a su vez estan agrupadas en la European Culture Colletion
Organization (ECCO) que se fund en 1982.
Servicios que prestan las Colecciones de Cultivos
1.-Recoleccin,conservacin y suministro de cepas microbianas.

-Recoleccin: Es el servicio mas tpico de una CC.Las
colecciones reunen cepas que les llegan a traves de distintos
conductos,las conservan convenientemente y las suministra
previa peticin.
-Conservacin:
-Suministro: Se hace por correo de superficie,areo o mensa-
jera,pero siempre empaquetado correctamente (tres envueltas)
siempre hay que considerarlo como material potencialmente
patgeno

2.-Recopilacin de datos de las cepas microbianas y difusi de los
mismos
Fichas,ordenadores,redes electronicas,public.de catlogos
3.-Servicio de guardera de las cepas microbianas
Se pueden guardar por encargo cepas microbianas,cobrando
una tasa anual y manteniendo el secreto de este depsito.

4.-I dentificaciones microbianas.
5.-Depsito de cepas microbianas.

-Depsito pblico: Cualquier microbilogo puede depositar
una cepa, que considere interesante,en la coleccin. Esta cepa se
incorpora en el catlogo y puede suministrarsela a cualquier otro
microbilogo que la solicite.

-Depsito no pblico:Algunas CC reciben el nombramiento
de Autoridad Internacional de Depsito para fines de patentes,de esta
manera se garantiza la descripcin total y reproduccin del proceso
patentado. Una vez conseguida la patente,la cepa puede suministrarse
previa autorizacin escrita del propietario,aunque no figure en el
catlogo.
6.-Organizacin de Cursos
7.-I nvestigacin.
8.-Asesoramiento en general
Normas generales para la conservacin de
cepas microbianas
Los tres objetivos para una correcta conservacin:

1.-Mantenimiento en Cultivo puro.(PUREZA)
2.-Que este viva.(VI ABI LI DAD)
3.-La cepa debe guardarse geneticamente estable(ESTABI LI DAD)
Lapage en 1977 deca que:

a) Un cultivo inicial de una especie es una poblacin
b) Un subcultivo es una poblacin diferente derivada de este
cultivo inicial.
c) Una cepa es una sucecin de subcultivos del cultivo inicial
los datos del cultivo inicial seran los mismos en la cepa?

NO necesariamente porque se producen cambios en los subcultivos

Los mtodos en la conservacin de las cepas microbianas tienen
Como objeto fundamental minimizar estos cambios
LA CONSERVACIN DE CEPAS
MICROBIANAS
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua
de mar esteril







Mtodos Restringidos
Desecacin en papel de filtro
Desecacin en suelos,arena silicagel,etc
Desecacin en bolitas de alginato
Desecacin en sal gorda para halobacterias
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar esteril







CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS POR
CONGELACIN
La crioconservacin consiste en la conservacin de los
microorganismos a temperaturas inferiores a cero grados centgrados.
Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin
del agua disponible.

Objetivos de la crioconservacin
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento
-El estado fisiolgico de la clula
- Mantenimiento de la estabilidad
- Mantenimiento de la pureza
BACTERIA
H
2
O
H
2
O
H
2
O
H
2
O
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
AGENTES CRIOPROTECTORES
OBJETIVOS
Minimizar daos
durante la
congelaci.
Limitar la formacin
de hielo (tasa de
congelacin)
Vitrificacin del agua
CARACTERISTICAS
No txico para la
clula.
Penetrar facilmente
en la menbrana
celular.
Unirse a los
electrolitos o a las
molculas de agua.
CRIOPROTECTORES MS COMUNES
Glicerol
Dimetilfulfxido (DMSO)
cido glutmico
Glucosa
Sacarosa
Meso inositol
Lactosa
Leche Descremada
La crioconservacin consiste en la conservacin de los
microorganismos a temper.inferiores a cero grados centgrados. Se
basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin
del agua disponible.

Objetivos de la crioconservacin
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento (-70,-139)
-El estado fisiolgico de la clula (Final f.logartmica)
- Mantenimiento de la estabilidad
- Mantenimiento de la pureza
Conservacin de microorganismos por
congelacin
La crioconservacin consiste en la conservacin de los
microorganismos a temper.inferiores a cero grados centgrados. Se
basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin
del agua disponible.

Objetivos de la crioconservacin
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento
-El estado fisiolgico de la clula
- Mantenimiento de la estabilidad (fenotpica y genotpica)
- Mantenimiento de la pureza (Hacer alcuotas)
Conservacin de microorganismos por
congelacin
CONCLUSIONES
Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de
la fase logartmica, a la temperatura ptima, en el
medio ms adecuado.
Ajustar el n de clulas a una concentracin final de 2-
6x10
6
cl/ml. Aadir los crioprotectores adecuados a
una concentracin ptima.
Repartir la suspensin en ampollas de
congelacin,cerrarlas hermeticamente y mantenerlas
30 minutos a 30.
Disminuir la t lo mas rpido posible.
A la hora de recuperar los microorganismos,
descongelar rpidamente, sumergiendo las ampollas
con el cultivo congelado en un bao a 37-40C.
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar esteril







FUNDAMENTOS TERICOS DE LA CONSERVACIN
DE MICROORGANISMOS POR LIOFILIZACIN
Liofilizacin
Es un mtodo de conservacin a largo plazo.
Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por
falta de agua:congelacin y sublimacin
PROCESO
Congelar el
agua libre de
las clulas
Eliminacin del agua
Agua congelada Vapor de agua
Sublimacin
1 Fase de la
Desecacin
2 Fase de la
Desecacin
TIPOS DE LIOFILIZADORES
Liofilizador con
centrifugacin
Se utilizan ampollas de
vidrio taponadas
La suspensin se
centrifuga durante la 1
fase de la desecacin
Se estrechan las ampollas
y,despus de conectarlas
a una bomba de
vaco,se sellan.
Ventajas:Se utiliza la centrifugacin
para que el proceso de
congelacin sea suave y de forma
homognea

Liofilizador con estantes
La suspensin se prepara
en viales y,es
precongelada a T muy
bajas antes de aplicar el
vaco.
La segunda etapa de la
desecacin se realiza
tambin en el liofilizador.
Ventajas:La Desecacin
es de manera
progresiva y
continuada
CUNDO APLICAR LA LIOFILIZACIN?
Es un mtodo ampliamente utilizado para conservar distintos
Microorganismos.
SI NO
-Bacterias,Levaduras,
Hongos,Algunos virus,Algas
-Dificultad de un crecimiento
Adecuado.
-Microorganismos delicados
que no resisten el paso de
congelacin.
-A tamaos de clulas mayores,
menos efectivo es el proceso
Protozoos,Clulas animales,
Clulas vegetales,Arqueobac-
terias y bacterias delicadas
Ejemplos:Rhodospirillum,
,Azospirillum,vibrio y dems
bacterias marinas.
-Levaduras miceladas con difi-
cultad en la esporulacin.
-Hongos con grandes conidios o
con dificultad en la esporulacin.
FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN
POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN
Condiciones de Cultivo
El medio de cultivo
Depender del tipo de microorganismo y sus
requerimientos nutricionales.
Fase de crecimiento del cultivo.
F.exponencial. Suspenciones celulares de 10
8
-10
9
Clulas/ml en bacterias, algo inferiores en
hongos y levaduras.
Condiciones de incubacin.
T,aerobiosis, anaerobiosis, etc.
FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN
POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN
Preparacin de las clulas para su conservacin
- Composicin del medio de la suspensin y adecuada densidad ptica
El medio de la suspensin deber proteger la viabilidad de las clulas.
Usar el crioprotector adecuado en cada caso.
Glucosa 7,5% para Anaerobios
Glucosa 15% para Levaduras.
Glutmico 0,67M para Bacterias Lcticas.
Inositol 5% para Bacterias.
Leche descremada para Levaduras, Hongos y Actinomicetos.

- Tipos de ampollas,tubos y viales para la liofilizacin.
Dependern del equipo del que se disponga o del tipo de muestra a
liofilizar.
Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o borosilicato, porque por
su elevada resistencia ofrecern muchas dificultad en su apertura.
FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN
POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN
-Temperatura durante la sublimacin.
Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C.

-Grado de deshidratacin alcanzado.
Lo ms alto posible.

-Atmsfera de oxgeno en el tubo.
Las clulas liofilizadas se guardan en tubos al vaco para evitar
Rehidratacin o presencia de gases (como el oxgeno) que pueden
daar las clulas.

-Condiciones de almacenamiento.
La temperatura debe ser constante a 18C y sin bajar de los 0C
y, en oscuridad
LIOFILIZACIN
VENTAJAS

-Reduccin de la
variabilidad del
microorganismo.
-Largo tiempo de
conservacin.
-Aplicabilidad para la
produccin y
distribucin de los lotes

DESVENTAJAS

-El alto coste inicial del
equipo.
-La preparacin de
forma incorrecta de los
distintos lotes puede
desembocar en un
estancamiento de la
viabilidad y/o en
prdidas en la
estabilidad de los
caracteres de los
microorganismos
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar esteril







CONSERVACIN POR TRANSFERENCIA
PERIDICA
Es un mtodo en el que los organismos
permanecen activos durante el proceso.
Consiste en la inoculacin de
microorganismos en un medio de cultivo
adecuado,la incubain a una T adecuada
para obtener crecimiento y finalmente el
almacenamiento bajo unas condiciones
adecuadas. El proceso es repetido a
intervalos que garanticen la obtencin de
un cultivo fresco antes de la prdida del
viejo.
PARA UNA BUENA RESIEMBRA
PERIDICA
Medio de cultivo.
Temperatura, tiempo y condiciones de
incubacin.
Intervalo entre dos resiembras
Reduccin de la temperatura de
almacenamiento.
Medios no enriquecidos,con limitacin de
nutrientes.
Restriccin de la accesibilidad de aire del cultivo.
La conservacin de cepas
microbianas
Mtodo de eleccin o de conservacin a largo
plazo
Conservacin por congelacin
Conservacin por liofilizacin

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica
Conservacin por suspensin en agua destilada o en
agua de mar esteril







CONSERVACIN POR SUSPENSIN EN
AGUA DESTILADA O EN AGUA DE MAR
ESTRIL
Es un mtodo alternativo muy usado y que da altos porcentajes
de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos
filamentosos como en levaduras y algunas bacterias. Consiste en
Suspender en agua esteril unas cuantas clulas del cultivo que se
quiere conservar. Para los hongos filamentosos que no esporulan,
se puede poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del
Hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se
hace en agua de mar diluida.
LA CONSERVACIN DE CEPAS
MICROBIANAS
Mtodos Restringidos
Desecacin en papel de filtro
Desecacin en suelos,arena silicagel,etc
Desecacin en bolitas de alginato
Desecacin en sal gorda para halobacterias